Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

In Vitro Дифференциация человеческого CD4 + FOXP3 + Индуцированные регуляторных Т - клеток (iTregs) от наивных CD4 + Т - клеток с использованием TGF-β-содержащего протокол

20.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55015

⸱

30 декабря 2016 г.

 ,  ,  , 
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает воспроизводимую генерацию и фенотипирования человеческих индуцированных регуляторных Т - клеток (iTregs) от наивных CD4 + Т - клеток в пробирке. Различные протоколы для индукции FOXP3 позволяют для изучения конкретных фенотипов iTreg, полученных с помощью соответствующих протоколов.

Аннотация

Регуляторные Т-клетки (Tregs) являются неотъемлемой частью периферической толерантности, подавляя иммунные реакции против собственных структур и, таким образом, предотвращая аутоиммунные заболевания. В настоящее время разрабатываются клинические подходы к адоптивному переносу Tregs или истощению Tregs при раке с многообещающими первыми результатами.

Поскольку количество встречающихся в природе Tregs (nTregs) очень ограничено, изучение определенных особенностей Treg с использованием in vitro индуцированных Tregs (iTregs) может быть полезным. На сегодняшний день лучшим, хотя и не абсолютно специфичным белковым маркером для обозначения Tregs является транскрипционный фактор FOXP3. Несмотря на важность Tregs, включая неизбыточные роли периферически индуцированных Tregs, протоколы генерации iTregs в настоящее время являются спорными, особенно для клеток человека. Таким образом, данный протокол описывает in vitro дифференцировку человеческих CD4+FOXP3+ iTregs из наивных Т-клеток человека с использованием ряда Treg-индуцирующих факторов (TGF-β плюс только IL-2 или их комбинацию с ретиноевой кислотой, рапамицином или бутиратом) параллельно. В ней также описывается фенотипирование этих клеток с помощью проточной цитометрии и qRT-PCR.

Эти протоколы приводят к воспроизводимой экспрессии FOXP3 и других генов сигнатуры Treg и позволяют изучать общие регуляторные механизмы FOXP3, а также специфичные для протокола эффекты для определения влияния определенных факторов. iTregs могут быть использованы для изучения различных фенотипических аспектов, а также молекулярных механизмов индукции Treg. Детальные молекулярные исследования облегчаются за счет относительно большого количества клеток, которые могут быть получены.

Ограничением для применения iTregs является относительная нестабильность экспрессии FOXP3 в этих клетках по сравнению с nTregs. iTregs, сгенерированные этими протоколами, также могут быть использованы для функциональных анализов, таких как изучение их подавляющей функции, в которых iTregs, индуцированные TGF-β плюс ретиноевая кислота и рапамицин, демонстрируют превосходную подавляющую активность. Тем не менее, подавляющая способность iTregs может отличаться от nTregs, и использование соответствующих средств управления имеет решающее значение.

Введение

CD4 + CD25 + FOXP3 + регуляторные Т - клетки (Tregs) подавляют другие иммунные клетки и являются критическими медиаторами периферической толерантности, предотвращая аутоиммунные и чрезмерное воспаление 1. Важность Tregs можно проиллюстрировать на примере человеческой болезни immunodysregulation polyendocrinopathy энтеропатия Х-хромосомой синдромом (IPEX), в котором потеря Tregs из-за мутаций в `master' Treg фактора транскрипции Forkhead коробки P3 (FOXP3) приводит к тяжелым системным аутоиммунным заболеванием, летальной в раннем возрасте. Тем не менее, Tregs действовать как обоюдоострый меч в иммунной системе , поскольку они также могут препятствовать противоопухолевый иммунитет в определенных условиях 2. Терапевтическая манипуляция числа Treg и функции, поэтому предметом многочисленных клинических исследований. При раке, истощение Tregs может быть желательным и некоторый успех клинических подходов стимулирует дальнейшие исследования 3. При аутоиммунных и воспалительных заболеваний, в дополнение к терапевтическим эффектам Tregs в Seveмодели заболевания RAL мыши, недавние первые испытания в-человека усыновителей передачи Treg для предотвращения трансплантат против -host (РТПХ) 4 - 7 и для оценки безопасности при лечении диабета типа 1 8 показали весьма обнадеживающие результаты.

Встречающиеся в природе Tregs (nTregs) содержат тимуса производные tTregs и периферического индуцированные pTregs, с нерезервированных важных функций в поддержании здоровья 9 - 11. Тем не менее, цифры nTreg ограничены, поощряя дополнительный подход индукции Tregs (iTregs) в пробирке из наивных предшественников Т - клеток 12. Тем не менее устойчивость iTregs, предположительно , из - за отсутствия деметилирования в так называемой Трег-специфической деметилируется области (TSDR) в гене FOXP3 локуса 13, остается проблемой , и некоторые исследования указывают на то, что в естественных условиях индуцированной Tregs более стабильны 14.

На сегодняшний день FOXP3 остается лучшим белком мarker для Tregs , но это не совсем специфический , потому что человеческие обычные CD4 + CD25- Т - клетки скоротечно выражают промежуточные уровни FOXP3 при активации 15,16. Несмотря на значительный прогресс был достигнут в выяснении регуляции экспрессии FOXP3, многое еще предстоит открыть в отношении индукции, стабильности и функции FOXP3 особенно в клетках человека. Несмотря на различия в nTregs, в пробирке индуцированной FOXP3 + CD4 + Т - клетки могут быть использованы в качестве модельной системы для изучения молекулярных механизмов индукции FOXP3 и в качестве отправной точки для разработки протоколов в будущем , которые позволяют поколения iTregs, которые более похожи на в Vivo сгенерированный Tregs, который может быть применим для усыновителей стратегий передачи в будущем.

Там нет `золотой standard' протокол , чтобы побудить человека iTregs, и в настоящее время протоколы были разработаны на основе имитируя Treg-индуцирующие условия в естественных условиях: интерлейкин - 2 (IL-2) И трансформирующий фактор роста β (TGF-β) сигнализации имеют решающее значение для FOXP3 индукции в естественных условиях 17, и все-транс - ретиноевой кислоты (ATRA) - который производится в естественных условиях с помощью связанной с кишечником дендритных клеток - часто используется для повышения индукции FOXP3 в пробирке 18 - 21. Мы разработали дополнительные человеческие Трег индуцирующего протоколы с использованием бутират 22, кишечную флору, происходящей с короткой цепью жирной кислоты , что недавно было показано , чтобы увеличить мышиный Treg индукции 23,24. Мы также недавно установили новый протокол для генерации iTregs с превосходной функцией подавляющих в пробирке, используя комбинацию TGF-бета, ATRA и рапамицина 22, причем последний клинически одобрен целевой рапамицина у млекопитающих (МРМ) ингибитор , который , как известно, содействовать техническое обслуживание FOXP3 в процессе расширения Treg человека 25,26.

Этот метод описывает воспроизводимавитро поколение человеческого CD4 + FOXP3 + iTregs с использованием набора различных условий, и их последующего фенотипирования с помощью проточной цитометрии и количественной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (QRT-PCR) , чтобы выявить закономерности , специфичные для протокола экспрессии FOXP3 и других Treg молекул подписи таких , как CD25, CTLA-4, EOS, а также репрессии IFN-gamma и экспрессии SATB1 22. Сформированные клеточные популяции могут быть использованы для функциональных анализов в отношении супрессивной активности или для молекулярных исследований, либо в отношении общих регуляторов FOXP3 или для изучения эффектов, характерных для определенных соединений, таких как бутират или рапамицином. Дальнейшее понимание молекулярных механизмов вождения Treg дифференциации является весьма актуальным для будущих терапевтических подходов в аутоиммунитета или рака специфически молекул-мишеней, участвующих в генерации и функции Treg.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Человеческие мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) были выделены из свеже анонимными здорового донора лейкоцитарных пленок, приобретенные в университетской больнице Karolinska, Швеция. Этическое разрешение для проведения экспериментов была получена из регионального совета этической экспертизы в Стокгольме (Regionala etikprövningsnämnden я Стокгольм), Швеция (номер официального утверждения: 2013 / 1458-31 / 1).

1. T Выделение клеток из периферической крови

  1. РВМС Изоляция
    1. Предварительно проложите 15 мл плотность центрифугирование среды (например, Ficoll) раствор в 50 мл пробирки (5 труб в лейкоцитарной пленки). Предварительно нагреться до комнатной температуры.
    2. Заполните поглощающее покрытие с фосфатным буферным раствором (PBS) (при комнатной температуре) до 180 мл. Если свежую кровь используется, разбавить кровь с равным объемом PBS.
    3. Наклон трубки в сторону и медленно наложения плотности центрифугирования среды с ~ 35 мл разведенной крови в пробирку. Добавьте кровь очень осторожно, без какого-либо смешивания центрифугирование в градиенте плотности медианыНМУ фазы и слоя крови.
    4. Центрифуга 20 мин при 1150 х г при комнатной температуре без тормоза. Используйте центрифугу без тормоза и, если это возможно с низкого до среднего ускорения для предотвращения смешивания слоев.
    5. Выньте белое кольцо, содержащее МНПК между плотностью центрифугирование среды и плазменной фазы. Переезд в новый 50 мл пробирку (1 раз с 5 мл пипетки и 2 раза с 2 мл пластиковой пипетки Пастера). Возьмите как можно меньше и плотность плазмы центрифугирование среды. Не прикасайтесь к красной эритроцита осадок.
    6. Вымойте МНПК. Разделить МНПК в 50 мл пробирки (4 пробирки в лейкоцитарной пленки). Заполните каждый до 50 мл PBS.
    7. Центрифуга 450 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре.
    8. Снимите и выбросьте супернатант, пул клеток в 1 пробирку с 10 мл RPMI / 10% сыворотки плода коровы (FCS) среды и ресуспендируют хорошо. Если скопления клеток присутствуют, штамм клетки через клеточный фильтр 40 мкм.
    9. Передача клеток в Т175 колбу для культивирования клеток для объявлениякогерентные клетки. Промыть пробирки с 40 мл среды, и в сочетании с клетками (всего 50 мл). При необходимости, удалить аликвоту для анализа потока цитометрии (см шаг 1.4). Как правило, CD4 + Т - клетки содержат около 30-40% клеток в лимфоцита ворот, и наивные Т - клетки содержат приблизительно от 30 до 60% CD4 + Т - клеток в зависимости от донора.
    10. Инкубируйте клетки в прокладке флаконах в течение 45 до 90 мин при 37 ° C / 5% CO 2. Этот шаг будет истощать моноциты пластическим приверженностью. Это не является обязательным, но будет увеличить процент T выхода клеток в расчете на количество МНПК в следующих шагах.
    11. Ресуспендируют клетки (в 50-мл среды, содержащийся в колбе) и полоскание клеточный слой на дне колбы хорошо. Распределить клетки на две равные части по 50 мл пробирки (предыдущие трубки могут быть повторно использованы для того же донора). Промыть колбу с 50 мл свежей RPMI 10% среды / FCS, а также передавать в равной мере в те же 2 трубок.
      Примечание: МНПК могут храниться в течение ночи при 4 ° С с трубки возложениесторона, или, в идеале, непосредственно использовали для выделения Т-клеток.
  2. nTreg Выделение с помощью магнитно-активированная сортировка клеток
    1. Готовят буфер изоляции: 0,5% (вес / объем) человеческого сывороточного альбумина и 2 мМ ЭДТА в PBS. Всегда держите буфера при 4 ° С. В качестве альтернативы человеческого альбумина, используют бычий альбумин.
    2. Ресуспендируют и считать МНПК с автоматическим или ручным счетчиком клеток в присутствии трипанового синего (не считать небольших тромбоциты). Если наблюдаются скопления клеток, штамм клетки через клеточный фильтр 40 мкм.
    3. Центрифуга МНПК при 450 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    4. Ресуспендируют клеток (1 мл пипетки) в 90 мкл буфера для изоляции на 10 7 МНПК для получения суспензии отдельных клеток. Держите клетки в исходных 50 мл пробирки (2 пробирки в лейкоцитарной пленки).
    5. Добавляют 2 мкл CD25 шариков на 10 7 клеток, перемешивают и инкубируют в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
    6. Заполните PBS до 30 мл. Центрифуга при 450 х г в течение 10 мин при 46; С.
    7. Подготовка LS колонны (2 на лейкоцитарной пальто): уравновешиваться с 3 мл буфера изоляции, и отбросить поток через. Трубы могут быть повторно использованы для полосканий дополнительных столбцов.
    8. Ресуспендируют клеток в 3 мл буфера для изоляции на пробирку (1 мл пипеткой). Передача клетки LS колонки, а также собирать поток через в свежих 15 мл пробирки.
    9. Промыть 50 мл пробирки с 2 мл буфера изоляции каждого из них. Передача ополаскивания буфер столбцов.
    10. Промыть колонки 2x с 3 мл Isolation буфер каждый. Всегда ждать, пока колонна не будет остановлено капает, перед добавлением новой жидкости. Хранить поток через при температуре 4 ° С в течение последующих шагов.
    11. Удалить столбец из магнита. Элюировать 2x с 3 мл буфера изоляции на колонку в 15 мл пробирку.
      Примечание: Элюат из 2-х колонок на донора могут быть объединены. Не опускайте колонку в жидкость.
    12. Подготовьте и уравновешивают новые столбцы LS (1 столбец на лейкоцитарной пленки). Передача элюата из 1.2.11 в колонну. Проточные может быть отброшен. После того, как элюат имеет раззёd через колонку, прополоскать трубку и мыть колонки 3 раза с 3 мл буфера для изоляции.
      Примечание: Второй столбец жизненно необходимы для повышения чистоты.
    13. Удалить столбец из магнита. Элюции CD25 ++ "nTregs" 2x с 3 мл буфера изоляции.
    14. Центрифуга при 450 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатант полностью.
    15. Промыть клетки с 15 мл Т-клеточной культуральной среды, центрифуге при 450 х г в течение 10 мин при 4 ° C. Удалить супернатант полностью.
    16. Ресуспендируют клеток в 0,5 мл Т-клеточной культуральной среды, дополненной 100 МЕ / мл IL-2, каждая. Передача клетки на 24-луночный планшет. Полоскание трубка с 0,5 мл среды (+ 100 МЕ / мл ИЛ-2) и объединить в 24-луночный планшет.
    17. Граф nTregs (как в шаге 1.2.2). Выход обычно составляет около 1-4 х 10 6 Tregs в лейкоцитарной пальто. Регулировка плотности Tregs до 1-2 х 10 6 клеток / мл с помощью Т - клеточной культуральной среды + 100 МЕ / мл IL-2.
    18. Выдержите Tregs при 37 ° C / 5% CO 2 до использования.
  3. Наивные CD4 + T Выделение клеток с помощью магнитно-активированная сортировка клеток
    Примечание: Возьмите поток через со стадии 1.2.8-1.2.10 продолжить выделения клеток. В качестве альтернативы, если не было выделено ни одного nTregs, переходите непосредственно из МНПК.
    1. Объединить 2 труб в донора Treg-истощенных МНПК в 50 мл трубки. Залить PBS до 50 мл при комнатной температуре.
    2. Центрифуга МНПК при 200g в течение 5-10 мин при комнатной температуре. Снимите и выбросьте супернатант. Ресуспендируют клеток в 50 мл PBS.
    3. Повторите шаг 1.3.2 дважды.
      Примечание: Промывки PBS имеют решающее значение для удаления тромбоцитов, которые не будут удалены со следующим комплектом отрицательной изоляции. Тромбоциты остаются в надосадочной жидкости при этом низкоскоростным центрифугированием. истощение тромбоцитов можно контролировать в отдельных шагов на предметное стекло. Эти шаги должны быть выполнены с PBS и центрифугированием при комнатной температуре.
    4. Ресуспендируют МНПК в 50 мл PBS. Граф клеток, как в шаге 1.2.2.
    5. Центрифуга МНПК при 450 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 40 мкл буфера для изоляции (4 ° С) на 10 7 клеток.
    6. Добавляют 10 мкл наивных CD4 + Т - клеток биотин-антитело Коктейль II на 10 7 клеток.
    7. Смешать и инкубировать в течение 10 мин при 4 ° С.
    8. Промыть клеток путем добавления 40 мл PBS (4 ° С), и центрифуге при 450 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в 80 мкл буфера для изоляции на 10 7 клеток.
    9. Добавьте 20 мкл анти-биотин микрошариков на 10 7 клеток. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 мин при 4 ° C.
    10. Наполните до 50 мл холодного PBS, и центрифуга 450 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
    11. Подготовка LS колонны (уравновешиваться с 3 мл буферного раствора изоляции). Для того, чтобы избежать перегрузки колонки, используйте один столбец для максимально 250 х 10 6 МНПК, или меньше , если МНПК содержат много красных кровяных телец.
    12. Удалить супернатант и ресуспендируют гргезов в буфере 3 мл изоляции. Передача клетки в колонку LS. Собирают поток через, который содержит наивных CD4 + Т - клеток, в 15 мл пробирки.
    13. Промыть пробирку с буфером изоляции 2 мл. Передача в колонну.
    14. Мытье колонки 3x с 3 мл буфера для изоляции. Всегда ждать, пока колонна не остановится капает, перед добавлением новой жидкости.
    15. Возьмем поток через (наивных CD4 + Т - клеток) и центрифугу 450 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Колонки могут быть отброшены.
    16. Удалить супернатант полностью. Вымойте клеток с 15 мл среды, центрифуги 450 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре и полностью удалить надосадочную жидкость.
      Примечание: Выделение буфер содержит ЭДТА, который способствует образованию хелатных комплексов ионов кальция и, таким образом, снижает активацию Т-клеток. Перед любыми стимуляции анализов, удалить буфер изоляции полностью и промыть клетки дважды с 15 мл среды.
    17. Ресуспендируют клеток в Т - клеточной культуральной среде до 2-3 х 10 6 клеток на мл. Rest клетки в соответствующей колбе Oг и в течение ночи в инкубаторе. Если клетки используются непосредственно для стимуляции анализов, мыть их еще один раз со средой.
  4. Чистота управления Окрашивание
    1. Возьмите ~ 50000 клеток (Tnaïve; nTreg; МНПК) каждый, в 20 мкл.
      Примечание: Если оба Tnaïve и nTreg панели должны быть окрашены, возьмите 2 образцов каждый.
    2. Приготовьте 2x концентрированного премикса антитела (в PBS) в случае необходимости для инструмента, например: Tnaïve панель: CD4-PerCP 1: 5; CD45RA-FITC 1:10, CD45RO-PE 1: 5, CD8-eFlour450 1: 8. Для Treg панели, заменить CD45RO-PE с CD25-PE, 1:10.
      Примечание: Только определенные CD25 антитела, которые распознают различные эпитопы, чем CD25-микрогранул, могут быть использованы для окрашивания nTregs изоляции с CD25 микрогранул.
    3. Добавить 20 мкл премикс антитела к 20 мкл клеток. Также готовят одиночные окрашивании для каждого флуорохромом (используя образец , содержащий положительные клетки, например, МНПК) и неокрашенной образца для проточной цитометрии НастройGS и компенсации.
    4. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
    5. Заполните каждую пробу 200 мкл PBS, и центрифуга 450 мкг в течение 5-10 мин.
    6. Поднимают клетки в флюоресценции активированной сортировки клеток (FACS) буфер (= изоляция буфера без ЭДТА) и анализируют с помощью проточной цитометрии. Чистота наивных CD4 + Т - клеток, как правило , > 95% (рисунок 2).

2. Трег Индукционная Культура

  1. Получение стимуляции медиа и планшеты
    1. Подготовка и предварительно теплой Т-клеточной культуральной среды: бессывороточной гемопоэтические среде с добавлением 2 мМ L-аланил-L-глутамина.
    2. Подготовить цитокин, антитела стимуляции и соединение концентрации запасов.
      1. Приготовьте IL-2 маточного раствора: 400000 МЕ / мл в стерильно отфильтрованного (с кислотостойкой фильтром) 100 мМ уксусной кислоты (167 мкг / мл, если активность использованного лота составляет 2 400 МЕ на 1 мкг; подтвердить с поставщиком). Алиготе в стерилизованной с низким содержанием белка связывания 0,5 мл пробирки, печать с Parafilm, заморозить на сухом льду и хранят при температуре -80 ° С в течение длительного хранения или при -20 ° С в течение до 3-х месяцев.
      2. Приготовьте TGF- 1 маточного раствора (10 мкг флакон, без носителя): Центрифуга TGF-β1 порошок (1000 XG 3 мин), добавляют 100 мкл 4 мМ HCl (стерильно фильтруют с кислотостойкой фильтром) для подготовки исходного раствора с 100 мкг / мл, позволяют полностью раствориться; вихря. Алиготе 5 мкл каждого к стерилизованной низкого связывания с белками 0,5 мл пробирки, печать с Parafilm, заморозить на сухом льду и хранят при температуре -80 ° С в течение до 6 месяцев.
      3. Подготовка ATRA маточного раствора: Растворите порошок при концентрации 20 мг / мл (66,6 ммоль) в ДМСО. Подготовка исходного раствора 10 мМ последующим разбавлением в ДМСО и хранить аликвоты, защищенном от света месте, при температуре -80 ° С в течение до 1 года. ATRA чувствителен к свету, теплу и воздуха.
      4. Готовят рапамицин маточного раствора: 1 мг / мл (1,11 мМ) в ДМСО, хранить в виде аликвот при -80 ° С в течениедо 1 года.
      5. Подготовка бутират натрия маточный раствор: 0,908 М (0,1 мл / мг) запас в стерильной сверхчистой H 2 O и стерильный фильтр. Алиготе и хранить при температуре -20 ° C.
    3. Готовят 4x концентрированные премиксы (50 мкл на лунку) в Т - клеточной культуральной среды, описанной в таблице 1.
    4. В предыдущий день, пальто пластины с анти-CD3 антителом. Шерсть нужное количество лунок с 96 U-луночный планшет с 5 мкг / мл анти-СD3-антителом в PBS, 65 мкл / лунку. Заверните пластинку с фольгой и инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте маржинальные лунки 96-луночных планшетов. Более крупные скважины могут быть использованы, но U-образных скважин облегчают использование одних и тех же количества клеток на единицу площади через экспериментов. Если требуется большее количество ячеек, объединять необходимое количество скважин после культивирования. Как правило, через 4-6 дней расширения, 2 скважины каждого образца достаточным для проведения анализа проточной цитометрии и анализа РНК.
      1. В день посева, незадолго до посева, удалить анти-CD3 Раствор из скважин. Заполните лунки с 200 мкл / лунку PBS. Удалить PBS. Повторите промывание с 200 мкл / лунку PBS. Удалить PBS полностью и немедленно использовать пластины.
    5. Подготовьте пластины (не используйте маржинальные скважин):
      1. Для каждой лунки добавляют по 50 мкл 4x анти-CD28 / IL-2 премикса (за "нестимулированных" клетках, за исключением, добавьте T среда для культивирования клеток), 50 мкл 4x TGF- 1 премикса (для всех iTregs) или 50 мкл культуры Т-клеток среда для "только стимуляции" притворной контроля, 50 мкл 4x ATRA, ATRA / рапамицина или бутират премикса (где это применимо) или средней
      2. Заполните все пустые скважины, в том числе маржинальных скважин, с 200 мкл PBS. Предварительно теплые пластины при температуре 37 ° C / 5% CO 2.
  2. Приготовьте Наивные Т - клетки для гальванических
    1. После того, как покоящиеся клетки, передать в 15 мл пробирку, прополощите колбу / колодцы с подогретым Т клеточной культуральной среды и бассейна к трубе. Загрузочная трубка 15 мл с помощью Т-клеточной культуральной среды.
    2. Центрифуга клетки при 450 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре.
    3. Удалите среду и занимают клетки в свежей, подогретого Т - клеточной культуральной среде до плотности 2,2-2,6 × 10 6 / мл. Граф клеток, как в шаге 1.2.2 и регулировать плотность при необходимости.
    4. Добавить клетки подготовленных стимуляции пластин (см 2.1), 50 мкл клеток / лунку (110,000-130,000 клеток / лунку). Каждая скважина должна теперь содержать общий объем 200 мкл.
    5. Оберните пластин в алюминиевой фольгой для защиты от света ATRA; инкубировать при 37 ° C / 5% CO 2 в течение желаемого периода времени.
  3. Монитор Treg Induction Культура
    1. Монитор Treg культур с помощью световой микроскопии (40х увеличение). Примерно день от 2 до 3, небольшие кластеры пролиферирующих клеток должны стать видимым, которые сливаются в более крупные кластеры в более поздние моменты времени. Культуры, выращенные с рапамицина в целом растут меньше. Смотрите также Рисунок 3.
    2. В желаемые моменты времени, берут пробы для РНК еxtraction или проточной цитометрии фенотипирования (смотри ниже). Для более поздних временных точках с клеточной пролиферации, 1 а каждый достаточно, в противном случае принять 1 х 10 5 -1 × 10 6 ячеек , каждая из РНК и 3 × 10 5 -1 × 10 6 клеток для проточной цитометрии.
  4. Оценка стабильности FOXP3
    1. Для оценки стабильности фенотипа iTreg , как описано выше 22,27, моют iTregs дважды с Т - клеточной культуральной среды, и культуры iTregs далее в Т - клеточной культуральной среде , либо без или с анти-CD3 и анти-CD28 рестимуляции , как описано в разделе 2.1 и 2.2 , Добавить цитокины, такие как 50 МЕ / мл IL-2, чтобы изучить их влияние на стабильность FOXP3.
    2. В желаемые моменты времени, берут пробы для экстракции РНК, проточной цитометрии фенотипирования (смотри ниже), а также анализ TSDR метилирования , как описано 22,28.

3. Фенотипическая Анализ iTregs по QRT-PCR

  1. Подготовкаобразцы
    1. В желаемые моменты времени, возьмите 1 х 10 5 до 1 × 10 6 клеток на образец для экстракции РНК. Передача клетки к РНКазы 1,5 мл трубки и центрифуге при 500 мкг в течение 5 мин.
    2. При необходимости удалить часть надосадочной жидкости и замораживать для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) или аналогичного анализа. Полностью удалить оставшиеся супернатант из клеток. Перейдем непосредственно к экстракции РНК или замораживать осадок клеток на сухом льду и хранят при -20 ° C до -80 ° C в течение до 2-х недель.
    3. Извлечение РНК и выполнять QRT-PCR для FOXP3 и гена домашнего хозяйства (например, RPL13A) в соответствии со стандартными протоколами. Кроме того, измеряют экспрессию других генов подписи Treg (например , `Трег up' гены IL2RA, CTLA4, IKZF4 и` Treg down' генов IFNG, SATB1).

4. Анализ фенотипа с помощью проточной цитометрии

Примечание: Этот протокол оптимизирован для окрашиванияING в формате плашки 96U с 3 х 10 5 -1 × 10 6 клеток. Если есть меньше клеток на лунку, начинают с нескольких скважин и бассейна, как описано ниже.

  1. Cell рестимуляции (Необязательно)
    1. Если окрашивание на внутриклеточные цитокины желательно, импульсные клетки ПМЯЛ 12-миристат-13-ацетата (РМА) / Ionomycin в присутствии ингибитора белка переноса.
      Примечание: Эта процедура не влияет на экспрессию FOXP3 в вышеописанных культурах iTreg, но и другие маркеры могут измениться - например, CD4 подавляется.
    2. Подготовка 10x брефелдин A / PMA / Ionomycin премикса (20 мкл на лунку) в Т-клеточной культуральной среде: брефелдин маточного раствора 1: 100, Ionomycin (запас 5 мкг / мкл) 1: 1300, ПМА (запас 12,35 мкг / мкл, предварительно -dilute 1: 1235) 1: 100 предварительно разбавлено складе.
    3. За 4 часа до окрашивания, добавьте 20 мкл брефелдин A / PMA / Ionomycin 10x смеси в каждую лунку для получения конечной концентрации 1: 1000 брефелдин А, 0,5 μМ (375 нг / мл) Ionomycin, 10 нг / мл РМА.
    4. Выдержите в течение 4 часов при температуре 37 ° C / 5% CO 2
  2. Поверхность Окрашивание
    ПРИМЕЧАНИЕ: На панели предлагается здесь предложение; другие панели могут быть использованы в зависимости от антигенов, представляющих интерес и настроек прибора.
    1. Прохладный PBS на льду. Подготовка FACS буфера (PBS с добавлением 0,5% человеческого сывороточного альбумина, HSA) и охлаждают на льду. БСА или ФБС, могут быть использованы в качестве альтернативы HSA.
    2. клетки Re-пластины Окрашивание пластины: Ресуспендируют клеток с помощью пипетки и переносят клетки в новую луночного планшета 96U, оставляя один хорошо свободный вокруг каждой скважины (для предотвращения перетекания в последующей процедуре окрашивания). Если меньше, чем необходимо, количество клеток, присутствуют в исходной скважине, удалить часть надосадочной жидкости перед тем взмучивания и пул нескольких скважин в окрашивании хорошо.
    3. Центрифуга пластина 400 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре.
    4. Удалить супернатант. Вылить надосадочную жидкость в коробку отходов, оставьте тарелку вверхвниз и немедленно (не оборачиваясь пластину) нажмите один раз на пластину фильтровальной бумаги. Затем сразу же повернуть пластину. Vortex пластины для ресуспендирования клеток в оставшейся жидкости.
    5. Добавить 25 мкл поверхностного окрашивания премикса (CD25-PE 1:20, CD4-PerCP 1: 5 в буфере FACS) и ресуспендируют.
      Примечание: Кроме того, включать одиночные окрашивании для каждого из используемых люминофоры с образцами, содержащими положительные клетки для соответствующего антигена; и включают неокрашенной образец. Они будут необходимы для установки компенсации инструмента. В качестве альтернативы, использовать компенсационные шарики.
    6. Выдержите 30 мин при 4 ° С в темноте.
    7. Добавить 200 мкл PBS, центрифуга пластины 400 мкг в течение 10 мин при 4 ° С и удаления надосадочной жидкости, как описано на этапе 4.2.4. Vortex пластины.
    8. Повторите шаг 4.2.7 дважды.
  3. Жизнеспособность Окрашивание
    Примечание: Жизнеспособность окрашивание является необходимым, так как после фиксации / пермеабилизации мертвые клетки не могут быть в достаточной степени исключеныЛПС / ССК и может привести к возникновению неспецифических сигналов. Поправимо жизнеспособность краситель должен быть использован.
    1. Ресуспендируют клеток в 130 мкл жизнеспособность красителя премикса (поправимо жизнеспособность красителя eFlour780 1: 1,400 в PBS) и сразу ресуспендирования клеток с многоканальной пипеткой.
      Примечание: Кроме того, включать одну окрашивание для жизнеспособности красителя , содержащего мертвые клетки, например, нестимулированных Т - клетки культивировали в течение нескольких дней или убивают клетки путем применения тепла , как по инструкции производителя. Они будут необходимы для компенсации.
    2. Выдержите 30 мин при 4 ° С в темноте.
    3. Центрифуга пластины при 400 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатант, как на этапе 4.2.4. Vortex пластины.
    4. Залить 200 мкл FACS буфера. Повторите шаг 4.3.3.
    5. Залить 200 мкл PBS. Повторите шаг 4.3.3.
  4. Внутриклеточные Окрашивание с FOXP3 окрашивающего буфера Set
    1. Для каждой лунки, подготовить: 150 мкл Fix / Пермь буфера (разбавленным Фикс / Пермь концentrate 1: 4 с растворителем); 850 мкл 1x пермеабилизации буфер (разбавленные 10х буфера пермеабилизирующего 1:10 сверхчистой H 2 O).
    2. После встряхивания ресуспендирования клеток в 150 мкл Fix / Пермский буфер и сразу ресуспендирования с пипеткой. Важно, чтобы сразу ресуспендирования, чтобы избежать фиксации клеточных комочков.
      Внимание: Закрепление буфер содержит параформальдегида и должны быть обработаны и отбрасывают соответствующим образом.
    3. Выдержите 30 мин при 4 ° С в темноте.
    4. Добавьте 100 мкл холодного PBS. Центрифуга при 850 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
      Примечание: С этого шага вперед скорость центрифугирование увеличивается, чтобы избежать потери клеток. После фиксации клетки становятся невидимыми и следует соблюдать осторожность, чтобы удалить супернатанты, как описано в шаге 4.2.4 и сразу же после того, как центрифугирование закончена, чтобы минимизировать потери клеток.
    5. Удалить супернатант, как описано на этапе 4.2.4. Vortex пластины.
      Примечание: Окрашивание может быть приостановлена ​​на данном этапе; вэтот случай, промыть клетки дважды 200 мкл PBS; а затем взять в 250 мкл PBS и хранить при температуре 4 ° С, в защищенном от света месте. Клетки можно хранить в течение нескольких дней, а затем продолжить пермеабилизации. Тем не менее, оптимальные результаты достигаются, когда непосредственно продолжали пермеабилизации.
    6. После встряхивания добавляют 200 мкл буфера пермеабилизирующего. Центрифуга при 850 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатант, как описано на этапе 4.2.4. Vortex пластины.
    7. Добавить 200 мкл буфера пермеабилизирующего для ресуспендирования.
      Примечание: В данном случае образцы можно разбить на внутриклеточного окрашивания и контрольным образцом изотипа (отнять половину каждого образца). Если количество клеток являются предельными, объединенный образец изотипа могут быть получены (забрать 10-20 мкл каждого образца и бассейна). Кроме того, образцы могут быть приняты для флуоресценция-минус один (FMO) управления.
    8. Центрифуга при 850 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатант, как описано на этапе 4.2.4. Vortex пластины.
    9. Ресуспендируют осадок в44 мкл буфера плюс пермеабилизирующего 1 мкл сыворотки нормальная мышь (предварительно смешан), чтобы блокировать неспецифическое связывание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это применимо, если антитела, используемые на следующей стадии являются мышиного изотипа. Если другие антитела, такие как полученный из крыс, используются, включают соответствующую сыворотку для блокирования (например, крысы сыворотка).
    10. Инкубируйте при 4 ° С в течение 15 мин в темноте.
    11. Добавить антитела:
      Примечание: Запрос концентрации антител для конкретных лотов. Если это не сделано на шаге 4.2 с антителами к поверхностным антигенам (например, CD4) с соответствующими флуорохромии также включают в себя одиночные окрашивании для каждого из используемых люминофоры с образцами, содержащими положительные клетки для компенсации.
      1. Добавить 15 мкл премикса антител к образцам (за исключением отдельных окрашиванием, неокрашенных образцов, контрольных образцов изотипа и управления FMO): премикса на образце: 0,7 мкл (0,35 мкг) анти-Интерферон гамма (IFN-γ) -FITC (если применимо после рестимуляции ),2,3 мкл (0,115 мкг) CTLA-4 Brilliant Violet 421, 2 мкл (0,05 мкг) анти-FOXP3-APC, 10 мкл PBS.
      2. Для изотипа контрольные образцы, добавляют 15 мкл премикса изотипа антитела, с использованием тех же количеств антител, как и для антител, используемых в 4.4.11.1: премикса на образце: 0,7 мкл (0,35 мкг) мышь IgG1 K контрольного изотипа FITC (если это применимо), 0,58 мкл (0,115 мкг) мышь IgG2a-BV421 изотип, 0,5 мкл (0,05 мкг) мышь IgG1 K контроль изотипа APC, 13,2 мкл PBS.
      3. Для управления FMO, добавьте антитела, как в 4.4.11.1, заменяя одно антитело каждый с PBS.
    12. Инкубируют при температуре 4 ° С в течение 30 мин в темноте.
    13. Добавить 200 мкл буфера пермеабилизирующего. Центрифуга, удалить супернатант и вихрь, как на этапе 4.4.8. Повторить один раз.
    14. Ресуспендируют клеток в холодном буфере FACS (громкость в зависимости от используемого прибора) и приобретающие, в идеале сразу, на проточном цитометре.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 показана схема экспериментальной установки. На рисунке 2 показана репрезентативная контроля чистоты окрашивание на магнитно - обособленных наивных CD4 + Т - клеток и nTregs.

F igure 3A показывает проточной цитометрии стратегии стробирования и фигура 3В показывает представитель FOXP3 и CD25 проточной цитометрии окрашиванием на 6 -й день ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный протокол обеспечивает надежную индукцию человеческого CD4 + FOXP3 + iTregs от человека наивных CD4 + Т - клеток. Он включает в себя новый протокол , который мы описали в последнее время , с использованием комбинации TGF-бета, ATRA и рапамицином, для индукции iTregs с превосходной в пробирке функции 22 супрессивной. По сравнению с другими опубликованными протоколами, еще одним преимуществом является индукция различных популяций iTreg параллельно с различными протоколами, что позво...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Нина Нагель выражает благодарность за техническую помощь во время съемки видео и подготовки к экспериментам. Мы благодарим Еву-Марию Вайс за помощь в разработке протокола внутриклеточного окрашивания FOXP3, а также Элизабет Сури-Пайер и Нину Оберле за разработку протокола изоляции nTreg. Матильда Эрикссон и Пери Нури признаны за руководство лабораторией.

Финансирование: A.S. была поддержана Внутриевропейской стипендией Марии Кюри в рамках 7-й Рамочной программы Европейского сообщества, Фондом доктора Оке Олссона и исследовательскими фондами KI; A.S. и J.T. были поддержаны грантом CERIC (Центр передового опыта по исследованиям воспаления и сердечно-сосудистых заболеваний), J.T. был поддержан Vetenskapsrådet Medicine and Health (Dnr 2011-3264), Фонд Торстена Сёдерберга, FP7 STATegra, AFA Insurance и Стокгольмский окружной совет.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Полностью транс ретиноевая кислотаSigma AldrichR2625-50MG   
anit-human Foxp3-APC клон 236A/E7eBioscience17-4777-42
античеловеческий CD25 микрогранулыMiltenyi Biotec130-092-983
античеловеческий CD25-PEMiltenyi Biotec130-091-024
античеловеческий антитело CD28, LEAF Purified Biolegend302914
антитело к человеческому CD3, очищенное от листьев Biolegend317315
античеловеческий CD45RA, FITCMiltenyi Biotec130-092-247
античеловеческий CD45RO PE клон UCHL1BD Biosciences555493
античеловеческий CD4-PerCP клон SK3; mIgG1BD Biosciences345770
античеловеческий CD8-eFluor 450 (клон OKT8), mIgG2aeBioscience48-0086-42 
античеловеческий CTLA-4 (CD152), клон BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421BD Biosciences562743
античеловеческий клон IFN-g FITC 4S. В3; mIgG1keBioscience11-7319-81 
Брефельдин А-содержащий раствор: GolgiPlugBD Biosciences555029
набор для синтеза кДНК: SuperScript VILO(обратная транскриптаза) набор для синтеза кДНКInvitrogen11754-250
Плотность центрифугирующей среды: Ficoll-PaqueGE healthcare17-1440-03
DMSO 99,7%Sigma AldrichD2650-5X5ML
FBS, инактивированный при нагреваниикраситель Invitrogen10082-147
Fixable Viability Dye, eFluor 780   eBioscience65-0865-14 или 65-0865-18 
Foxp3 Staining Buffer SeteBioscience00-5523-00Внимание: содержит параформальдегид. Также можно купить в комбинированном наборе с антителами; 77-5774-40 Античеловеческий набор для окрашивания Foxp3 Клон APC: 236A/E7 Набор
GlutaMAX (200 мМ L-аланил-L-глутамин)Invitrogen35050-061
Набор для выделения CD4 Т-клеток до наивного человека IIMiltenyi Biotec130-094-131
Сывороточный альбумин человека 50 г/лBaxter1501057
Иономицин из Streptomyces conglobatus >98%Sigma AldrichI9657-1MG
MACS LS-колонкиMiltenyi Biotec130-042-401
мышь IgG1 K Контроль изотипа APC Клон: P3.6.2.8.1eBioscience17-4714-42
мышь IgG1 K Контроль изотипа FITC 50 μ geBioscience11-4714-81 
контроль изотипа мыши, Brilliant violet 421, клон MOPC-173BD Biosciences563464
пластик пипетки Пастера, индивидуально упакованныйSarstedt86.1172.001   
PMA Phorbol 12-миристат 13-ацетатSigma AldrichP1585-1MG 
РапамицинEMD (Merck)553210-100UG
Рекомбинантный человеческий IL-2, CFR& D202-IL-050/CF
Рекомбинантный человеческий TGF-beta 1, CFRnD240-B-010/CF
Набор для выделения РНК: RNAqueous-Micro KitAmbionAM1931   
RPMI 1640 Средний Инвитроген72400-054 
Бутират натрияSigma AldrichB5887-250MG 
Среда для культивирования Т-клеток: среда X-Vivo 15, с гентамицином + фенолредомLonza04-418Q
TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (лучший охват) Applied Biosystems4331182; идентификатор анализа: Hs01085834_m1Внимание: содержит параформальдегид
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (наилучшее покрытие)Applied Biosystems4351370; идентификатор анализа: Hs04194366_g1   Внимание: содержит параформальдегид
TaqMan Gene Expression Master mixПрикладные биосистемы4369514

Ссылки

  1. Sakaguchi, S. Regulatory T cells: history and perspective. Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).
  2. DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the literature. Clin Can Res. 18 (11), 3022-3029 (2012).
  3. Liu, C., Workman, C. J., Vignali, D. A. A. Targeting Regulatory T Cells in Tumors. FEBS J. , (2016).
  4. Trzonkowski, P., et al. First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+C. Clin. Immunol. 133, 22-26 (2009).
  5. Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117, 1061-1070 (2011).
  6. Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117, 3921-3928 (2011).
  7. Edinger, M., Hoffmann, P. Regulatory T cells in stem cell transplantation: strategies and first clinical experiences. Curr. Opin. Immunol. 23, 679-684 (2011).
  8. Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Transl Med. 7 (315), 189(2015).
  9. Haribhai, D., et al. A central role for induced regulatory T cells in tolerance induction in experimental colitis. J. Immunol. 182, 3461-3468 (2009).
  10. Haribhai, D., et al. A requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen receptor diversity. Immunity. 35, 109-122 (2011).
  11. Abbas, A. K., et al. Regulatory T cells: recommendations to simplify the nomenclature. Nat.Immunol. 14, 307-308 (2013).
  12. Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Natural and adaptive foxp3+ regulatory T cells: more of the same or a division of labor. Immunity. 30, 626-635 (2009).
  13. Huehn, J., Polansky, J. K., Hamann, A. Epigenetic control of FOXP3 expression: the key to a stable regulatory T-cell lineage. Nat. Rev. Immunol. 9, 83-89 (2009).
  14. Schmitt, E. G., Williams, C. B. Generation and function of induced regulatory T cells. Front Immunol. 4, 152(2013).
  15. Pillai, V., Ortega, S. B., Wang, C. K., Karandikar, N. J. Transient regulatory T-cells: a state attained by all activated human T-cells. Clin.Immunol. 123, 18-29 (2007).
  16. Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I. H., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
  17. Josefowicz, S. Z., Rudensky, A. Control of regulatory T cell lineage commitment and maintenance. Immunity. 30, 616-625 (2009).
  18. Sun, C. M., et al. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. J.Exp.Med. 204, 1775-1785 (2007).
  19. Coombes, J. L., et al. A functionally specialized population of mucosal CD103+ DCs induces Foxp3+ regulatory T cells via a TGF-beta and retinoic acid-dependent mechanism. J. Exp. Med. 204, 1757-1764 (2007).
  20. Kang, S. G., Lim, H. W., Andrisani, O. M., Broxmeyer, H. E., Kim, C. H. Vitamin A metabolites induce gut-homing FoxP3+ regulatory T cells. J. Immunol. 179, 3724-3733 (2007).
  21. Mucida, D., et al. Retinoic acid can directly promote TGF-beta-mediated Foxp3(+) Treg cell conversion of naive T cells. Immunity. 30, 471-472 (2009).
  22. Schmidt, A., Eriksson, M., Shang, M. -M., Weyd, H., Tegnér, J. Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid, Rapamycin and Butyrate. PloS one. 11 (2), 0148474(2016).
  23. Furusawa, Y., Obata, Y. regulatory T cells. Nature. 504, 446-450 (2013).
  24. Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation. Nature. 504, 451-455 (2013).
  25. Battaglia, M., et al. Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients. J. Immunol. 177, 8338-8347 (2006).
  26. Hippen, K. L., et al. Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity. Sci. Transl. Med. 3, 41(2011).
  27. Schmidt, A., et al. Human macrophages induce CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cells via binding and re-release of TGF-β. Immunol cell biol. , (2016).
  28. Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
  29. Schmidt, A., et al. Human regulatory T cells rapidly suppress T cell receptor-induced Ca(2+), NF-kappaB, and NFAT signaling in conventional T cells. Sci. Signal. 4, 90(2011).
  30. Ohkura, N., et al. T cell receptor stimulation-induced epigenetic changes and Foxp3 expression are independent and complementary events required for Treg cell development. Immunity. 37, 785-799 (2012).
  31. Hill, J. A., et al. Retinoic acid enhances Foxp3 induction indirectly by relieving inhibition from CD4+CD44hi Cells. Immunity. 29, 758-770 (2008).
  32. Yang, R., et al. Hydrogen Sulfide Promotes Tet1- and Tet2-Mediated Foxp3 Demethylation to Drive Regulatory T Cell Differentiation and Maintain Immune Homeostasis. Immunity. 43 (2), 251-263 (2015).
  33. Yue, X., Trifari, S., et al. Control of Foxp3 stability through modulation of TET activity. The Journal of experimental medicine. 213 (3), 377-397 (2016).
  34. Sasidharan Nair, V., Song, M. H., Oh, K. I. Vitamin C Facilitates Demethylation of the Foxp3 Enhancer in a Tet-Dependent Manner. J Immunol. 196 (5), 2119-2131 (2016).
  35. Geiger, T. L., Tauro, S. Nature and nurture in Foxp3 + regulatory T cell development, stability, and function. Hum Immunol. 73 (3), 232-239 (2012).
  36. Gu, J., et al. TGF-β-induced CD4+Foxp3+ T cells attenuate acute graft-versus-host disease by suppressing expansion and killing of effector CD8+ cells. J Immunol. 193 (7), 3388-3397 (2014).
  37. Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory T Cells. Immunol Invest. 36 (5-6), 607-628 (2007).
  38. McMurchy, A. N., Levings, M. K. Suppression assays with human T regulatory cells: a technical guide. Eur J immunol. 42 (1), 27-34 (2012).
  39. Mutis, T., et al. Human regulatory T cells control xenogeneic graft-versus-host disease induced by autologous T cells in RAG2-/-gammac-/- immunodeficient mice. Clin cancer res. 12 (18), 5520-5525 (2006).
  40. Tran, D. Q. In vitro suppression assay for functional assessment of human regulatory T cells. Meth mol biol. 979, 199-212 (2013).
  41. Oberle, N., Eberhardt, N., Falk, C. S., Krammer, P. H., Suri-Payer, E. Rapid Suppression of Cytokine Transcription in Human CD4+CD25 T Cells by CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells: Independence of IL-2 Consumption, TGF-beta, and Various Inhibitors of TCR Signaling. J. Immunol. 179, 3578-3587 (2007).
  42. Shevach, E. M., Thornton, A. M. tTregs, pTregs, and iTregs: similarities and differences. Immunol. Rev. 259, 88-102 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CD4TGFFOXP3Treg
In Vitro Дифференциация человеческого CD4 + FOXP3 + Индуцированные регуляторных Т - клеток (iTregs) от наивных CD4 + Т - клеток с использованием TGF-β-содержащего протокол
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.