Методическая статья

Спектроскопии ядерного магнитного резонанса для идентификации нескольких фосфорилирований искробезопасных неупорядоченных белков

DOI:

10.3791/55001

⸱

27 декабря 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UMR8576, CNRS, Lille University, 2UMR-S1172, INSERM CNRS, Lille University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем здесь метод идентификации множественных фосфорилирований внутренне неупорядоченного белка с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), используя в качестве примера тау-белок. Рекомбинантный тау изотопно обогащается и модифицируется in vitro киназой перед сбором и анализом данных.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Агрегаты нейронного белка Tau находятся внутри нейронов пациентов с болезнью Альцгеймера. Развитие заболевания сопровождается повышенным, аномальным фосфорилированием тау. В ходе молекулярного исследования функций и дисфункций тау при заболевании используется спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для идентификации множественных фосфорилирований тау. Представлены подробные протоколы рекомбинантного производства тау-белка в бактериях с изотопным обогащением для ЯМР-исследований. Описаны этапы очистки, в которых используются преимущества термостабильности тау и высокой изоэлектрической точки. Протокол фосфорилирования тау in vitro рекомбинантно активированным ERK2 позволяет генерировать множественные фосфорилирования. Образец белка готов к получению данных на этапе выполнения этих этапов. Далее рассматривается настройка параметров для начала записи на спектрометре. Наконец, объясняется стратегия идентификации сайтов фосфорилирования модифицированного тау, основанная на данных ЯМР. Обсуждается преимущество этой методологии по сравнению с другими методами, используемыми для идентификации сайтов фосфорилирования, такими как иммунодетекция или масс-спектрометрия (МС).

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одной из основных проблем здравоохранения в 21 - м веке являются нейродегенеративные заболевания , такие как болезнь Альцгеймера (AD). Tau представляет собой ассоциированный с микротрубочками белок, который стимулирует образование микротрубочек (МТ). Tau в равной степени участвуют в нескольких нейродегенеративных расстройств, так называемые тауопатий, из которых наиболее известным является AD. В этих расстройств, Tau автопортреты агрегатов в спаренных спиральных нитей () и пневмо - гидравлическая система подачи обнаруживается изменение многих остатков путем посттрансляционных модификаций (PTMs) , такие как фосфорилирования 1. Фосфорилирования белка тау участвует как в регуляции его физиологической функции стабилизации МП и патологической потерей функции, характеризующей нейроны AD.

Кроме того, тау - белок, когда интегрированный в пневмо - гидравлическая система подачи в пораженных нейронов, неизменно гиперфосфорилированного 2. В отличие от обычного Tau, который содержит 2-3 фосфатные группы, то гиперфосфорилированного Tau в пневмо-гидравлическая система подачи содержит от 5 до 9 Phosphatе группы 3. Гиперфосфорилированию Tau соответствует и к увеличению по сравнению со стехиометрическим на некоторых участках и к фосфорилированию дополнительных сайтов, которые называются патологические сайты фосфорилирования. Тем не менее, существует перекрытие между БА и здоровых взрослых моделей фосфорилирования, несмотря на количественные различия в уровне 4. Как специфические события фосфорилирования влияние функции и дисфункции Tau остается в значительной степени неизвестны. Мы стремимся, чтобы расшифровать регулирование Tau с помощью PTMs на молекулярном уровне.

Для того, чтобы углубить понимание молекулярных аспектов Tau, мы должны решать технические проблемы. Во-первых, Tau является внутренне неупорядоченным белком (IDP), когда выделен в растворе. Такие белки не имеют четко определенную трехмерную структуру, в физиологических условиях и требуют особого биофизических методов для изучения их функции (ы) и структурные свойства. Tau является парадигмой для растущего класса ВПЛ, часто ассоциированы спатологии, такие как нейродегенеративные заболевания, тем самым увеличивая интерес для понимания молекулярных параметров, лежащих в основе их функций. Во-вторых, характеристика тау фосфорилирования представляет собой аналитический вызов, с 80 потенциальных сайтов фосфорилирования вдоль последовательности длинного 441 аминокислотного Tau изоформы. Ряд антител были разработаны против фосфорилированных эпитопов Tau и используются для обнаружения патологического тау в нейронах или ткани головного мозга. Фосфорилирования события могут происходить по крайней мере 20 сайтов, направленных на пролина-направленного киназ, большинство из них в непосредственной близости в пределах Proline богатых региона. Качественные (какие сайты?) И количественный (что стехиометрии?) Характеристика трудно даже самых последних методов MS 5.

ЯМР-спектроскопии может быть использован для исследования неупорядоченные белки, которые являются высоко динамические системы состоят из ансамблей конформеров. Высокое разрешение ЯМР-спектроскопии была примеред исследовать как структуру и функцию белка тау. Кроме того, сложность профиля фосфорилирования Тау привела к разработке молекулярных инструментов и новых методов анализа с помощью ЯМР для идентификации сайтов фосфорилирования 6 - 8. ЯМР в качестве аналитического метода позволяет для идентификации сайтов фосфорилирования тау в глобальной манере, визуализация всех модификаций одноузельных в одном эксперименте, и количественной оценки степени фосфатного включения. Эта точка имеет важное значение, так как хотя фосфорилирования исследования по Tau изобилуют в литературе, большинство из них были выполнены с антителами, в результате чего большая степень неопределенности в течение полного профиля фосфорилирования и, таким образом, истинное влияние отдельных событий фосфорилирования. Рекомбинантные киназ, включая ПВА, гликоген-синтазы-киназы (3 & beta Gsk3β), Циклинзависимые киназы 2 / циклин A (CDK2 / СусА), циклин-зависимая киназа 5 (CDK5) / p25 актivator белок, внеклеточный-сигнал-регулируемой киназы 2 (ERK2) и микротрубочки сродства для регулирования киназы (МАРК), которые показывают активность фосфорилирования по отношению к Tau, могут быть получены в активной форме. Кроме того, мутанты Tau, которые позволяют генерировать специфические тау-белка изоформы с хорошо охарактеризованных узорами фосфорилирования используются для расшифровки фосфорилирования код Tau. ЯМР - спектроскопия затем используется для характеристики ферментативно модифицированных образцов Tau 6 - 8. Хотя в пробирке фосфорилирование тау является более сложным , чем псевдо-фосфорилирования , например, путем мутации выбранного Ser / Thr в глутаминовой кислоты (Glu) остатков, такой подход имеет свои преимущества. Действительно, ни структурные параметры воздействия, ни взаимодействия фосфорилирования всегда может быть имитируется глутаминовой кислот. Примером может служить поворот мотив наблюдается вокруг фосфосерина 202 (pSer202) / фосфотреонина 205 (pThr205), который не воспроизводится с Glu 9 мутаций.

Здесь подготовка изотопно меченых Tau для ЯМР исследований будут описаны в первую очередь. Тау-белок фосфорилируется ERK2 модифицируется на многочисленных сайтах, описанных как патологические сайты фосфорилирования, и, таким образом, представляет собой интересную модель гиперфосфорилированного Tau. Подробный протокол Tau в пробирке фосфорилирования рекомбинантной ERK2 киназы представлена. ERK2 активируется фосфорилированием митогеном активируемой протеинкиназы / ERK киназ (МЕК) 10 - 12. В дополнение к подготовке модифицированного, меченные изотопами тау-белок, стратегия ЯМР используется для идентификации PTMs описана.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Производство 15 Н, 13 С-тау (Рисунок 1)

  1. Transform pET15b-тау рекомбинантного Т7 экспрессии плазмиды 13,14 в BL21 (DE3) компетентны кишечной палочки бактериальные клетки 15.
    Примечание: кДНК , кодирующую самого длинного (441 аминокислотных остатков) Tau изоформы клонируют между сайтами рестрикции NcoI и XhoI в плазмиду pET15b.
    1. Осторожно перемешать 50 мкл компетентного штамма BL21 (DE3), образуя 1-5 х 10 7 колоний на мкг плазмидной ДНК, 100 нг плазмидной ДНК в пластиковую пробирку на 1,5 мл.
      Примечание: кодон-оптимизированной использования бактериальные штаммы для экспрессии эукариотических кДНК не являются необходимыми для производства человеческого Tau.
    2. Поместите смесь клеток на льду в течение 30 мин и затем теплового шока на 10 сек при 42 ° С. Поместите пробирку обратно на льду в течение 5 мин и прибавляют 1 мл комнатной температуры LB (Лурия-Бертани) среде. Выдержите в бактериальной суспензии при 37 ° С в течение 30 мин при осторожномагитация.
  2. Spread используя цикл инокуляции 100 мкл клеточной суспензии равномерно на агаровой пластине среды LB, содержащей 100 мкг / мл ампициллина антибиотика.
  3. Выдержите выбор пластины в течение 15 ч при 37 ° С.
  4. Хранить селектирующей пластины при 4 ° С до тех пор, как перейти к шагу культуры, в течение не более 2 недель приблизительно.
    Примечание: глицерина запас бактериальной культуры (50% глицерина), хранили при -80 ° С, может быть готов начать культуру на более позднем этапе.
  5. Добавить 1 мл 1 М MgSO 4, 1 мл 100 мМ CaCl 2, 10 мл 100x витамин МЕМ комплемента, 1 мл 100 мг / мл ампициллина до 1 л из автоклавного солей M9 (6 г Na 2 HPO 4, 3 г KH 2 PO 4 , 0,5 г NaCl).
    Примечание: Белый осадок сформируют после добавления раствора CaCl 2 к солей M9 , которые быстро рассеивается.
  6. Солюбилизации 300 мг 15 N, 13 C-полной среды, 1 г 15Раствором NH4Cl и 2 г 13 C 6 -глюкозы в 10 мл среды М9. Фильтр-стерилизовать раствор изотопом с использованием фильтра 0,2 мкм, непосредственно в среде М9.
  7. Приостановка с использованием прививке петли одну колонию pET15b-тау трансформированных бактерий из выделенной пластины в 20 мл LB-среде, дополненной 100 мкг / мл ампициллина.
  8. Выдержите Инокулированную среду при температуре 37 ° С в течение приблизительно 6 часов.
  9. Измерьте оптическую плотность при длине волны 600 нм (OD 600) на 1 мл десятикратного разведения бактериальной культуры в полиэтиленовом спектрометре кювете.
    Примечание: Мутность бактериальной культуры , соответствующей OD 600 из 3,0-4,0 указывает на то, что фаза роста насыщение достигается.
  10. Добавьте 20 мл насыщенного культуры LB до 1 л ростовой среды М9, дополненной ампициллином (100 мкг / мл конечной концентрации), в 2 л Эрленмейера пластиковом озадачены культуральный флакон.
  11. Поместите колбу культуры в программируемый инкубатор на 10 °С и 50 оборотов в минуту. Программирование инкубатор для переключения на 200 оборотов в минуту и ​​37 ° С рано утром следующего дня.
  12. Мера OD 600 на 1 мл бактериальной культуры в полиэтиленовом спектрометре кювете. Добавить 400 мкл 1 М IPTG (изопропил -D-1-тиогалактопиранозид) маточный раствор (хранили при -20 & deg ; С) при OD 600 достигает величины около 1,0 до индукции экспрессии рекомбинантного белка Tau.
  13. Продолжить инкубации при 37 ° С в течение еще 3 ч. Собирают бактериальные клетки центрифугированием при 5000 х г в течение 20 мин.
  14. Замораживание бактериальных гранул при -20 ° С. Хранить в замороженном виде до стадии очистки, в течение длительного периода времени, если это необходимо.

2. Очистка 15 Н, 13 С-тау (рисунок 2)

  1. Автоклавы катионообменной (CEX) буферы очистки при 121 ° С при 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 20 мин. Хранить буферы при 4 ° С.
  2. Разморозить бактериальный осадок клеток и тщательно ресуспендируют в 45 млэкстракционного CEX Буфер (50 мМ Näpi буфера с рН 6,5, 1 мМ ЭДТА) свеже с добавлением ингибиторов протеаз 1х (1 таблетка) и DNAseI (2000 единиц).
  3. Разрушают бактериальные клетки с использованием гомогенизатора высокого давления при 20000 фунтов на квадратный дюйм. 3-4 пропуска необходимы. Центрифуга при 20000 х г в течение 40 мин для удаления нерастворимого материала.
  4. Нагреть экстракта бактериальной клетки в течение 15 мин при 75 ° С с использованием водяной бани.
    Примечание: белый осадок наблюдается уже через несколько минут.
  5. Центрифуга при 15000 х г в течение 20 мин и сохранить супернатант, содержащий термостойких тау-белка.
  6. Хранить при -20 ° C до следующего этапа очистки, если это необходимо.
  7. Выполнение катионообменной хроматографии на сильной CEX смолой , заполненную в колонке слоем 5 мл , с помощью быстрой жидкостной хроматографии протеинов системы (FPLC) (рисунок 3 А).
    1. Установка скорости потока 2,5 мл / мин.
    2. Равновесие колонку в CEX Буфер
    3. Загрузите 60-70 мл нагретыйэкстракт, содержащий тау с помощью пробоотборного насоса, или в качестве альтернативы насос А, в зависимости от системы. Соберите проточного для анализа, чтобы убедиться, что тау-белок эффективно связывания со смолой (см 2.8).
    4. Промыть смолу с CEX Буфер до оптической плотности при 280 нм возвращается к исходному значению.
    5. Элюировать тау из колонки, используя трехступенчатую NaCl градиент, полученный путем постепенного увеличения CEX буфера В (CEX буфер с 1 М NaCl). Программа ЖЭХБ следующим образом: первый шаг градиента до 25% буфера CEX B в 10 объемах колонки (CV), чтобы достигнуть 250 мМ NaCl, второй шаг до 50% буфера CEX B в 5 CV, чтобы достигнуть 500 мМ NaCl, и третий этап до 100% CEX B буфера в 2 CV достичь 1 М NaCl. Сбор 1,5 мл фракции в течение стадий элюции.
  8. Анализ 10 мкл фракций , собранных в ходе стадии элюирования с помощью SDS-PAGE (12% ДСН-гель - акриламид) и окрашивания Кумасси (рисунок 3 А) 16. Проверьте шаг загрузки на колонку, а также с помощью AnalyЗин 10 мкл проточные.
  9. Выбрать фракции, содержащие Tau и объединяют эти фракции на следующей стадии.
  10. Произвести замену буфера на тау-содержащих объединенных фракций (рисунок 3 В).
    1. Равновесие колонку обессоливания 53 мл смолы G25 уплотненный слой (26 х 10 см) в 50 мМ бикарбоната аммония (летучем буфере), используя FPLC систему.
    2. Скорость потока устанавливается на 5 мл / мин. Вводят образец Tau на колонке с помощью цикла инъекции 5 мл. Собирают фракции, соответствующие пику поглощения при длине волны 280 нм.
    3. Повторить инъекцию 3-4 раза, в зависимости от объема исходного CEX бассейна.
  11. Рассчитать количество очищенного белка Tau с использованием площади пика на хроматограмме при 280 нм (1 мг тау соответствует 140 MAU * мл).
    Примечание: Коэффициент экстинкции белка тау при 280 нм составляет 7550 М -1 см -1. Tau не содержит каких-либо остатков ГТО.
  12. Бассейн все фракции тау.
  13. Aliquoт образец в пробирки, содержащие эквивалент от 1 до 5 мг тау. Выберите эти трубки таким образом, чтобы объем раствора мал по сравнению с объемом трубки (например 5 мл раствора в 50 мл пробирку).
  14. Пробивать отверстия в крышках трубы с помощью иглы. Заморозить образцы Tau при -80 ° С.
  15. Лиофильной сушке Tau образцов. Лиофилизированный тау-белок можно хранить при -20 ° С в течение длительных периодов времени.

3. In Vitro Фосфорилирование 15 N-тау

  1. Растворяют 5 мг лиофилизированного Tau в 500 мкл буфера для фосфорилирования (50 мМ Hepes · KOH, рН 8,0, 12,5 мМ MgCl 2, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl).
  2. Добавить 2,5 мМ АТФ (25 мкл 100 мМ исходного раствора хранили при -20 & deg; С), 1 мМ DTT (1 мкл 1 М раствора хранили при -20 & deg; С), 1 мМ EGTA (2 мкл 0,5 М маточного раствор), ингибитор протеазы 1x коктейль (25 мкл 40х материала, полученного путем растворения 1 таблетку в 1 мл буфера фосфорилирования) и 181; М активировал-Erk2 (250 мкл в буфере 10 мМ сохранения HEPES, рН 7,3, 1 мМ ДТТ, 5 мМ MgCl 2, 100 мМ NaCl , и 10% глицерина, хранили при -80 & deg ; С) в общем объеме пробы 1 мл.
    Примечание: Активированный His-ERK2 может быть подготовлен в доме 5,8 фосфорилированием с киназы МЕК.
  3. Выдержите 3 ч при 37 ° С.
  4. Нагрева образца при температуре 75 ° С в течение 15 мин, чтобы инактивировать ERK киназа.
  5. Центрифуга при 20000 х г в течение 15 мин. Собрать и сохранить супернатант.
  6. Обессоливания образца белка в 50 мМ бикарбоната аммония с использованием колонки 3,45 мл G25 смолы уплотненного слоя (1,3 х 2,6 см), который пригоден для 1 мл пробы.
  7. Запуск 12% SDS-PAGE 16 с 2,5 мкл образца белка , чтобы проверить как его целостность и эффективную фосфорилирования (рисунок 4).
  8. Лиофилизации фосфорилированный образец Tau. Хранить порошок при -20 ° С.

4. Получение спектров ЯМР (Fi5 цифра)

  1. Солюбилизации 4 мг лиофилизированного 15 Н, 13 С ERK-фосфорилированный-Тау в 400 мкл буфера ЯМР (50 мМ Näpi или 50 мМ дейтерированных трис- D11 .cl, рН 6,5, 30 мМ NaCl, 2,5 мМ ЭДТА и 1 мМ DTT).
  2. Добавить 5% D 2 O для полевой фиксации ЯМР спектрометра и 1 мМ ТСГУ (3- (триметилсилил) 4 натриевой соли пропионовой-2,2,3,3-d)) в качестве эталонного сигнала , внутренний ЯМР. Добавьте 10 мкл 40х раствора полного коктейля ингибитора протеазы.
  3. Переноса образца в ЯМР-трубки диаметром 5 мм с помощью электронного шприца с длинной иглой или пипеткой Пастера. Закройте трубку ЯМР, используя поршень. Удалите воздушный пузырь, остающийся между поршнем и жидкостью движениями поршня.
  4. Поместите пробирку ЯМР в блесны. Отрегулировать вертикальное положение в фильера с соответствующим датчиком для головки ЯМР зонд, используемый, таким образом, что большая часть раствора образца будет внутри катушки ЯМР.
  5. Запуск воздушного потока: нажмите подъемную Iп окно системы управления магнитом. Осторожно поместите фильера с трубкой в ​​воздушном потоке в верхней части отверстие магнита. Остановить поток воздуха (нажмите лифта) , и пусть труба спускаемся на место внутри головки зонда в магните.
  6. Заданное значение температуры до 25 ° С (298 К).
  7. Выполните полуавтоматическую настройку и согласование головки зонда для оптимизации передачи мощности. Введите atmm в командной строке.
  8. Блокировка частоты спектрометра с использованием сигнала D 2 O образца , записанного на канале дейтерий. Нажмите блокировку в окне системы управления магнитом.
  9. Запуск процедуры Шиммирование для оптимизации однородности магнитного поля в месте расположения образца. Тип topshim графического интерфейса в командной строке , чтобы открыть окно Шим. Нажмите кнопку Пуск в окне Шим. Проверьте остаточный B0 стандартное значение изменения, чтобы убедиться, что прокладки являются оптимальными (менее 2 Гц хорошо).
  10. Откалибруйте параметр p1 (длина протонаРадиочастотный импульс в мксек), который необходимо получить поворот на 90 ° протонных спинов. Цель для 360 ° импульса с использованием спектра 1D протонов воды (рисунок 6).
  11. Отрегулируйте смещение частоты с помощью параметра O1 (в Гц) на частоте протонов воды в спектре 1D (рисунок 6).
  12. Начало приобретение 1D спектра протонов (последовательности импульсов с WATERGATE последовательности для подавления сигнала от воды, например zggpw5) для проверки сигналов от образца (рисунок 7). Приспособьтесь количество сканирований относительной концентрации белка. Введите ZG в командной строке , чтобы начать сбор данных.
  13. Настройка дополнительных параметров для приобретения 2D [1 Н, 15 Н] HSQC спектр (импульсной последовательности hsqcetfpf3gpsi, цифры 8-9).
    1. Для 15 Н, 13 С меченый образец, отвязать 13 С в течение косвенной эволюции 15 N.
    2. Установить число точек и спектральную ширину (частей на миллион) в 1 Н (F2) и 15 Н (F1) размеров.
      Примечание: Адаптировать количество точек данных , сбора в поле спектрометра , чтобы сохранить такое же количество Гц на точку и ограничить развязку раз: использовать 3072 точек на частоте 900 МГц и 2048 точек на частоте 600 МГц, в размерности 1 H.
    3. Оптимизация дополнительных параметров в импульсных последовательностей, соответствующих задержек, длительности импульса, смещения частоты, уровни мощности. Тип Ased в командной строке , чтобы отобразить все параметры , имеющие значение для эксперимента.
  14. Настройка параметров для приобретения 3D [1 Н, 15 Н, 13 С] HNCACB спектр (последовательность импульсов hncacbgpwg3d, 10А) на частоте 600 МГц.
  15. Настройка параметров для 3D [1 H, 15 N, 15 N] HNCANNH эксперимент (импульсная последовательность hncannhgpwg3d) на частоте 600 МГц. Установите количество точек до 2048 в 1 H и 64и 128 очков в двух 15 N измерений. Определить спектральные ширины , как 14, 25, 25 частей на миллион (промилле) сосредоточено на 4.7, 119, 119 частей на миллион в 1 H, 15 N и 15 N измерений. Продолжительность приобретения с 16 сканирований составляет 1 день и 22 ч.

5. Определение сайтов фосфорилирования

  1. Спектры процессов с использованием сбора и обработки ЯМР программного обеспечения.
    1. Выполните преобразование Фурье данных (рисунок 7). Тип футов для спектра 1D, XFB для 2D спектра или ft3d для 3D - спектра, в командной строке.
    2. Фаза и ссылки на все спектры (фиг.7С) с использованием интерактивных окон.
  2. Определение резонансы интереса к 2D HSQC потенциально соответствующая фосфорилированных Ser и Thr остатков (рисунок 9, красная коробка).
  3. Извлечение плоскости (т.е. 2D C спектров 1 H- 13) изС спектр 3D 1 H- 15 N- 13 , используя 15 N химические сдвиги резонансов интерес в 2D. С помощью курсора размерности 2 (w2) , чтобы выбрать частоту 15 N , соответствующей плоскости (w1-W3) для визуализации (рис 10б).
  4. Выберите резонансные частоты 'CA' и ядра "CB" 13 С "я" и остатки "I-1 '(более слабый набор сигналов по сравнению с теми остатка I) для каждого [1 Н, 15 Н] резонанса интерес к HNCACB 3D спектра, нажав на резонанс, в меню режима указателя найти / добавить пик, чтобы добавить химическое значение сдвига в файле списка пиков.
    1. Определить тип я остатка, pSer или Рпор, путем сравнения химических сдвигов в списке пика к известным значениям CA и CB химических сдвигов pSer и Рпор 17.
    2. Определить наличие Pro остатка на I + 1 позицию по характерному дополнительным +2 промилле сдвига Oе значения 18 сдвига CA химической.
    3. Сравните значения химического сдвига СА и СВ резонансов , соответствующих I-1 остатка в таблицу химических сдвигов предсказанных для Тельца аминокислотных остатков 19 , чтобы определить природу остатка в положении I-1.
  5. Выберите резонансные частоты 15 N ядер 'я' и 'I-1' остатки для каждого [1 Н, 15 Н] резонанса интерес в спектре HNCANNH.
  6. Сравнить 15 N значений химического сдвига к присвоению химического сдвига белка Tau 20 - 23.
  7. Сравните идентифицированных дипептидов с последовательностью Tau для определения последовательности конкретного задания.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На фиг.3А показан основной пик поглощения при 280 нм , наблюдаемых в процессе градиента элюции. Этот пик соответствует очищенного белка Tau, как показано на геле акриламид выше хроматограмме. На фиг.3В показана хорошо отделенного пик поглощения при 280 нм и пиком проводимости, гарантируя , что обессоливание белка является эффективным. На рисунке 4 показан белковый гель-наблюдаемый сдвиг с помощью анализа SDS-PAGE 16 характеристике кратных фосфорилирования белка (сравните дорожки ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы использовали ЯМР-спектроскопии для характеристики ферментативно модифицированных образцов тау. Рекомбинантная экспрессия и очистка описана здесь для полноразмерного человеческого белка тау так же может быть использован для получения мутантных Tau или Tau домены. Обогащены изотопом белок необходим для ЯМР-спектроскопии, что вызывает необходимость рекомбинантной экспрессии. Определение сайтов фосфорилирования требует назначения резонанса и 15 N, 13 C двукратно меченого белка. Учитывая стоимость из...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Установки ЯМР финансировались Région Nord, CNRS, Институтом Пастера в Лилле, Европейским сообществом (FEDER), Министерством исследований Франции и Университетом наук и технологий в Лилле. Мы выражаем признательность за поддержку со стороны TGE RMN THC (FR-3050, Франция), FRABio (FR 3688, Франция) и основного центра NMR и RPE Health and Biology в Лилле. Наши исследования поддерживаются грантами от LabEx (Лаборатория передового опыта), DISTALZ (Разработка инновационных стратегий для трансдисциплинарного подхода к болезни Альцгеймера), EU ITN TASPPI и ANR BinAlz.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
pET15B рекомбинантная экспрессия T7 плазмидыNovagen69257Держать при -20 °°; C
BL21(DE3) трансформация компетентна E. coli бактерииNew England BiolabsC2527IДержите при -80 ° C
Автоклавный бульон LB, Lennox DIFCO240210Бактериальная среда для роста
MEM витамины дополняет 100xSigma58970CБактериальная среда для роста Добавка
15N, 13C-ISOGRO полный средний порошокSigma608297Vitamin Growth Medium Supplement
15NH4ClSigma299251изотоп
13C6-глюкозасигма389374
таблетки ингибитора изотопной протеазы Рош5056489001держать на 4 градусах; C
1 таблетка в 1 мл представляет собой 40x раствор, который можно держать при -20 °deg; C
DNaseIEUROMEDEX1307Держать при -20 °°; C
Гомогенизатор (EmulsiFlex-C3)Лизис АВЕСТИНАреализуется при 4°°; C
Pierce™ Неокрашенный белок MW маркерпрокалывает266109
активной человеческой MEK1-киназой, GST помеченаSigmaM8822Держитесь на -80 & градусов; C
AKTÄ Система чистой хроматографииGE HealthcareFPLC
HiTrap SP Sepharose FF (колонка 5 мл)GE Healthcare17-5156-01Колонки для катионной обменной хроматографии
HiPrep 26/10 ОбессоливаниеGE Healthcare17-5087-01Колонка для обессоливания белка
PD MidiTrap G-25GE Healthcare28-9180-08Колонка для обессоливания белка
Tris D11, 97% DCortecnetCD4035P5Дейтерированный ЯМР-буфер
5 мм Симметричная микротрубка SHIGEMI D2O (набор из 5 внутренних и наружных труб) Euriso-topBMS-005BNMR Shigemi Tubes
eVol kit-электронный шприц стартовый комплектCortecnet2910000Пипетка
Bruker 900 МГц AvanceIII с тройным резонансным криогенным зондомBrukerNMR спектрометр для сбора данных
Bruker 600 МГц Avance с тройным резонансным криогенным зондомBrukerNMR спектрометр для сбора данных
TopSpin 3.1Программное обеспечение Brukerдля сбора и обработки данных для ЯМР-экспериментов
Sparky 3.114UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller)Программное обеспечение для анализа данных ЯМР

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y. C., Quinlan, M., Wisniewski, H. M., Binder, L. I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
  2. Hasegawa, M., Morishima-Kawashima, M., Takio, K., Suzuki, M., Titani, K., Ihara, Y. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer's disease brain. J. Biol. Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
  3. Kopke, E., Tung, Y. C., Shaikh, S., Alonso, A. C., Iqbal, K., Grundke-Iqbal, I. Microtubule-associated protein tau. Abnormal phosphorylation of a non-paired helical filament pool in Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 268 (32), 24374-24384 (1993).
  4. Wischik, C. M., Edwards, P. C., et al. Quantitative analysis of tau protein in paired helical filament preparations: implications for the role of tau protein phosphorylation in PHF assembly in Alzheimer's disease. Neurobiol. Aging. 16 (3), 409-417 (1995).
  5. Prabakaran, S., Everley, R. A., et al. Comparative analysis of Erk phosphorylation suggests a mixed strategy for measuring phospho-form distributions. Mol. Syst. Biol. 7, 482(2011).
  6. Landrieu, I., Lacosse, L., et al. NMR analysis of a Tau phosphorylation pattern. J. Am. Chem. Soc. 128 (11), 3575-3583 (2006).
  7. Amniai, L., Barbier, P., et al. Alzheimer disease specific phosphoepitopes of Tau interfere with assembly of tubulin but not binding to microtubules. FASEB J. 23 (4), 1146-1152 (2009).
  8. Qi, H., Prabakaran, S., et al. Characterization of Neuronal Tau Protein as a Target of Extracellular Signal-regulated Kinase. J. Biol. Chem. 291 (14), 7742-7753 (2016).
  9. Bibow, S., Ozenne, V., Biernat, J., Blackledge, M., Mandelkow, E., Zweckstetter, M. Structural impact of proline-directed pseudophosphorylation at AT8, AT100, and PHF1 epitopes on 441-residue tau. J. Am. Chem. 133 (40), 15842-15845 (2011).
  10. Boulton, T. G., Yancopoulos, G. D., et al. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control. Science. 249 (4964), 64-67 (1990).
  11. Anderson, N. G., Maller, J. L., Tonks, N. K., Sturgill, T. W. Requirement for integration of signals from two distinct phosphorylation pathways for activation of MAP kinase. Nature. 343 (6259), 651-653 (1990).
  12. Seger, R., Ahn, N. G., et al. Microtubule-associated protein 2 kinases, ERK1 and ERK2, undergo autophosphorylation on both tyrosine and threonine residues: implications for their mechanism of activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88 (14), 6142-6146 (1991).
  13. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  14. Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D. S., Lin, S. W., Dunn, J. J., Studier, F. W. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56 (1), 125-135 (1987).
  15. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
  16. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  17. Bienkiewicz, E. A., Lumb, K. J. Random-coil chemical shifts of phosphorylated amino acids. J. Biomol. NMR. 15 (3), 203-206 (1999).
  18. Wishart, D. S., Bigam, C. G., Holm, A., Hodges, R. S., Sykes, B. D. 1H, 13C and 15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. I. Investigations of nearest-neighbor effects. J Biomol NMR. 5 (1), 67-81 (1995).
  19. Tamiola, K., Acar, B., Mulder, F. A. A. Sequence-specific random coil chemical shifts of intrinsically disordered proteins. J. Am. Chem. Soc. 132 (51), 18000-18003 (2010).
  20. Lippens, G., Wieruszeski, J. M., et al. Proline-directed random-coil chemical shift values as a tool for the NMR assignment of the tau phosphorylation sites. Chembiochem. 5 (1), 73-78 (2004).
  21. Smet, C., Leroy, A., Sillen, A., Wieruszeski, J. M., Landrieu, I., Lippens, G. Accepting its random coil nature allows a partial NMR assignment of the neuronal Tau protein. Chembiochem. 5 (12), 1639-1646 (2004).
  22. Mukrasch, M. D., Bibow, S., et al. Structural polymorphism of 441-residue tau at single residue resolution. PLoS Biol. 7 (2), e34(2009).
  23. Harbison, N. W., Bhattacharya, S., Eliezer, D. Assigning backbone NMR resonances for full length tau isoforms: efficient compromise between manual assignments and reduced dimensionality. PloS One. 7 (4), e34679(2012).
  24. Morris, M., Knudsen, G. M., et al. Tau post-translational modifications in wild-type and human amyloid precursor protein transgenic mice. Nat. Neurosci. 18 (8), 1183-1189 (2015).
  25. Mair, W., Muntel, J., et al. FLEXITau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease. Analytical Chemistry. 88 (7), 3704-3714 (2016).
  26. Leroy, A., Landrieu, I., et al. Spectroscopic studies of GSK3{beta} phosphorylation of the neuronal tau protein and its interaction with the N-terminal domain of apolipoprotein E. J. Biol. Chem. 285 (43), 33435-33444 (2010).
  27. Theillet, F. -X., Smet-Nocca, C., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
  28. Qi, H., Cantrelle, F. -X., et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy characterization of interaction of Tau with DNA and its regulation by phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  29. Cordier, F., Chaffotte, A., Wolff, N. Quantitative and dynamic analysis of PTEN phosphorylation by NMR. Methods. 77-78, 82-91 (2015).
  30. Thongwichian, R., Kosten, J., et al. A Multiplexed NMR-Reporter Approach to Measure Cellular Kinase and Phosphatase Activities in Real-Time. J. Am. Chem. Soc. 137 (20), 6468-6471 (2015).
  31. Smith, M. J., Marshall, C. B., Theillet, F. -X., Binolfi, A., Selenko, P., Ikura, M. Real-time NMR monitoring of biological activities in complex physiological environments. Curr. Opin. Struct. Biol. 32, 39-47 (2015).
  32. Theillet, F. X., Rose, H. M., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
  33. Bodart, J. -F., Wieruszeski, J. -M., et al. NMR observation of Tau in Xenopus oocytes. J. Magn. Reson. 192 (2), 252-257 (2008).
  34. Lippens, G., Landrieu, I., Hanoulle, X. Studying posttranslational modifications by in-cell NMR. Chem. Biol. 15, 311-312 (2008).
  35. Landrieu, I., Smet-Nocca, C., et al. Molecular implication of PP2A and Pin1 in the Alzheimer's disease specific hyperphosphorylation of Tau. PLoS One. 6, e21521(2011).
  36. Sibille, N., Huvent, I., et al. Structural characterization by nuclear magnetic resonance of the impact of phosphorylation in the proline-rich region of the disordered Tau protein. Proteins. 80 (2), 454-462 (2012).
  37. Schwalbe, M., Kadavath, H., et al. Structural Impact of Tau Phosphorylation at Threonine 231. Structure. 23 (8), 1448-1458 (2015).
  38. Amniai, L., Lippens, G., Landrieu, I. Characterization of the AT180 epitope of phosphorylated Tau protein by a combined nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopy approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412 (4), 743-746 (2011).
  39. Sottejeau, Y., Bretteville, A., et al. Tau phosphorylation regulates the interaction between BIN1's SH3 domain and Tau's proline-rich domain. Acta Neuropathol. Commun. 3 (1), (2015).
  40. Joo, Y., Schumacher, B., et al. Involvement of 14-3-3 in tubulin instability and impaired axon development is mediated by Tau. FASEB J. 29 (10), 4133-4144 (2015).
  41. Smet, C., Duckert, J. F., et al. Control of protein-protein interactions: structure-based discovery of low molecular weight inhibitors of the interactions between Pin1 WW domain and phosphopeptides. J. Med. Chem. 48 (15), 4815-4823 (2005).
  42. Milroy, L. -G., Bartel, M., et al. Stabilizer-Guided Inhibition of Protein-Protein Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54 (52), 15720-15724 (2015).
  43. Smet, C., Sambo, A. V., et al. The peptidyl prolyl cis/trans-isomerase Pin1 recognizes the phospho-Thr212-Pro213 site on Tau. Biochemistry. 43 (7), 2032-2040 (2004).
  44. Landrieu, I., Smet, C., et al. Exploring the molecular function of PIN1 by nuclear magnetic resonance. Curr Protein Pept Sci. 7 (3), 179-194 (2006).
  45. Lippens, G., Landrieu, I., Smet, C. Molecular mechanisms of the phospho-dependent prolyl cis/trans isomerase Pin1. FEBS J. 274 (20), 5211-5222 (2007).
  46. Smet-Nocca, C., Launay, H., Wieruszeski, J. M., Lippens, G., Landrieu, I. Unraveling a phosphorylation event in a folded protein by NMR spectroscopy: phosphorylation of the Pin1 WW domain by PKA. J. Biomol. NMR. 55, 323-337 (2013).
  47. Smet-Nocca, C., Wieruszeski, J. M., Melnyk, O., Benecke, A. NMR-based detection of acetylation sites in peptides. J. Pept. Sci. 16 (8), 414-423 (2010).
  48. Kamah, A., Huvent, I., et al. Nuclear magnetic resonance analysis of the acetylation pattern of the neuronal Tau protein. Biochemistry. 53 (18), 3020-3032 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vitro

Похожие статьи