Методическая статья

Экспериментальный дизайн для лазерных микродиссекция РНК-Seq: уроки из анализа развития листьев кукурузы

DOI:

10.3791/55004

⸱

5 марта 2017 г.

 ,  , 
1Plant Biology Section, School of Integrative Plant Science, Cornell University, 2Department of Developmental Genetics, University of Wyoming

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многие важные для развития гены имеют специфические для клеток или тканей паттерны экспрессии. В этой статье описываются эксперименты LM RNA-seq для идентификации генов, которые дифференциально экспрессируются на границе пластинки листа кукурузы и влагалища и у мутантов lg1-R по сравнению с диким типом. Обсуждаемые здесь экспериментальные соображения применимы и к транскриптомному анализу других феноменов развития.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гены с важную роль в развитии часто имеют в пространстве и / или во времени ограниченные паттерны экспрессии. Часто эти генные транскрипты не обнаруживаются или не определяются как дифференциально экспрессируются (DE) в транскриптомных анализа целых органов растений. Лазерная микродиссекция-Seq РНК (LM-Seq РНК) является мощным инструментом для идентификации генов, которые DE в конкретных областях развития. Тем не менее, выбор клеточных доменов microdissect и сравнить, и точность microdissections имеют решающее значение для успеха экспериментов. Вот два примера иллюстрируют конструктивные соображения для транскриптомике экспериментов; Л.М. РНК-сл анализ , чтобы идентифицировать гены, которые - де вдоль листа кукурузы проксимальной-дистальной оси, а второй эксперимент , чтобы идентифицировать гены, которые в DE liguleless1-R (lg1-R) Мутанты по сравнению с диким типом. Ключевые элементы , которые внесли свой вклад в успех этих экспериментов были подробно гистологическое и в сиTu гибридизация анализ области для анализа, выбор листа зачатков на эквивалентных стадиях развития, использование морфологических ориентиров для выбора регионов для микродиссекции и микродиссекции точно измеренных доменов. В настоящем документе приводится подробный протокол для анализа областей развития с помощью LM РНК-Seq. Представленные здесь данные показывают, как область выбрана для микродиссекции будет влиять на полученные результаты.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лист кукурузы является идеальной моделью для исследования образования полей развития в процессе морфогенеза, поскольку она имеет четкую границу между лопаткой и оболочкой, которая поддается генетической диссекции (рис 1А). На ранних стадиях развития листьев, линейной полосы более мелких ячеек, то preligule группа (PLB), подразделяет листовой зачаток в предварительно лопаточной и предварительно оболочки доменов. Бахромой, как Язычок и треугольные ушки развиваются из PLB (рис 1А, C, D). Генетические экраны выявили мутации, которые нарушают границу лопастного оболочки. Например, рецессивный liguleless1 (lg1) мутации удаления язычка и ушные раковины 1, 2, 3, 4 (Фигура 1В). В гибридизация показало , что lg1 транскрипт накапливается в РLB и возникающих язычка, что делает его отличным маркером для язычка развития 5, 6 (рис 1E).

figure-introduction-1
Рисунок 1: дикого типа и liguleless1-R листьев кукурузы. (А) граница Блейд-оболочка область зрелого дикого типа листа , показывающий язычка и предсердия структур. (B) граница Блейд-оболочка область зрелого liguleless1-R листьев показывая отсутствие язычка и ушной раковины структур. Листья в А и В были сокращены в два раза вдоль жилки. (С) Продольный разрез через лист примордия дикого типа. Образец был обработан и окрашивают для гистологического анализа. Инициирующий Язычок очевидно как выпуклость, выступающую из плоскости листа (стрелки). (D) Продольная разделиона через лист зачатка дикого типа. Образец был обработан для LM, как описано в тексте. Arrowhead указывает на инициирование язычка. (E) lg1 на месте гибридизации побегов верхушки корня бокового продольного разреза в. Звездочки показывают lg1 накопление транскриптов в PLB от P6 листа зачатка. Стрелки указывают основание P6 зачатка. Бар показывает измерение от основания зачатка к ИПР. Шкала баров в А и В = 20 мм. Шкала баров в CE = 100 мкм. Эта цифра была изменена из ссылки 6 (Авторское право Американского общества биологов растений). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

В этом исследовании, Л.М. Секвенирование РНК был использован, чтобы идентифицировать набор генов, которые дифференциально экспрессируются (DE) на границе лопастного оболочки по отношению к другим частям листа зачатка и Ide ntify гены, которые DE в lg1-R мутантов по отношению к братьев и сестер дикого типа. LM-РНК Seq представляет собой метод количественного накопления транскриптов в специфических клетках или клеточных доменов 7. LM системы сочетают в себе лазер и микроскоп с цифровой камерой. Секционного ткань монтируется на салазках и просмотрены через микроскоп. Программное обеспечение LM обычно включает в себя инструменты для рисования, которые позволяют пользователю выделить любую выбранную область для микродиссекции. Разрезы лазерные вдоль линии, и выбранная ткань катапультировался за пределы слайда и в трубу, подвешенную над слайде. LM позволяет пользователю microdissect точные домены, в том числе специфических клеточных слоев и даже отдельных клеток 8, 9. РНК затем может быть извлечено из микродиссекции ткани. Затем РНК-Seq компонент использует следующего поколения последовательности в последовательности кДНК - библиотек , сгенерированные из извлеченной РНК 10,= "Xref"> 11.

Основные преимущества LM Секвенирование РНК являются способность количественного накопления транскриптов в четко определенных областях и способность к профилю весь транскриптом одновременно 7. Метод особенно подходит для зондирования ранних событий в области развития, где область интереса часто микроскопическими. Предыдущие исследования использовали LM в сочетании с микрочипов технологии для изучения процессов развития растений 9, 12, 13. РНК-Seq имеет преимущество количественной оценки транскриптов в широком динамическом диапазоне, в том числе с низкой экспрессируемых генов, и информация до последовательности не требуется 10, 11. Более того, LM-Seq РНК имеет потенциал, чтобы выделить важные гены уровню развития, которые могут быть пропущены в экранах мутагенеза из-за генетической избыточности или к летальности потерь посещающихфункция мутант.

Развивающих важные гены, такие как узкий sheath1 (ns1) и чашеобразной cotyledon2 (cuc2), часто имеют специфические паттерны экспрессии только один или несколько ячеек 17, 18, 19, 20. Многие выражаются только на ранних стадиях развития, а не в зрелом органе. Когда целые органы или крупные домены анализируются, эти клеточные специфические транскрипты разбавлены и не могут быть обнаружены в более обычных анализах. Допустив анализ точно определенных областей, LM-Seq РНК позволяет эти гены тканеспецифические быть идентифицированы и количественно.

Решающие факторы в успехе экспериментов, описанных здесь, были тщательный гистологический анализ, который руководствовался выбор соответствующей стадии развития и области для анализа и точного MeasureMeнт доменов клеточной ткани для LM. Для того, чтобы гарантировать , что эквивалентные домены были отобраны для всех повторах, ткань была собрана из листьев зачатков на той же стадии развития и микродиссекции домены были измерены относительно морфологических ориентиров , таких как формирующейся язычка (рис 2). Известно, что некоторые гены экспрессируются в градиенте от кончика к основанию листа. Измеряя точные домены, изменение из - за выборки из разных мест вдоль листа проксимальной-дистальной оси была сведена к минимальной (рис 3А). По microdissecting домены одного и того же размера, изменение за счет дифференциальной разбавление клеток специфических транскриптов также была снижена (фигура 3В). Боковые продольные участки верхушки побега были использованы для всех microdissections. Эти участки, перпендикулярные оси жилка рентабельностью (Рисунок 4). Используя только разделы, которые включают SAM гарантирует, что эквивалентные боковые участкилистовые зачатки анализируются.

В образцах , обработанных и секционного для LM, первым морфологическим признаком язычка выроста является шишка на адаксиальную стороне из - за периклинальных клеточных делений в адаксиальной эпидермиса (рис 1D, Рисунок 2). Было установлено, что формирующаяся Язычок может быть надежно идентифицирован на plastochron 7 этап листьев зачатков. Мы были заинтересованы в генах, выраженных во всем регионе язычка, включая формирующейся язычка и клетки немедленно дистальных, которые будут образовывать ушную раковину. Для того , чтобы гарантировать , что выборы эквивалентные ткани были сделаны, Язычок шишка был использован в качестве ориентира морфологического и прямоугольник 100 мкм с серединой на Язычок бугорок был выбран для LM (рис 2А, 2В). Эквивалент размера прямоугольниками предварительного лезвия и предварительной оболочки были выбраны из тех же листьев зачатков.

Анализ liguleless мутантных растений представлены различные ChalleНге; lg1-R мутанты не образуют язычка, поэтому эта морфологическая особенность не может быть использована для выбора региона для LM. Вместо этого область lg1 накопления транскриптов в листьев зачатков дикого типа была определена, и была определена область , которая охватывала бы эту область. Эти предварительные анализы проводили на проростках из того же посадки, которые были использованы для окончательного анализа, поскольку предыдущие исследования показали, что местоположение PLB изменяется в зависимости от условий роста. В гибридизация показали , что lg1 транскрипты накапливаются в PLB Р6 листьев зачатков (рис 1E). Мы выбрали домен 400-900 мкм от основания листа зачатков , который охватывает область lg1 выражения (фиолетовый прямоугольник, рисунок 2А) и захватил эти эквивалентные области из дикого типа и lg1-R растений. Чтобы свести к минимуму изменение генетического фона и условий роста при сравнении transcripбыли использованы т накопление в lg1-R и растений дикого типа, семейства разделения мутантов , братьев и сестер дикого типа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Закрепить ткань для гистологического анализа в то же время, что ткань фиксируется для LM. Изучите окрашенные срезы для морфологических признаков, которые будут направлять позже LM. При сравнении мутанта дикого типа, выполнить гибридизация или иммунолокализации , чтобы определить домен , в котором выражается интерес ген (в данном случае Lg1).

1. Ткань фиксации и обработки

  1. Grow квартиры рассады кукурузы до двух недель старых в стандартных условиях 6.
  2. Рассеките стрелять для боковых вершинами секций (Рисунок 4).
    1. Акцизный рассада чуть ниже линии почвы.
    2. С помощью лезвия бритвы, удалите тонкие ломтики от основания стебля (режет 1, рисунок 4A) до тех пор , овал соломиной окружен одной или двух зрелых листьев видна (4Б).
    3. Сделайте еще один разрез примерно на 10 мм выше основания (вырезать 2, рисунок 4А).Этот сегмент 10 мм будет содержать SAM и молодых зачатков листьев.
    4. Поверните сегмент 10 мм таким образом, основание лицевой стороной вверх. Сделать два разреза , параллельно поперечной оси таким образом , чтобы срез толстой ткани 2-3 мм получается (порезы 3, и 4, 4Б). Отбросить внешние две части и удерживать центральную кусочек для фиксации и вложения.
      Примечание: Внешние листья могут быть обрезаны и отбрасывают.
  3. Закрепить ткань и процесс для встраивания.
    1. Убедитесь, что все материалы, которые будут использованы в последующих стадиях являются РНКазы. Treat растворы с диэтилпирокарбонат (DEPC) (1 мл DEPC на литр раствора. Выдержите в течение ночи при периодическом встряхивании, и автоклав). Выпекать изделия из стекла в печи при температуре 200 ° C или выше в течение по крайней мере 6 часов и рассматривать пластиковую посуду с обеззараживающим раствором РНКазы.
    2. День 1: погрузить кусочки ткани в ~ 10 мл затруднительного Фармера (3: 1 смеси этанол: уксусная кислота) в стеклянной пробирке на льду. После того, как все образцы были расчленены, применяются VACUUм, чтобы удалить пузырьки воздуха и проникновение помощи фиксирующих. Держите под вакуумом в течение 10 мин, затем отпустите вакуум медленно. Заменить закрепитель и инкубировать при температуре 4 ° С в течение ночи при осторожном встряхивании.
    3. День 2: Инкубируют в следующей серии решений, ~ 10 мл каждый раз, 1 час каждый, все при осторожном встряхивании; 85% этанола при температуре 4 ° С, 95% этанола при 4 ° С, 100% этанола при 4 ° С, 100% этанола при 4 ° С, 100% этанола при 4 & deg; С, 1: 1 этанол: ксилолов при комнатной температуре, 100% ксилолов при комнатной температуре, 100% ксилолов при комнатной температуре.
      Примечание: ксилолов токсичен при контакте и вдыхании. Работа в вытяжном шкафу и использовать соответствующие перчатки.
    4. Добавьте парафин ткани вложение среды гранул приблизительно половину объема ксилолы и инкубировать в течение ночи при комнатной температуре при осторожном встряхивании.
    5. 3-й день: Трансфер флакона до 60 ° C духовке до тех пор, пока гранулы расплава. Слейте раствор и заменить свежим расплавленным ткани вложению среды. Изменение средних два раза большев течение дня.
    6. День 4: Изменение ткани вложение среды один раз утром. Возвращение не до 60 ° C духовке до полудня.
  4. Литые блоки
    1. Поместите встраивание формы на плитке тканевого вложении станции. Используйте пинцет, чтобы передать образцы тканей к вложению формы с поверхность среза лицевой стороной вниз. Долить форму с расплавленным парафином и поместить вложение кольцо на верхней части формы. Переход к холодной плите, пока парафин не затвердеет. Храните парафиновые блоки при 4 ° С в герметичном контейнере с силикагелем.

2. Секционирование и слайдов Подготовка

  1. Вырезать 10 - мкм срезы на микротомом 25.
  2. Изучите ленты и выбрать срединные участки. Срединные секции являются те, которые включают в себя SAM, которая появляется как купол клеток, окруженных листьев зачатков.
  3. секции для монтажа на слайдах.
    1. Место слайды, которые подходят для LM (либо РНКазы илизапеченные) на 42 ° С теплее слайд и нанесите несколько капель 50% -ного раствора этанола, чтобы покрыть слайд.
    2. Поплавок секции на растворе этанола, пока секции не расширили.
      Примечание: Плавающие секции на растворе этанола, а не вода удерживает РНК в осажденном состоянии восстановительной деградации РНК.
    3. Наклоните слайдов и удаления избытка раствора этанола путем аспирации с одноразовой пипетки передачи. чтобы фитиль от какого-либо дополнительного раствора этанола Используйте безворсовые салфетки.
    4. Сухие горок при 42 ° С в течение нескольких часов или в течение ночи. Хранить слайды при 4 ° С в герметичном контейнере с силикагелем.
  4. Deparaffinize скользит в день использования.
    1. Подготовьте три стеклянные банки, содержащие Коплин; 100% ксилолы (ксилолы I), 100% ксилолов (ксилолы II) и 100% этанола (~ 50 мл каждого раствора).
    2. Использование чистых щипцов для передачи слайдов, погружают слайды в ксилолы я в течение 2 мин, ксилолы II в течение 2 мин, и 100% этанолом в течение 1 мин.
    3. Дренажный скользилиэс на безворсовые салфетки и сухой воздух при комнатной температуре.

3. микродиссекция отвала, язычка и оболочкой Образцы из Plastochron 7 листьев зачатков

  1. Закрепите слайды на сцене LM микроскопа. Используйте пять или шесть слайдов для каждой повторности, используя пять секций на слайд.
    Примечание: Ткань для объединения одной повторности показана на рисунке 5.
  2. Изучить слайды и определить пять наиболее срединные секции на каждом слайде, с помощью SAM верхушку в качестве центральной точки отсчета.
    Примечание: Это может быть сделано при малом увеличении, как правило, цель 5X достаточно.
  3. Использование 10X или 20X цель, определить положение язычка на plastochron 7 листьев зачатка каждой секции. Язычок будет видна как выпуклость, выступающую из адаксиальной поверхности листа зачатка. Отметить эту позицию с помощью инструмента рисования программного обеспечения LM; выберите значок карандаша, переместите курсор к соответствующему positiна и нажмите и перетащите мышь, чтобы рисовать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 10X или 20X цель подходит для этого и последующих шагов. При использовании боковых секций, две стороны каждого листа зачатка будет присутствовать в каждом разделе (фиг.2А).
  4. С помощью инструмента линейки и прямоугольного инструмент для рисования, измерения 100 мкм высокие прямоугольниками , центрированных на язычка каждой секции (красные прямоугольники, Фигура 2А, 2В). Это будет "Язычок" образца.
    1. Чтобы использовать инструмент линейки; выберите значок линейки, переместите курсор в один конец измеряемого объекта, нажмите и перетащите, чтобы измерить объект. Длина линейки будет отображаться на экране.
    2. Чтобы нарисовать прямоугольник; выберите значок прямоугольника, переместите курсор в точку, которая будет один угол прямоугольника, нажмите и перетащите, чтобы нарисовать прямоугольник нужного размера. В качестве альтернативы, выберите инструмент прямой линии рисования и нарисуйте четыре прямые линии.
    3. Мера 100 мкм прямоугольниками расположены 50 мкм выше и ниже прямоугольника "Язычок".
      Примечание: Это будет "Клинок" и "ножен" образцы, соответственно (зеленый и синий прямоугольники, Рисунок 2А, 2В). На основании наших данных гистологического исследования, прямоугольник 100 мкм охватывает всю область язычка. были выбраны такого же размера порции лезвия и оболочкой, чтобы обеспечить, что такие же ткани были собраны для каждого из них. Распорки 50 мкм были использованы для того, чтобы не Язычок область ткани не случайно включен в лезвии или оболочки microdissections.
  5. Microdissect измеряется прямоугольниками (рис 2D - 2F) 7, 8, 9, собирая Язычок, лезвие и оболочкой образцы в отдельные пробирки. Используйте функцию с помощью лазерной резки, чтобы прорезать срез ткани вдоль контура выбранного домена. Используйте CataФункция Pult для приведения в движение прямоугольник ткани от слайда и в крышку трубки (рис 2D - 2F).

4. микродиссекция отвала, язычка и оболочки адаксиальная Эпидермальные Образцы из Plastochron 7 листьев зачатков

  1. Выберите разделы и использовать инструмент линейки для измерения 100 мкм высокие сегменты, сосредоточенные на plastochron 7 язычка, как описано в разделе 3 (выше).
    1. Выберите только адаксиальная эпидермальные клетки каждого 100 мкм высокой "Blade" и "Оболочка" сегмента (зеленый и синий, рисунок выборов 2С), выделяя с помощью инструмента рисования. Эпидермис внешний слой клеток; адаксиальную сторона ближе всего к САМ.
    2. Для "Язычок" образца, выберите только клетки развивающегося язычка шишка , как описано в разделе 3.3 (красный выбор, Рис 2С).
  2. Microdissect выбраны регионы, собирая лезвие, язычка и Sheaй эпидермис образцы в отдельные пробирки, как описано в разделе 3.5.

5. микродиссекции Plastochron 6 листьев зачатков из lg1-R , братья и сестры дикого типа

  1. Grow разделения семейства мутантов (lg1-R) и растений дикого типа.
  2. Фикс и процесс съемки для LM вершинами, как описано в разделах 1.2-1.4. Фикс дикого типа и мутантных побегов в отдельных вершинами ампул для того, чтобы держать их отдельно. Образцы из той же посадки должны быть зафиксированы и обработаны для гибридизация.
  3. Определите , где lg1 транскрибируется в братьев и сестер дикого типа, выполняя lg1 гибридизация 6, 26, 27 в. Измерьте положение lg1 накопления транскриптов от основания листьев зачатка в нескольких образцах (рис 1E).
  4. На основе данных гибридизации на месте в выберите часть листа Primordium , который охватывает регион , в котором транскрибируется lg1. В этом случае 400-900 мкм от основания plastochron 6 листьев зачатков (фиолетовые прямоугольники, рис 2А).
  5. Microdissect выбранной части листьев зачатков, как описано в разделе 3.5, собирая lg1-R и образцы дикого типа в отдельные пробирки.

6. Применение РНК-буфера для экстракции

  1. Нанесите 50 мкл буфера для экстракции РНК микродиссекции ткани и приступить к экстракции РНК. Продолжить экстракции РНК, амплификации РНК, создания библиотеки, секвенирования и анализа биоинформатики , как описано в ссылке 6.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя схему LM , описанную на рисунке 2, приблизительно 1,000,000-1,500,000 мкм 2 ткани собирали для каждой репликации в всех клеточно слоев LM (рисунок 5), и 200 000 мкм 2 на репликацию для адаксиальную эпидермис LM. Приблизительно 2500000 мкм2 ткани собирали для каждой репликации в п.м. lg1-R и листьев зачатков дикого типа. Два раунда линейной РНК амплификации получали микрограммов количества РНК для каждой...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспериментальный дизайн является решающим фактором в РНК-сл экспериментов. Основные соображения точный домен (ы) и этап (ы) развития, которые будут проанализированы, и какие сравнения будут сделаны. Крайне важно, чтобы думать с точки зрения сравнения, так как выход, как правило, список генов, которые де между двумя или более условий. Как и во всех экспериментах, важно, чтобы изменить только одну переменную за раз. Например, при сравнении различных доменов листьев, листьев одного и того же возраста и стадии развития, вы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают благодарность С. хека за постоянное сотрудничество и стимулирующие дискуссии о развитии язычка. Эта работа поддерживается Национальным научным грантам Фонда MCB 1052051 и IOS-1848478.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ДиэтилпирокарбонатSigma-Aldrich159220Используется для РНКазной обработки растворов
Бритвенные лезвия Электронная микроскопия наук72000
РНКаза ZapSigma-AldrichR2020-250MLРНКаза раствор для обеззараживания
абсолют этанола 200 proofFisher ScientificBP28184
уксусная кислота, ледянаяSigma-AldrichA6283
Стеклянные флаконы - 22 млVWR470206-384
Ксилолы, гистологический классSigma-Aldrich534056-4L
Paraplast plusSigma-AldrichP3683-1KG
Одноразовые базовые формы, 15 мм x 15 мм x 5 ммVWR15154-072
Закладные кольцаVWR15154-303
Пакеты с силикагелемЭлектронная микроскопия Sciences71206-01Влагопоглотитель для хранения парафиновых блоков
ПечьFisher Scientific15-103-0503Духовой шкаф должен поддерживать температуру 60°°; C
Станция для заделки парафинаLeica EG1160
МикротомLeica RM2235
Подогреватель стеколЭлектронная микроскопия Науки71317-10
Банки для коплинаЭлектронная микроскопия Науки70316-02
Лазерный микродиссекторZeiss
KIMWIPES&торговля; Салфетки Delicate TaskKimberly-Clark Professional34120Безворсовые салфетки для впитывания излишков растворов из микроскопа Предметные стекла
Membrane Slide 1.0 PENZeiss415190-9041-000Слайды для лазерной микродиссекции
Adhesive Cap 200 opaqueZeiss415190-9181-000Трубки для лазерной микродиссекции
PicoPure RNA Isolation KitThermoFisher ScientificKIT0204

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Becraft, P. W., Bongard-Pierce, D. K., Sylvester, A. W., Poethig, R. S., Freeling, M. The liguleless-1 gene acts tissue specifically in maize leaf development. Dev Biol. 141 (1), 220-232 (1990).
  2. Sylvester, A. W., Cande, W. Z., Freeling, M. Division and differentiation during normal and liguleless-1 maize leaf development. Development. 110 (3), 985-1000 (1990).
  3. Moreno, M. A., Harper, L. C., Krueger, R. W., Dellaporta, S. L., Freeling, M. liguleless1 encodes a nuclear-localized protein required for induction of ligules and auricles during maize leaf organogenesis. Genes Dev. 11 (5), 616-628 (1997).
  4. Emerson, R. A. The inheritance of the ligule and auricle of corn leaves. Neb. Agr. Exp. Sta. An. Rep. 25, 81-85 (1912).
  5. Moon, J., Candela, H., Hake, S. The Liguleless narrow mutation affects proximal-distal signaling and leaf growth. Development. 140 (2), 405-412 (2013).
  6. Johnston, R., et al. Transcriptomic Analyses Indicate That Maize Ligule Development Recapitulates Gene Expression Patterns That Occur during Lateral Organ Initiation. Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).
  7. Schmid, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLoS One. 7 (1), e29685(2012).
  8. Kerk, N. M., Ceserani, T., Tausta, S. L., Sussex, I. M., Nelson, T. M. Laser capture microdissection of cells from plant tissues. Plant Physiol. 132 (1), 27-35 (2003).
  9. Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize. Plant Cell. 15 (3), 583-596 (2003).
  10. Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18 (9), 1509-1517 (2008).
  11. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  12. Brooks, L., et al. Microdissection of shoot meristem functional domains. PLoS Genet. 5 (5), e1000476(2009).
  13. Cai, S., Lashbrook, C. C. Stamen abscission zone transcriptome profiling reveals new candidates for abscission control: enhanced retention of floral organs in transgenic plants overexpressing Arabidopsis ZINC FINGER PROTEIN2. Plant Physiol. 146 (3), 1305-1321 (2008).
  14. Li, P., et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nat Genet. 42 (12), 1060-1067 (2010).
  15. Eveland, A. L., et al. Regulatory modules controlling maize inflorescence architecture. Genome Res. 24 (3), 431-443 (2014).
  16. Takacs, E. M., et al. Ontogeny of the maize shoot apical meristem. Plant Cell. 24 (8), 3219-3234 (2012).
  17. Aida, M., Ishida, T., Tasaka, M. Shoot apical meristem and cotyledon formation during Arabidopsis embryogenesis: interaction among the CUP-SHAPED COTYLEDON and SHOOT MERISTEMLESS genes. Development. 126 (8), 1563-1570 (1999).
  18. Ishida, T., Aida, M., Takada, S., Tasaka, M. Involvement of CUP-SHAPED COTYLEDON genes in gynoecium and ovule development in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 41 (1), 60-67 (2000).
  19. Takada, S., Hibara, K., Ishida, T., Tasaka, M. The CUP-SHAPED COTYLEDON1 gene of Arabidopsis regulates shoot apical meristem formation. Development. 128 (7), 1127-1135 (2001).
  20. Nardmann, J., Ji, J., Werr, W., Scanlon, M. J. The maize duplicate genes narrow sheath1 and narrow sheath2 encode a conserved homeobox gene function in a lateral domain of shoot apical meristems. Development. 131 (12), 2827-2839 (2004).
  21. Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).
  22. Birnbaum, K., et al. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302 (5652), 1956-1960 (2003).
  23. Brady, S. M., et al. A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns. Science. 318 (5851), 801-806 (2007).
  24. Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
  25. Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. New York; Oxford. (1999).
  26. Jackson, D., Veit, B., Hake, S. Expression of maize KNOTTED1 related homeobox genes in the shoot apical meristem predicts patterns of morphogenesis in the vegetative shoot. Development. 120, 405-413 (1994).
  27. Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants. J Vis Exp. (57), e3328(2011).
  28. Day, R. C., McNoe, L., Macknight, R. C. Evaluation of global RNA amplification and its use for high-throughput transcript analysis of laser-microdissected endosperm. Int J Plant Genomics. , 61028(2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in situ

Похожие статьи