Изучение Митохондриальная Структура и функции в Drosophila Яичники

Краткое содержание

Анализ взаимосвязи структуры и функции митохондрий необходим для полного понимания регуляторных механизмов митохондриальной функциональности. В данной работе описаны и продемонстрированы специфические методы изучения структуры и функции митохондрий в живых и фиксированных яичниках дрозофилы.

Аннотация

Анализ взаимосвязи структуры и функции митохондрий необходим для полного понимания регуляторных механизмов митохондриальной функциональности. Флуоресцентная микроскопия является незаменимым инструментом для непосредственной оценки структуры и функции митохондрий в живых клетках, а также для изучения взаимосвязи между митохондриальной структурой и функцией, которая в первую очередь модулируется молекулами, управляющими событиями деления и слияния между митохондриями. В данной работе описаны и продемонстрированы конкретные методы изучения структуры и функции митохондрий как в живых, так и в неподвижных тканях модельного организма Drosophila melanogaster. Предпочтительной тканью здесь является яичник дрозофилы, который можно выделить и сделать пригодным для конфокальной микроскопии ex vivo в реальном времени. Кроме того, в статье описывается, как генетически манипулировать митохондриальным белком деления, Drp1, в яичниках дрозофилы для изучения участия митохондриального деления, вызванного Drp1, в модуляции отношения структуры и функции митохондрий. Широкое использование таких методов демонстрируется как в уже опубликованных, так и в новых данных. Описанные методы могут быть расширены для понимания прямого влияния питательных веществ и/или факторов роста на свойства митохондрий ex vivo. Учитывая, что митохондриальная дисрегуляция лежит в основе этиологии различных заболеваний, ожидается, что описанные инновационные методы, разработанные в генетически управляемом модельном организме дрозофилы, внесут значительный вклад в понимание механистических деталей взаимосвязи структуры и функции митохондрий и в разработку терапевтических стратегий, направленных на митохондрии.

Введение

Митохондрии классически описывается как клеточном электростанцией, так как они являются основными мест производства энергии в дифференцированных клетках. Кроме того, митохондрии играют критическую роль в обмене веществ, выработки тепла, липидного модификации, кальция и окислительно - восстановительного гомеостаза, оркестровка клеточных процессов передачи сигналов, и т.д. ^1. Митохондрии также играют активную роль в индукции клеточной смерти ^2, а также в регуляции клеточного цикла ^3. Такая многофункциональность поднимает следующие основные вопросы: а) как митохондрии выполняют все эти функции одновременно и б) существуют специфические митохондриальные бассейны или подзоны, которые являются специализированными для различных функций? В этом контексте важно отметить, что многофункциональный митохондрии динамичны в их форме, размеру и структуре в пределах отдельных клеток, и что установившийся форма митохондрий может варьировать между типами клеток. Десятилетия исследований из различных лабораторныхоратории предположить , что изменение митохондриальной формы, размера и структуры, в совокупности называемых митохондриальных динамики, имеет решающее значение для поддержания различных митохондриальных функций _^4,5,6. Эти данные указывают на возможность того, что митохондрии могут выполнить свою многофункциональность в силу своей структурной динамики.

Обширные предпринимаются усилия, чтобы понять структурно-функциональные отношения митохондриальную. Динамизм митохондриальной структуры, прежде всего, поддерживается их способность делению и слитые события друг с другом. Деление больших митохондрий превращает их в более мелкие митохондриальных элементов, в то время как слияние между двумя меньшими митохондриях сливает их в больший митохондриальной элемент ^7. Кроме того, переходный процесс слияния двух митохондрий может произойти, чтобы позволить смешивание их содержимого. Деление и слитые события внутренней и внешней мембраны митохондрий тщательно регулируются спецификацииIFIC наборы белков. Механизм ядра деления состоит из динамин связанных с белком 1 (drp1), который набраны из цитоплазмы в митохондрии путем его взаимодействия с определенными добросовестные митохондриальных белков (например, Fis1 или Mff1), в то время как функция drp1 также может регулироваться другие белки на поверхности митохондриальной ^4. Хотя drp1 работает на внешней мембране, его возможности деления влияют на внутреннюю мембрану, а также. Оркестровка деления наружных и внутренних мембран митохондрий не очень хорошо понял. С другой стороны, слияние внутренней мембраны регулируется в активную зону деятельности OPA1, в то время как mitofusins регулируют слияние наружной мембраны ^5. Баланс противодействующих деления и слияния событий митохондрий диктуют стационарную митохондриальную форму в клетке. Например, подавление митохондриального деления приведет к полной и беспрепятственной слияния, в то время как чрезмерной активности митохондрийл деление приведет к фрагментации митохондрий ^3.

Изучение структурно-функциональных отношений митохондриальной главным образом состоит из двух взаимодополняющих подходов: а) анализ клеточных и организменном фенотипов после генетической манипуляции митохондриальных деления / слитых белков и б) прямые оценки митохондриальной структуры и функции. Следует отметить, что генетические анализы не всегда могут выявить прямую функциональность молекулы в стороны (в данном случае, митохондриальные деления / слитых белков), как фенотипы могут возникать из-за вторичных эффектов. Поэтому крайне важно развивать и использовать инструменты для изучения митохондриальной структуры и функции непосредственно. Любая оценка митохондриальной структуры включает в себя различные инструменты микроскопии. Использование флуоресцентной микроскопии живых клеток значительно продвинулся вперед исследования митохондриальных динамики, так как митохондриальная динамизм можно контролировать как качественно, так и quantitatраторов , используя соответствующие инструменты и методы ⁸ флуоресцентной микроскопии. Флуоресцентные инструменты микроскопии на основе были разработаны для изучения митохондриальной структуры и функции в живых и фиксированных тканей MELANOGASTER дрозофилы, выяснении значение митохондриального динамизм в естественных условиях ^9. Эти и другие методы описаны здесь, с целью изучения митохондриальной структуры и функции в яичниках дрозофилы.

Яичник Drosophila состоит из зародышевых и соматических родах, которые вытекают из их соответствующих взрослых стволовых клеток , которые находятся в гермарии ^10,11. Шестнадцать синцитиальный зародышевые клетки (GCS) получают инкапсулированные соматическими клетками фолликула (FCS) с образованием отдельных яйцевых камер , которые возникают из гермарии (рисунок 1). Один из 16-ти ШС получить стремится стать ооцитов, а остальные 15 ШС перерасти в трофоцитов, которые поддерживают рост ооцитов камеры, Способствуя созреванию яйцеклетки до ее укладки. Большинство ЯК претерпевают 9 раундов митотических делений прежде, чем они выходят из митотического клеточного цикла, чтобы неизлечимо дифференцироваться в узорной эпителиального клеточного слоя, состоящего из переднего фолликулярных клеток (AFCS), задней фолликул клеток (ПФУ), а также основных клеток тела (MBCS) , Последовательные камеры яичные соединены стебле клетками, которые дифференцируются клетки, которые также полученные из ЯК на ранних стадиях развития. Митохондриальная форма регулируется митохондриального белка деления drp1 активно участвует в процессе дифференциации в ходе нормального развития Drosophila яичников FC слоя ^9,12. Методы , используемые в этих исследованиях для определения участия drp1 в развитии фолликул клеточного слоя Drosophila описаны здесь.

Протокол

1. Подготовка дрозофилы (инструменты , необходимые изображены на рисунке 2А)

1. Для любого из описанных экспериментов, собирают дрозофилы (выдерживают при комнатной температуре или 25 ° С ) в течение 5 дней с момента вылупления и поместите их в пробирку , заполненную 5 - 7 мл дрозофилы пищи (см Материалы таблицу), не более чем 25 мух в каждом флаконе; поддерживать женщины: мужчины соотношении 2: 1.
2. Насыпьте небольшое количество гранулированных дрожжей , чтобы стимулировать производство яиц дрозофилы. Выполнить экспериментальные манипуляции в течение 2 - 4 дней.

2. Препарирование дрозофилы яичников (инструменты , необходимые изображены на рисунке 2А)

1. Средний Теплый насекомых рассечения (см Материалы таблицу) до комнатной температуры, 25 ° C. Заполните три скважины из восьми скважин стекла рассекает блюдо с 200 мкл среды в каждую лунку.
2. Обезболить дрозофилы с СО _{2 путем размещения иглы дутьевой пистолета под флакона пробкой. Поместите их на лету площадку. Использование рассекает микроскоп, рассортируйте 5 самок и поместить их в первую лунку рассекает блюдо. Ручка один дрозофилы в то время , при выполнении живой микроскопии.}
3. В то время как, глядя через окуляр микроскопа рассечение, разъединить грудную клетку от брюшной полости с помощью двух пар щипцов. С помощью пинцета, тщательно передачи брюшком на вторую лунку блюдо.
4. Используйте одну пару щипцов, чтобы держать живот на заднем конце, и медленно толкать яичники из (наряду с другими брюшных содержимым) с другой парой щипцов. Если эта попытка не увенчается успехом, осторожно удалите брюшной экзоскелет путем введения щипцов в переднем конце, чтобы освободить яичники.
5. С помощью щипцов, провести индивидуальную яичник к концу непрозрачной задней (то есть яйца желток заполненные, на поздней стадии) и переместить его тщательно в третью лунку блюдодля дразнить, чтобы обработать его для живой микроскопии (шаг 3) или для фиксации для выполнения иммунное окрашивание (этап 7).
6. Осторожно дразнить защитную оболочку из вокруг яичников, сдвигая дразнящий иглу слегка от заднего к переднему концу каждого яичника, удерживая его на заднем конце с парой щипцов.
   Примечание: Для того, чтобы свести к минимуму повреждения во время дразнить, согните кончик иглы и увеличить на каждом яичнике за счет увеличения коэффициента увеличения микроскопа (рис 2А). Теребят должно быть достаточно, чтобы разорвать оболочку эффективным, но оно также должно быть тщательно сделано, чтобы сохранить целостность овариол.

3. Подготовка к микроскопией Live-ткани

Примечание: Инструменты , необходимые изображены на рисунке 2А.

1. Перед Drosophila рассечения, подготовить polyL-лизином камеры с покрытием. Для этого поместите два 20-мкл капли polyL-Лизин (0,1 мг / мл) на coverglзад (14 мм, № 0) из стеклянным дном чашки Петри (35 мм) на достаточном расстоянии друг от друга, чтобы предотвратить слияние капель. Высушите пластин в течение 1 ч при 37 ° С и обозначая края белой polyL-Лизин пленку на нижней стороне пластины с стираемым маркером.
   Примечание: The polyL-Лизин покрытием камеры можно хранить при температуре 4 ° С в течение недели. При использовании камеры предварительно покрытую, довести его до комнатной температуры перед началом рассечение дрозофилы.
2. Установите параметры сканирования на конфокальной микроскопии, чтобы убедиться, что образец могут быть отображены сразу после завершения вскрытия и монтажа, как показано ниже.
3. Поместите один расчлененный и дразнили яичник (следующий шаг 2 и окрашивают, в случае необходимости, после шага 5) на отмеченной области polyL-Лизин покрытием и распространение яичник с дразнящей иглой, чтобы отделить овариол. Поместите 10 мкл каплю насекомых рассечения среды на верхней части яичника, убедившись в том, чтобы покрыть тон весь polyL-Лизин покрытием области. Накройте чашку Петри.
4. Сразу же выполнить конфокальной микроскопии смонтированного образца при комнатной температуре.
   Примечание: Только один дрозофилы должен быть расчленена, обработаны и отображены одновременно. Кроме того , микроскопия не следует проводить при температуре 37 ° С, которая будет имитировать ударную среду тепла для Drosophila ткани.

4. Флуоресцентная Потеря В фотообесцвечивания (FLIP) Анализ для оценки митохондриях непрерывности

Примечание: непрерывность митохондриях в расплавленных митохондриальной структуры устанавливается после полного слияния митохондриальных внутренних и внешних мембран после прогрессии через промежуточные этапы. Деление митохондрий может выполнить те же действия , но в обратном направлении (рис 3А). FLIP является покадровой микроскопии на основе полуколичественный метод, который может быть использован для оценки непрерывности митохондриального матрикса вОкончательное расплавленное состояние экс виво митохондрий (шаги 3 и 4 на рисунке 3А) в живых Drosophila яичников ^9. Анализ САЛЬТО выполняется в небольшой области интереса (ROI) митохондрий , экспрессирующих флуоресцентный молекулу в митохондриальный матрикс , который photobleached через равные промежутки времени (САЛЬТО ROI на рисунке 3 , а ). В результате, любая окружающая митохондриальная область , которая является непрерывной с FLIP ROI (экспериментальный ROI на рисунке 3А) потеряет сигнал в связи с обменом молекул в непрерывном митохондриях. Эксперименты FLIP продемонстрированные здесь выполняются на трансгенной Drosophila экспрессирующих mitoYFP, который содержит митохондриальную последовательность таргетирование человека цитохромоксидазы VIII субъединицей маркированного с YFP целевой его в митохондриях в свободно диффундирующего форме. Аналогичный эксперимент может быть также выполнена с мито pUASP-мито-GFP трансгена, как сообщалось ранее ^{9. Аналогичный протокол FLIP может быть использован с зондом , ориентированным на митохондриальный межмембранное пространство , чтобы иметь возможность обнаружить преемственность в результате слияния внешний , но не внутренней митохондриальной мембраны (шаг 2 на рисунке 3 , а ).}

1. Открытое программное обеспечение захвата изображений на конфокальной микроскопии и установить соответствующие параметры сканирования на вкладке "Приобретение" (таблица 1). Проверьте "серии Time", "Отбеливание" и "Регионы" коробки, чтобы открыть отдельные вкладки. Помещенный соответствующие значения параметров приобретения в каждой вкладке (таблица 1).
   Примечание: обскура следует оставить открытым, поскольку этот эксперимент предназначен для мониторинга общий сигнал от всей митохондриальной популяции в отдельных клетках.
2. Используйте окуляр, чтобы быстро найти поле интереса в смонтированном живой ткани.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите овариол, которые хорошо распространяются на стеклянном-bottomed блюдо, так как конфокальной микроскопии не может быть выполнена на плавающих овариол.
3. Нажмите кнопку "вживую", чтобы получить живое изображение выбранного поля интересов. Нажмите кнопку "Стоп", чтобы остановить живой процесс сканирования.
4. При необходимости отрегулировать параметры сбора данных таким образом, что обнаруженный флуоресцентный сигнал находится ниже уровня насыщения (указывает отсутствие красных пикселей при включенной опции "Индикатор диапазона" установлен), с определенным фоном, как установлено путем корректировки значения смещения.
5. Нарисуйте небольшой ROI, используя инструмент для рисования Безье на вкладке "Регионы" разграничить фотообесцвечивание зону на изображение, полученное с помощью живого сканирования.
   Примечание: Размер ROI должен быть около 20 - 50% от общего флуоресцентного митохондриального сигнала внутри клетки.
6. Выполните сканирование изображения, нажав на "начать эксперимент."
7. Количественно интенсивность флуоресценции с помощью собственного или программного обеспечения с открытым исходным кодом (см МатериалыТаблица). Запишите средний сигнал от ROI, где целевой повторяющийся отбеливания (FLIP); трансформирования, где отбеливание не была выполнена в той же клетке (экспериментальная); КОРОЛЬ из другого небеленой ячейки в том же поле зрения, для оценки общего отбеливания в течение экспериментального периода (отбеливающая); и ROI на область фона (Background). Вычесть средний фоновый сигнал, полученный от среднего сигнала в другой трансформирования. Осуществить нормировку флуоресцентного сигнала с начальным сигналом предварительно отбеливатель для соответствующей ячейке.
8. Участок нормированных данных с помощью любого стандартного программного обеспечения для построения графиков.

5. Живой Окрашивание с флуоресцентных митохондриальной Красители

Примечание: Стационарное митохондриальная структура и потенциал может быть оценена с помощью красителей , которые специфически включают в митохондрии в живых клетках и тканях. Живые яичниках дрозофилы могут быть окрашены ех естественных условиях с люминесцентным митохондриальнойпятна визуализировать митохондрии, для оценки митохондриальных активных форм кислорода (мито-РОС) производства, а также для оценки потенциала митохондрий на единицу массы. Это может быть достигнуто совместным окрашиванием с митохондриальной потенциометрического тетраметилродамин краситель этилового эфира (TMRE) и совместимым живой митохондриальной пятно , представляющего митохондриальной массы (см материалы таблица для специфических красителей).

1. Развести запас пятен в теплой насекомых рассекающих среды до конечной рабочей концентрации: митохондриальной пятно, 250 нм; TMRE, 50 нМ; и мито-РОС пятно, 5 мкМ.
2. После рассечения и дразня яичники следующие стадии 2, поместите яичники в 200 мкл любого конкретного окрашивающего раствора в лунку рассечение блюдо. Выдержите их в течение 10 мин с блюдом, покрытой подходящей коробке, обернутой алюминиевой фольгой для защиты от света. Вымойте окрашивали яичники, перемещая их тщательно с щипцами в 3-х последовательных скважин containinг среда без пятен.
3. Для совместного окрашивания с TMRE и совместимым общей митохондриальной пятна, следовать выше протокол к окрашиванию сначала с TMRE, а затем сразу же с общей митохондриальной пятна (без каких-либо стадий промывки между ними).
4. Установите на яичники со стеклянным дном блюдо следующим шагом 3 polyL-Лизин покрытием и подготовиться к конфокальной микроскопии с соответствующими параметрами сканирования (таблица 1), следующие шаги 4.2-4.4.
   Примечание: Сигнал от инкорпорированных красителей не последний при попытке монтирования окрашенных образцов в монтажной среды.
5. Установите флажок Z-секционирования, чтобы открыть вкладку. Поверните колесо фокусировки по направлению к нижней части образца во время его живого отсканированы и нажмите на кнопку "установить первый", чтобы определить самую нижнюю Z-секцию. То же самое, перемещая колесо фокусировки в сторону в другом направлении, чтобы определить самую верхнюю секцию.
6. Выполните сканирование изображения, нажав на "начать эксперимент."
7. Количественная фон скорректированной интенсивности флуоресценции от трансформирования для фонового сигнала и отдельных ячеек (как в шаге 4.7) и построить данные с помощью любого программного обеспечения, построения графиков.

6. Генерация drp1 Null мозаик

Примечание: Клональная стратегия , используемая здесь , представляет зеленый флуоресцентный белок (GFP) -отрицательное нулевые клоны drp1 в фоне GFP-положительных, фенотипически дикого типа фона , который является генотипически гетерозиготными по drp1 нулевой мутации ^9. Теплового шока индуцированных флиппазы-флиппазы распознавание цели (FLP-FRT) -опосредованного сайт-специфической рекомбинации митотического создает гомозиготные клоны функционально нулевой drpKG03815 аллеля. Генотип дрозофилы , несущий drp1 мутант drpKG03815 FRT40A / CYO, в то время как генотип , несущего теплового шока-индуцированной ФЛП (hsFLP) и UbiGFP клоновая маркер hsflp; убиквитин NLS-GFP (UbiGFP) FRT 40A / CYO. Генотип себебранной потомство креста между выше генотипов hsFLP / +; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.

1. Синхронизировать дрозофилы для девственной коллекции, перемещая их в новые флаконы свежей пищи каждые 2 до 3 дней. Мониторинг pupariating ампул ежедневно для того, чтобы собрать новые девственные самок.
2. Собирают с красными глазами, вьющимися крыла девственных самок из мутантного генотипа drp1 каждый день, один раз утром и один раз вечером, и поместить их в отдельный флакон. Параллельно с этим , собирают мужской дрозофилы с темно - красными глазами и прямыми крыльями , несущих hsflp и UbiGFP в течение 5 дней вылупления.
3. Водрузил крест, добавив самцов к Деве самок с женщиной: мужской соотношении 2: 1.
4. Насыпьте небольшое количество гранулированных дрожжей, чтобы стимулировать производство яиц.
   Примечание: Осторожно переместите дрозофилы в свежую ампулу среды каждые 2 до 3 дней , чтобы увеличить количество потомству и уменьшить флакон скученности.
5. esthetize, сортировать и собирать прямо с крыльями, с красными глазами женское потомство в течение 5 дней вылупления.
6. Для теплового шока, поместите собранный дрозофилы в пустые флаконы с небольшим количеством гранулированных дрожжей и небольшой, мягкий протирать (впитывать влагу во время теплового шока). Помещают пробирку с дрозофилы на водяной бане при 38 ° С в течение 1 ч, чтобы генерировать в основном фолликул клеточных клонов, а при 37 ° С в течение 1 ч дважды в день ( что позволяет по меньшей мере , 5 ч между 2 тепловых шоков) в течение 2 дней подряд , чтобы генерировать как зародышевой линии и фолликул клеточных клонов.
   Примечание: Убедитесь , что флакон полностью погружен в воду до уровня пробки.
7. Тепловой удар может сделать неподвижности дрозофилы. Дайте тепловому шоку дрозофила для восстановления в течение 1 ч при комнатной температуре , когда они становятся подвижными снова.
8. Добавьте мужчин обратно к самкам в той же пропорции, как и в кресте, и переместить их в свежих флаконах с mediuм посыпают небольшим количеством гранулированных дрожжей. Поддерживать дрозофилы в течение не менее 5 дней.
9. Рассеките яичники по мере необходимости для живого или фиксированного эксперимента.
   Примечание: В яичниках , выделенные из родительского Drosophila , выражающей UbiGFP следует использовать в качестве отрицательного контроля для подтверждения эффективной индукции GFP-отрицательных клонов теплового шока.

7. Со-иммунным для циклин Е и митохондриях

Примечание: Для обнаружения Drosophila циклин E (dCyclinE), мы использовали коммерчески полученного антитела поднятый непосредственно против dCyclinE ⁹ (см Материалы таблицу). В качестве митохондриального маркера, мы использовали антитела против АТФ-B (субъединицу митохондриальной АТФ - синтазы комплекс) ^9.

1. Теплый 4% параформальдегидом (ПФА) до комнатной температуры, 25 ° С. Внимание! Параформальдегид является токсичным.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После открытияампула, ПФА следует хранить при температуре 4 ° С и использовать в течение 7 дней. Это происходит потому, что хранение PFA может позволить окисление с образованием метанола, который бы резко изменить митохондриальные мембраны во время фиксации, даже если они присутствуют в следовых количествах.
2. Сразу после вскрытия, фиксируют расчлененный яичники, помещая их в 200 мкл свежей PFA в лунку стекла рассекает блюдо (без насмешек). Держите блюдо в вытяжном шкафу в течение 15 мин. Промыть фиксированные яичники, перемещая их тщательно с помощью пинцета в 3-х последовательных лунок, каждая из которых содержит 200 мкл 1х фосфатно-солевым буферным раствором (PBS).
   Примечание: Эксперимент можно остановить здесь и образцы могут быть оставлены при температуре 4 ° С в течение 1 дня.
3. Дразнить яичники более подробно в PBS (аналогично шагу 2.6), чтобы тщательно удалить защитную фиброзной оболочки, которые могут препятствовать доступу антигена с антителом.
4. Проницаемыми дразнили яичники, помещая их в пробирке 500 мкл свежеприготовленных 0.5% PBS-Triton-X100 (PBS-TX) и инкубировать ее в течение 30 мин при встряхивании при 25 оборотах в минуту.
   Примечание: Во время укачивания, поместите трубы параллельно качалки движения; размещая их перпендикулярно может позволить ткани прилипать к крышке трубок, что приводит к потере тканей.
5. Для того, чтобы удалить PBS-TX, поместите микроцентрифуге трубки в стойку, чтобы позволить ткани осесть на дне пробирки. Осмотрите их визуально и нажмите трубы, если это необходимо, чтобы привести любые плавающие ткани вниз к основанию. Аспирируйте раствор осторожно сверху, убедившись, что ткани в нижней части трубок остается нетронутой.
6. Блок яичники путем добавления 200 мкл 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА), растворенное в 0,5% PBS-TX, и инкубировать ее на качалке при комнатной температуре в течение 1 ч. Удалите блокирующий агент, следуя шаг 7.5.
7. Добавить первичных антител в 200 мкл свежего блокирующего агента: анти-кроличий dCyclinE антителом (1: 100) и анти-мышь АТФ-B антитела(1: 100). Инкубируйте тканей на качалке в течение 2 ч при комнатной температуре.
8. Вымойте яичники с PBS-TX 3 раза в течение 15 мин каждый раз, после шага 7.5.
9. Добавить 200 мкл соответствующих вторичных антител в свежем PBS-TX: анти-мыши-Cy3 (1: 1000) и анти-кролик-Cy5 (1: 500). Инкубируют на качалке в течение 1 ч при комнатной температуре.
10. Вымойте яичники с PBS-TX 3 раза в течение 15 мин каждый раз, после шага 7.5.
11. Для того, чтобы окрасить ДНК, добавьте Hoechst (1: 1000 разбавления) до конечной промывки PBS-TX.
12. И, наконец, выйти из ткани в 500 мкл 1х PBS.
13. Использование 1-мл микропипетки, удалите иммуноокрашиванию яичники из пробирки в микроцентрифуге свежую лунку стекла рассекает чашку, содержащую 200 мкл PBS.
14. Добавьте одну каплю глицерина на основе монтажной среды на предметное стекло и добавьте иммуноокрашиванию яичники один за другим к монтажной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь , что яичники действительно переносится на монтажную среду. Несоблюдение этого правила SO приведет к потере тканей.
15. В то время как, глядя через рассечение микроскоп, аккуратно срывать прозрачные овариол (младшие этапы) из непрозрачных зрелых камер яиц с использованием дразнящий иглы, удерживая непрозрачную часть яичника с щипцами. Удалите зрелую яйцеклетку камеры от монтажной среды.
16. Поместите покровного стекла (22 мм, № 1) на слайде и легко нажмите, чтобы гарантировать, что гистологическая среда распределяется равномерно снизу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При нажатии на покровного стекла также обеспечивает надлежащее выравнивание ткани вдоль покровного стекла. Несоблюдение этого правила может позволить оптимально меньшие этапы, чтобы плавать в монтажном среде, предотвращая оптимальную микроскопию этих тканей.
17. Высушите образцов в течение 15 мин и запечатать края покровного стекла тщательно с лаком для ногтей.
18. Выполните конфокальной микроскопии в соответствии с экспериментальной потребности (таблица 1).

Результаты

Описанные методы могут быть использованы для изучения митохондриальной структуры и функции в живых и фиксированных яичниках дрозофилы (рис 2В). При условии, некоторые примеры ожидаемых результатов, полученных с помощью описанных методов.

Препарирование яичника дрозофилы: Когда вскрывали дальше, отрубленные животы (рис 3B) со всей дрозофилы (рис 3А)

Обсуждение

Критические шаги в рамках Протокола

Фотообесцвечивания: Предотвращение чрезмерного фотообесцвечивания флуоресцентных образцов является абсолютно необходимым для выполнения эффективной конфокальной микроскопии. Таким образом, время, используемое для обнаружения образцов через окуляр или установить параметры захвата изображений через режиме реального времени сканирования должна быть сведена к минимуму, чтобы минимизировать фотообесцвечивания.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Grace's Media (среда для препарирования насекомых)	Fisher Scientific	30611031-2
41 Параформальдегид AQ	Электронная микроскопия Sciences	50-259-99
Mitotracker Green (общее окрашивание митохондрий)	Life Technologies	m7514	Восстановление и аликвота
тетраметилродамина этилового эфира перхлората	Sigma Aldrich	87917-25MG	Восстанавливать и аликвотировать
MitoSox (краситель Mito-Ros)	Life Technologies	m36008	Восстанавливать и аликвотировать
полиЛизин	MP биомедицинские ICN15017625
флаконы	от мух Fisher Scientific	AS-515
Мухи коникулы	Fisher Scientific	AS-355
флаконы от мух	Fisher Scientific	AS273
Fly Conical Flugs	Fisher	Scientific AS 277
Jazzmix Drosophila food (Дрозофила пищевая)	Fisher Scientific	AS153
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9647-50G
Cyclin E Антитела (d-300)	Santa Cruz	sc- 33748
ATPB антитела [3D5] - Митохондриальный маркер	AbCam	ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-175-144
Hoechst	Fisher Scientific	H3570
VectaShield	Fisher Scientific	H100
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides	Fisher Scientific	22-026-252
Крышка для микроскопа Fisher	Scientific	12-542-B
Mat Tek Corp  Стеклянное дно Mircrowell Dish Fisher	Scientific	P35G-0-14-C
Активные сухие дрожжи	Fisher Scientific	ICN10140001
конфокальный микроскоп	Carl Zeiss	LSM 700
Dumont #5 щипцы	Fine Science Technologies	11251-20
Moria никелированный держатель булавки	Fine Science Technologies	26016-12
Minutien Pins	Fine Science Technologies	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	Bloomington Stock Center	7194
Fly Pad	Fly stuff	59-118
Blowgun	Fly stuff	54-104
Blowgun needle	Flystuff	54-119
Препарирующий микроскоп	Carl Zeiss	Stemi 2000
Программное обеспечение для анализов	Carl Zeiss	Zen
Программное обеспечение для анализа	открытым исходным кодом	Image J
Research Macro Zoom Микроскоп	Olympus	MVX10
QICAM Fast 1394 Охлаждаемая цифровая камера, 12-бит, Моно		QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1	QImaging