Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Быстрой и Бесхимический Гемоглобин Анализ с фототермического углового рассеяния света

9.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55006

⸱

7 декабря 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1School of Mechanical Engineering, Yonsei University, 2Department of Laboratory Medicine, Yonsei University

В этой статье

Краткое содержание

Фототермический датчик углового рассеяния света (PT-AS) позволяет быстро и без использования химических веществ анализировать гемоглобин образцов крови в нанолитровом масштабе. Здесь представлена подробная информация о настройке PT-AS и протокол измерения концентрации гемоглобина в крови. Также представлены репрезентативные результаты для образцов крови с анемией.

Аннотация

Фототермические угловое рассеяние света (ПТ-АС) представляет собой новый оптический метод измерения концентрации гемоглобина ([Hb]) образцов крови. На основании собственного ответа фототермическую молекул гемоглобина, датчик обеспечивает высокую чувствительность, бесхимический измерение [Hb]. [Hb] способность обнаружения с пределом 0,12 г / дл работы в диапазоне от 0,35 - 17,9 г / дл было показано ранее. Этот метод может быть легко реализован с использованием электронных устройств недорогой потребителей, таких как лазерный указатель и веб-камеры. Использование микро-капиллярной трубки в качестве контейнера в крови также позволяет анализа гемоглобина с nanoliter шкалы объема крови и низкими эксплуатационными расходами. Здесь представлены подробные инструкции для PT-AS оптической установки и сигнальных процедур обработки. Экспериментальные протоколы и показательные результаты для образцов крови в условиях анемией ([Hb] = 5,3, 7,5 и 9,9 г / дл) также предусмотрены и измерения сравниваются с теми, обозреваютма гематологический анализатор. Его простота в реализации и эксплуатации должны обеспечить его широкое применение в клинических лабораториях и условиях ограниченных ресурсов.

Введение

Анализ крови обычно проводится для оценки общего состояния здоровья человека и для выявления биомаркеров, связанных с определенными заболеваниями. Например, концентрации холестерина в крови, служит в качестве критерия для гиперлипидемии, который тесно связан с сердечно-сосудистыми заболеваниями, и панкреатит. Содержание глюкозы в крови следует измерять часто, так как уровень глюкозы связан с осложнениями, такими как диабетический кетоацидоз и синдром гипергликемии гиперос-. Серьезные заболевания, такие как малярия, вирус иммунодефицита человека и синдром приобретенного иммунодефицита диагностируются обследования крови, и количественное определение компонентов крови, включая эритроциты, тромбоциты, лейкоциты и позволяет скрининг поджелудочной железы и заболеваний почек.

Гемоглобин (Hb), одним из важнейших компонентов крови, составляет около 96% эритроцитов и переносит кислород в органы человека. Значительное изменение его массовой концентрации ([Hb]) может указывать на меняtabolic изменения, гепатобилиарной болезни и неврологические, сердечно - сосудистые и эндокринные расстройства 1. [Hb] поэтому обычно измеряется в анализах крови. В частности, у пациентов с анемией, диализных больных, а также беременным женщинам настоятельно рекомендуется контролировать [Hb] в качестве жизненно важной задачи 2.

Различные [Hb] методы обнаружения, таким образом, были разработаны. Метод гемоглобин цианида, один из наиболее распространенных методов [Hb] Количественное, использует цианид калия (KCN) , чтобы разрушить липидный бислой эритроцитов 3. Цианид гемоглобина, полученные химическим проявляет высокую поглощения около 540 нм; следовательно, [Hb] измерения могут быть сделаны с помощью колориметрического анализа. Этот метод широко применяется благодаря своей простоте, но используемые химические вещества (например, KCN и оксид dimethyllaurylamine) являются токсичными для человека и окружающей среды. Схема гематокрита измеряет соотношение объема красных кровяных клеток по сравнению с общим об кровиумэ через центробежной сепарации; Однако это требует относительно большого объема крови (50-100 мкл) 4. Спектрофотометрии методы измерения [Hb] точно без каких - либо химических веществ, но измерения на нескольких длинах волн , и большой объем крови требуется 5,6. Аналогичным образом, несколько оптических методов измерения [Hb] были предложены в том числе методы обнаружения на основе рассеяния света, но их измерения точности сильно зависят от точности теоретической модели крови.

Чтобы преодолеть эти ограничения, [Hb] методы обнаружения , основанные на фототермальный (PT) эффекта Hb Недавно было предложено 7. Hb, который состоит в основном из оксидов железа, поглощает свет при 532 нм и преобразует световую энергию в тепло 8-10. Это повышение температуры РТ может быть обнаружено оптически путем измерения изменения показателя преломления (RI) проб крови. Иим и др. занятых спектрально-оптической когерентной домена reflectometrу для измерения изменения оптической длины пути PT в камере 11 крови , содержащей. Хотя метод позволяет без химикатов и прямой [Hb] измерение, использование спектрометра и интерферометрический устройство может препятствовать его миниатюризации. Недавно мы представили метод обнаружения альтернативы [Hb], названный фототермические угловое рассеяние света (PT-AS) датчик, который больше подходит для устройства миниатюризации 12. Датчик PT-АС использует высокую чувствительность РИ обратного рассеяния интерферометрии (BSI) для измерения изменений ФП в РИ образца крови внутри капиллярной трубки. BSI были использованы для измерения RI различных решений 13-15 и мониторинга биохимических взаимодействий в свободном растворе 16. Датчик PT-AS использует аналогичную оптическую схему, как в BSI, но сочетает в себе установку возбуждения фототермическую для измерения PT увеличение RI в образцах крови. Принципы работы BSI и датчиков PT-AS подробно описаны в другом месте 12,15. Датчик PT-AS продемонстрировал высокую чувствительность [Hb] измерение в широком диапазоне чувствительности (0.35-17.9 г / дл) и способен работать с объемами выборок <100 нл. Ни один предобусловливание пробы крови не требуется, и время измерения составляет всего ~ 5 сек. Здесь, экспериментальная установка и подробный протокол измерений описаны. Результаты Представитель ПТ-AS предоставляются с использованием образцов крови у пациентов с анемией, а результаты сравниваются с теми из гематологического анализатора для оценки точности датчика PT-AS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты с образцами крови были выполнены в соответствии с соответствующими законами и организационных принципов. Образцы представляли собой остаточные образцы крови, которые были получены и обработаны в ходе клинических испытаний в учреждении.

1. PT-AS Оптический Setup

Примечание: Можно использовать пустой капилляр для начальной установки PT-AS.

  1. Установите пустой капилляр с внутренним и внешним диаметрами 200 и 330 мкм, соответственно, и длиной больше, чем на ~ 5 см на приспособлении капиллярной трубки. Коммерчески доступные волокнистые светильники могут быть использованы в качестве зажимного приспособления трубки.
  2. Плотно закрепить лазерный указатель на 650 нм, т.е. зонд источник света, чтобы осветить капиллярную трубку. Зонд луч должен быть больше, чем капиллярной трубки. Поместите экран (например, белую бумагу) за капиллярной трубки для наблюдения угловой периодический шаблон.
  3. Для части обнаружения, удалите линзы веб-камеры, чтобы непосредственно захватить СКАТТтч рисунок. Установите веб-камеру за капиллярной трубки под углом 25-35 ° по отношению к направлению зондирующего пучка. Убедитесь в том, что угловая периодическая структура производства капиллярной трубки может быть измерена с помощью детектора (рисунок 1). Обратите внимание на угловую периодический рисунок в середине датчика изображения, когда датчик изображения установлен правильно.
  4. Расположите источник света PT возбуждения 532 нм для освещения капиллярной трубки. Поместите источник света PT под любым углом, до тех пор, как свет ПТ возбуждения перекрывает зондирующего пучка на капиллярной трубке и не достигают детектора непосредственно. PT возбуждение образцов крови с использованием высокой оптической мощности, как правило, улучшает PT-как чувствительность, так как это приводит к большему изменению RI.
    1. Используйте самую высокую оптическую мощность источника света возбуждения используют PT. Кроме того, убедитесь, что индикатор PT возбуждения перекрывает зондирующего света на капиллярной трубке. Используйте размер пучка света возбуждения PTпо крайней мере, вдвое больше, чем зондирующего света, чтобы нагреть весь объем зонда.
  5. Поместите длинный фильтр верхних частот перед детектором, чтобы блокировать 532 нм свет и измерять только зонд света 650 нм.
  6. Установите оптический прерыватель на пути возбуждающего света PT освещаться светом капиллярной трубки. Оптический прерыватель используется для модуляции интенсивности света возбуждения РТ.

Приготовление образца 2. Кровь

  1. Нарисуйте 6 мл свежей цельной крови в анемичный состоянии в пробирки для отбора проб крови этилендиаминтетрауксусной кислоты, и смешивать образцы хорошо. Ни одна другая обработка не требуется.
  2. Измерьте образцы крови с помощью датчика PT-AS в течение 24 ч экстракции для предотвращения коагуляции.

3. PT-AS Протоколы измерений

  1. Вставьте капилляр с образцом крови для измерения. Заполните капиллярную трубку с кровью через капиллярное действие, помещая трубку в крови собильным. Минимальный объем образца, необходимый для измерения определяется внутренним диаметром капиллярной трубки и размера зондирующего пучка.
    1. Наймите трубки с внутренним диаметром 200 мкм. Размер зонда пучка 2 мм в представительных результатов, предполагая, что измерение может быть выполнено с объемом выборки> 63 нл.
  2. Установите капиллярную трубку в указанном месте в арматуре.
  3. Включите пробного лазера 650 нм, чтобы осветить крови загруженным капилляр. Угловое периодическая структура должна наблюдаться с веб-камерой.
  4. Включите лазер ПТ возбуждения 532 нм для освещения трубки.
  5. Выполните оптический прерыватель, чтобы модулировать интенсивность возбуждающего света PT с частотой 2 Гц.
    Примечание: обоснование выбора этого рабочего состояния описана в обсуждении и Ким и др. 12.
    1. Установите измельчитель колесо в двигатель головного узла оптического измельчительсистема.
    2. Включите блок управления измельчитель, и используйте ручку управления в консоли, чтобы установить частоту модуляции.
    3. Выполните измельчитель с помощью ручки управления.
  6. Запись флуктуирующую картины рассеяния с помощью веб-камеры в течение 5 сек в формате MPEG-4 (MP4).

4. Обработка сигналов

Примечание: обработка сигналов PT-АС проводили с использованием лабораторного разработали MATLAB кода.

  1. Загрузите видео-файл для извлечения изображений. Для каждого изображения [см рисунок 2 (а) для репрезентативного изображения], получаем усредненную картину рассеяния путем вычисления среднего значения из значений пикселов вдоль вертикального направления [Рисунок 2 (б, в)].
  2. Вычислить преобразование Фурье усредненной картины рассеяния, и вычислить фазу на пике пространственной частоты. Выполните эти операции для всех кадров всех записанных изображений.
  3. Используя значения фазы, полученной из всех изображений, построить временную фазуколебание [Рисунок 2 (г)]. Обратите внимание, что фаза меняется на частоте модуляции РТ. Возьмем преобразование Фурье фазовой флуктуации во временной области, и получить величину на частоте модуляции. Этот сигнал называется PT-AS сигнал [Рисунок 2 (е)].
  4. Мера [Hb] образца крови путем преобразования его сигнал PT-AS в соответствующий [Hb] с помощью калибровочной кривой, которая получена в Протоколе 5.

5. PT-AS Калибровка

  1. Подготовка образцов крови, имея [Hb] значения, которые равномерно распределены в диапазоне обнаружения датчика PT-AS (например, 0 - 18 г / дл).
  2. Перед калибровкой количественной оценки [Hb] значения образцов с использованием анализатора ссылка гематологии. Измерение сигналов PT-AS образцов.
  3. Выведите калибровочной кривой, относящейся [Hb] к сигналу PT-AS посредством выполнения линейных наименьших квадратов, [Hb] = A [PT-AS Signal] + B, из experimentaл результаты. Для условий эксплуатации , указанных в таблице 1, было обнаружено , что соотношение между [Hb] и сигнал ПТ-АС , чтобы быть [Hb] = 5,13 [СТ-АС сигнал] - 0,09. Использование MATLAB код для выполнения линейной аппроксимацией.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Пробирного гемоглобин проводили с использованием датчика PT-AS, и его измерения были сопоставлены с данными из гематологического анализатора. Эксперимент проводился с интенсивностью света PT возбуждения 1,4 Вт / см 2, PT частота модуляции 2 Гц и времени измерения 5 сек. В таблице 1 приведены экспериментальные условия. Размеры пучка зонда и ПТ возбуждения света были 5,5 и 2 мм, соответственно. Веб-камера записаны изображения с частотой кадров 30 кадров в секунд...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Датчик PT-AS представляет собой все-оптический метод, способный прямого [Hb] измерения необработанных образцов крови. Метод квантифицирует [Hb] в крови с использованием собственного ответа PT молекул гемоглобина в эритроцитах. При освещении 532 нм света, молекулы Hb поглощают энергию света и производства тепла. Возвышение результирующее значение температуры изменяет RI образца крови. Высокая чувствительность RI из BSI была использована для измерения этого изменения RI в крови. Ранее нами было показано, что датчик ПТ-АС ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Конфликт интересов не декларируется.

Благодарности

Это исследование было поддержано исследовательскими программами Национального исследовательского фонда Кореи (NRF) (NRF-2015R1A1A1A05001548 и NRF-2015R1A5A1037668).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Лазерная указка 650 нмLASMACLED-1Зонд свет
Полые круглые стеклянные капиллярыVitroComCV2033Контейнер для образцов крови
Веб-камераLogitechC525CMOS Оптический датчик
Оптическая система прерывателейThorlabsMC2000-ECОптический измельчитель
Пластиковый длиннопроходный фильтрEdmund Optics#43-942Для отторжения 532 нм PT возбуждение легкий
волоконный зажимThorlabsSM1F1-250Приспособление для капиллярной трубки
Пробирка для забора крови с покрытием EDTAGreiner Bio-OneVACUETTE 454217Анализатор для забора крови и антикоагулянтный
гематологический анализаторSiemens AGADVIA 2120iРеференсный гематологический анализатор

Ссылки

  1. Mokken, F. C., Kedaria, M., Henny, C. P., Hardeman, M., Gelb, A. The clinical importance of erythrocyte deformability, a hemorrheological parameter. Ann. Hematol. 64 (3), 113-122 (1992).
  2. Rosenblit, J., et al. Evaluation of three methods for hemoglobin measurement in a blood donor setting. Sao Paulo Medical Journal. 117 (3), 108-112 (1999).
  3. Van Kampen, E., Zijlstra, W. Standardization of hemoglobinometry II. The hemiglobincyanide method. Clin. Chim. Acta. 6 (4), 538-544 (1961).
  4. Billett, H. H. Hemoglobin and hematocrit. Clinical Methods: The History, Physical, and Laboratory Examinations. 3, (1990).
  5. Kuenstner, J. T., Norris, K. H., McCarthy, W. F. Measurement of hemoglobin in unlysed blood by near-infrared spectroscopy. Appl. Spectrosc. 48 (4), 484-488 (1994).
  6. Zwart, A., et al. A multi-wavelength spectrophotometric method for the simultaneous determination of five haemoglobin derivatives. Clin. Chem. Lab. Med. 19 (7), 457-464 (1981).
  7. Kwak, B. S., et al. Direct measurement of the in vitro hemoglobin content of erythrocytes using the photo-thermal effect of the heme group. Analyst. 135 (9), 2365-2371 (2010).
  8. Lapotko, D., Lukianova, E. Laser-induced micro-bubbles in cells. International Journal of Heat Mass Transfer. 48 (1), 227-234 (2005).
  9. Lapotko, D. O. Laser-induced bubbles in living cells. Lasers in surgery and medicine. 38 (3), 240-248 (2006).
  10. Lapotko, D. O., Romanovskaya, T. yR., Shnip, A., Zharov, V. P. Photothermal time-resolved imaging of living cells. Lasers in surgery and medicine. 31 (1), 53-63 (2002).
  11. Yim, J., et al. Photothermal spectral-domain optical coherence reflectometry for direct measurement of hemoglobin concentration of erythrocytes. Biosens. Bioelectron. 57, 59-64 (2014).
  12. Kim, U., et al. Capillary-scale direct measurement of hemoglobin concentration of erythrocytes using photothermal angular light scattering. Biosens. Bioelectron. 74, 469-475 (2015).
  13. Sørensen, H. S., Larsen, N. B., Latham, J. C., Bornhop, D. J., Andersen, P. E. Highly sensitive biosensing based on interference from light scattering in capillary tubes. Appl. Phys. Lett. 89 (15), 151108(2006).
  14. Swinney, K., Markov, D., Bornhop, D. J. Ultrasmall volume refractive index detection using microinterferometry. Rev. Sci. Instrum. 71 (7), 2684-2692 (2000).
  15. Tarigan, H. J., Neill, P., Kenmore, C. K., Bornhop, D. J. Capillary-scale refractive index detection by interferometric backscatter. Anal. Chem. 68 (10), 1762-1770 (1996).
  16. Bornhop, D. J., et al. Free-solution, label-free molecular interactions studied by back-scattering interferometry. science. 317 (5845), 1732-1736 (2007).
  17. Yang, X., et al. Simple paper-based test for measuring blood hemoglobin concentration in resource-limited settings. Clin. Chem. 59 (10), 1506-1513 (2013).
  18. Zhu, H., et al. Cost-effective and rapid blood analysis on a cell-phone. Lab Chip. 13 (7), 1282-1288 (2013).
  19. Pogačnik, L., Franko, M. Detection of organophosphate and carbamate pesticides in vegetable samples by a photothermal biosensor. Biosens. Bioelectron. 18 (1), 1-9 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Быстрой и Бесхимический Гемоглобин Анализ с фототермического углового рассеяния света
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.