Методическая статья

Живая съемка по изучению микротрубочек динамической неустойчивости в таксанов устойчивостью рака молочной железы

7.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55027

⸱

20 февраля 2017 г.

 ,  , 
1Department of Medical Genetics, Signal Transduction Research Group, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье мы сообщаем о протоколе, описывающем метод in vivo для измерения динамической нестабильности микротрубочек в клетках рака молочной железы, резистентных к доцетакселу (MCF-7TXT). В этом методе используется система визуализации деконволюционной микроскопии для обнаружения экспрессии GFP-тубулина в клетках-мишенях.

Аннотация

Таксаны, такие как доцетаксел, относятся к группе агентов, нацеленных на микротрубочки (MTA), которые обычно используются для лечения рака. Тем не менее, резистентность к таксанам в раковых клетках резко снижает эффективность долгосрочного использования препаратов. Накопленные данные свидетельствуют о том, что механизмы, лежащие в основе устойчивости к таксанам, включают как общие механизмы, такие как развитие множественной лекарственной устойчивости из-за сверхэкспрессии белков оттока лекарств, так и специфические механизмы, такие как механизмы, связанные с динамикой микротрубочек.

Поскольку таксаны нацелены на микротрубочки клеток, измерение динамической нестабильности микротрубочек является важным шагом в определении механизмов резистентности таксанов и дает представление о том, как преодолеть эту резистентность. В эксперименте был использован метод in vivo для измерения динамической нестабильности микротрубочек. Меченный GFP α-тубулин экспрессировался и встраивался в микротрубочки в клетках MCF-7, что позволяло регистрировать динамику микротрубочек с помощью покадровой съемки с помощью чувствительной камеры. Результаты показали, что, в отличие от нерезистентных родительских клеток MCF-7CC, динамика микротрубочек доцетаксел-резистентных клеток MCF-7TXT нечувствительна к лечению доцетакселом, что вызывает резистентность к доцетаксел-индуцированному митотическому аресту и апоптозу. В этой статье будет описан этот метод измерения динамической нестабильности микротрубочек in vivo.

Введение

Основной причиной смертности от рака молочной железы через метастазирования 1, 2. Таксаны , такие как доцетаксел и паклитаксел, в настоящее время используются в качестве лекарства первой линии в лечении метастатического рака молочной железы 2, 3, 4, 5, 6. Они являются частью группы микротрубочек таргетирования агентов (MTA), которые нарушают динамику микротрубочек. Тем не менее, одна из самых больших проблем в использовании таксанов в лечебной терапии является развитие резистентности таксана в раковых клетках, что приводит к рецидиву болезни 7. Устойчивость к лекарственным средствам приходится более 90% всех случаев смерти среди больных с метастатическим раком молочной железы 7.

Микротрубочки формируются путем полимеризации альфа- и бета-тубулина гетеродимеровкласс = "Xref"> 8, 9. Точное регулирование динамики микротрубочек имеет важное значение для многих клеточных функций, в том числе поляризации клеток, клеточного цикла, внутриклеточного транспорта и клеточной сигнализации. Дисрегуляция микротрубочек и их динамика будет нарушать функцию клеток и приводит к гибели клеток 10, 11. В зависимости от того, как они вызывают этот дисрегуляцию, MTA препараты могут быть классифицированы как микротрубочек стабилизирующих агентов (то есть, таксаны) или микротрубочек destabalizing агентов (т.е. алкалоиды барвинка или колхицина-сайта связывающие агенты) 20. Несмотря на их противоположные эффекты на микротрубочки массы, при достаточной дозировке, оба класса могут убивать раковые клетки через их влияние на динамику микротрубочек 21.

Таксаны функционировать в первую очередь за счет стабилизации микротрубочек веретена 12, что приводит кхромосомная перекосы. Последующее бессрочного активация сборки веретена контрольной точки (SAC) задерживает клетки в митоз. Продолжительное митоза затем вызывает апоптоз 13, 14. Таксан взаимодействует с микротрубочками через сайт связывания таксана на бета-тубулина 8, 15, который присутствует только в собранном виде тубулина 16.

Множественные механизмы сопротивления таксана были предложены 9, 17. Эти механизмы включают в себя как общую устойчивость ко многим лекарственным средствам в связи с гиперэкспрессией лекарственно-Отток белков и таксанов удельным сопротивлением 5, 9, 18, 19. Например, таксана устойчивые раковые клетки, возможно, измененную экспрессию и функцию определенного бета-ваннеУлин изотипы 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. При использовании метода в естественных условиях для измерения динамической нестабильности микротрубочек, мы покажем , что, по сравнению с неустойчивого, родительских MCF-7 CC 17 клеток, динамика микротрубочек доцетаксела устойчивостью MCF-7 TXT клетки нечувствительны к лечению доцетакселом.

Чтобы лучше понять функцию АПС и точный механизм таксана устойчивости в раковых клетках, важно для измерения динамики микротрубочек. Здесь мы сообщаем метод в естественных условиях сделать это. При использовании живого изображения в сочетании с выражением GFP-меченый тубулина в клетках, мы можем измерить динамику микротрубочек из MCF-7 TXT и MCF-7 CC клеток с и Wiдоцетаксел лечение без промежуточного. Полученные результаты могут помочь нам разработать более эффективные препараты, которые могут преодолеть сопротивление таксана.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка клетки для живых изображений

  1. Клеточные культуры и высева
    1. Использование MCF-7 рака молочной железы клетки , выбранные для устойчивости к доцетаксела (MCF-7 TXT) и их неустойчивого родительской линии клеток (MCF-7 CC). Подробный процесс отбора и характеристика этих отобранных клеточных линий были описаны ранее 24.
    2. Grow все клетки в 10 см чашки для культивирования при 37 ° С в среде, состоящей на 90% из среды Игла в модификации Игла (DMEM), и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и дополненной несущественных аминокислот. Поддерживать среду в атмосфере 5% CO 2. Поддерживать клетки MCF-7 TXT при 5 нМ доцетаксела.
    3. Семенной клетки на покровных для живого изображения. Стерилизовать 24 мм поли-L-лизин-покрытием покровные стекла, промыв их с 70% -ным спиртом, а затем подвергая их УФ в течение ночи. Поместите покровные в 6-луночный планшет для культивирования 35 мм. Plтуз один покровное в каждую лунку.
    4. Удалить среду из культуральной чашки 10 см и промыть клетки с PBS. Добавить 0,5 мл трипсин-ЭДТА на блюдо, чтобы отделить клетки от тарелки. Добавляют 5 мл культуральной среды в чашке для нейтрализации трипсина после открепления клеток.
    5. Граф клеток с помощью гемоцитометра, чтобы определить число ячейки на единицу объема.
    6. Добавить приблизительно 10 5 клеток в каждую лунку на основе количества клеток на единицу объема. После встряхивания осторожно, положите пластину обратно в инкубатор, чтобы позволить клеткам прикрепляться к покровные.
  2. Экспрессия GFP-меченый альфа-тубулина
    1. Для анализа динамики микротрубочек, трансдукции клеток с GFP-меченый альфа-тубулина с контролем трансдукции коммерческим GFP (например, BacMam) в соответствии с протоколом производителя.
    2. Культуры клеток в лунку в течение 36 часов в 37 ° C для культивирования клеток в инкубаторе, чтобы комохватившую адгезия и 60% слияния.
    3. Рассчитывают соответствующий объем GFP-меченый альфа-тубулина, чтобы добавить в каждую лунку, в соответствии со следующим уравнением:
      figure-protocol-1
      Число клеток, общее предполагаемое количество клеток в лунке в момент маркировки и желаемого КПП представляет число частиц на клетку.
      Примечание: Посев клеток MCF-7 должен был в два раза число клеток от 10 5 до 2 × 10 5 с требуемым КПП 20, объем необходим для каждого покровного поэтому 40 мкл. Для различных ячеек, объем рассчитывается на основе приведенной выше формулы не может быть лучшим. Точный объем должен быть отрегулирован в соответствии с фактическим уровнем экспрессии GFP-тубулина.
    4. Смешайте GFP-меченый несколько раз альфа-тубулина путем инверсии для обеспечения однородного раствора. Не вихрь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для контроля, (контроль) реагента Null не хватает какой-либо генетической млекопитающихэлементы и могут быть использованы, чтобы помочь определить потенциальные бакуловирусом опосредованные эффекты и фоновую флуоресценцию. Нецелевой GFP управления трансдукции может также использоваться, который будет гореть всю клетку.
    5. Заменить культуральную среду со свежей средой. Добавьте 2 мл новой среды и 40 мкл GFP-меченый альфа-тубулина в каждую лунку.
    6. Встряхните пластину осторожно, чтобы обеспечить полное перемешивание GFP-меченый альфа-тубулина с культуральной средой. Возвратить пластину в культуральную инкубатор и инкубируют в течение 24 ч, чтобы обеспечить экспрессию GFP-тубулина.
  3. Лечить клетки с доцетакселом
    Примечание: Этот эксперимент, чтобы проверить эффект доцетаксела на микротрубочки динамической неустойчивости. Таким образом, клетки обрабатывают с желаемой концентрацией доцетаксела.
    1. Подготовьте носитель, состоящий на 90% DMEM и 10% FBS и с добавлением несущественных аминокислот. Используйте DMEM без фенола красного, так как фенол красный может мешать fluorescenв.п. из GFP-тубулина. Добавить требуемую концентрацию доцетаксела (в пределах от 10 нМ до 10 мкМ). Исходный раствор доцетаксела составляет 10 мМ в диметилсульфоксиде (ДМСО).
    2. Предварительно нагреть доцетаксел среде, содержащей до 37 ° С в инкубаторе тканевых культур.
    3. Заменить обычную культуральную среду со доцетаксела среде, содержащей и инкубировать в течение 30 мин в инкубаторе тканевых культур. Там должно быть по крайней мере 3 покровные на лунку для каждой концентрации доцетаксела.

2. Живая съемка по анализу микротрубочек динамической неустойчивости

  1. Настройка системы
    1. Выполнение экспериментов в камере , поддерживаемой при температуре 37 ° С и 5% CO 2. Приобретать флуоресцентных изображений по прошествии времени с микроскопической системой, оснащенной 60X, 1,42 NA нефти объектива на перевернутой флуоресцентного микроскопа и с ПЗС-камерой.
    2. Настройка ячейки для живого изображения. Предварительно теплый и держатель образца исреда до 37 ° С. Выберите покровное для изучения. Установить покровное интереса на держателе образца и инкубировать его с 1 мл доцетаксела среде, содержащей, приготовленным на стадии 1.3.1.
  2. Живая съемка микротрубочек динамической неустойчивости
    1. Определить клетки, которые будут использоваться для работы с изображениями. Они должны быть плоскими, имеют высокую интенсивность флуоресценции, выраженной GFP-тубулина, и имеют четкие структуры микротрубочек.
    2. Выберите одну ячейку из группы определенных клеток из этапа 2.2.1 изучить в первую очередь. Фокус на периферийной области идентифицированной соте. Установите программу для времени экспозиции и частоту получения изображения. Поскольку время экспозиции, как правило, 0,5 с, изображения будут приобретены через каждые два с.
    3. Разрешить дополнительные 20 мин для шагов от 1,33 до 2.2.3. Таким образом, именно через 50 мин после добавления доцетаксела, как описано в шаге 1.3.3, начинают томографию (это по стандартизации).
    4. Запись микротрубочек дynamics в течение 2 мин, принимая фото каждые 2 сек. В общей сложности, приобрести 60 изображений для идентифицированного ячейки.
    5. Переход к следующему идентифицированной ячейке и повторите шаги 2.2.2 2.2.4. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока 5 клеток были отображены. Крайне важно, чтобы сделать это до того, как время достигает 70 мин после добавления доцетаксела, как описано в пункте 1.3.3.
    6. Для каждого условия лечения, повторите шаги 2.2.1 2.2.5 для 3 различных покровные. В целом, изображение 15 ячеек, которые достаточно данных для измерения динамической нестабильности микротрубочек.

3. Обработка изображений и анализ данных

  1. Деконволюция изображений
    1. Деконволюции Полученные изображения для достижения высокого качества. Откройте программу деконволюции, оснащенный системой микроскопа.
    2. Нажмите кнопку "Process" и выберите "деконволюции." Перетащите файл изображения в окне "Input" и нажмите кнопку "Do." Файл изображения будет деконволюции идеконволюции файл будет сохранен как новый файл автоматически.
  2. Генерация видео
    1. Нажмите деконволюции файл изображения, чтобы открыть с оборудованной программным обеспечением.
    2. Нажмите кнопку "Файл" и выберите "Сохранить как фильм." Выберите "Формат фильма" как "AV" и "стиль анимации", как "вперед". Установите "Качество сжатия" до "100%" и "Скорость передачи кадров" до "5 / сек."
    3. Установите флажок "анимировать во времени" и нажмите "Сделай это." Видео будет сгенерирован.
  3. Измерение микротрубочек укорачивания и скорости роста
    1. Определить микротрубочки, которые будут использоваться для измерения. Для каждой ячейки, только несколько микротрубочки будет иметь возможность их укорочение или рост следуют четко и полностью.
    2. Проверьте каждый кадр видео, чтобы идентифицировать кадр, который показывает начальную длину микротрубочек ай кадр с самым пролонгировать или укороченной микротрубочек. Измерьте изменение длины между двумя микротрубочек и время, прошедшее между двумя кадрами.
    3. Вычислить скорость роста или укорочения путем деления изменения длины по времени (единица мкм / с). Для каждого условия лечения, следуют по крайней мере, 10 клеток и измеряют по меньшей мере 20 микротрубочки.
    4. Вычислить среднее значение и стандартное отклонение для каждого условия лечения. Анализ статистической разницы между условиями с использованием критерия Стьюдента. Сообщить данные в таблице и / или в графике.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используя протокол , представленный здесь, мы изучали влияние доцетаксела на динамику микротрубочек нормальных (MCF-7 CC) и доцетаксела устойчивостью (MCF-7 TXT) клетки рака молочной железы. Два набора изображений показывают эффекты доцетаксела (0,5 мкМ) на рост микротрубочек и усадка в MCF-7 , CC и MCF-7 TXT клеток (Рис . 1А)

Мы также рассчитывали с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Есть два основных метода для измерения динамической нестабильности микротрубочек: в пробирке и в естественных условиях. В способе в пробирке, очищенный тубулин используется для измерения динамической нестабильности микротрубочек с компьютерной повышенной покадровой дифференциального интерференционного-контрастной микроскопии. В способе в естественных условиях, микроинъекции флуоресцентной тубулина, или выраженный GFP-тубулина, встроен в микротрубочки. Динамика (рост и усадка) микротру...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование поддерживается финансированием от CBCF (ZW).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM)Sigma-AldrichD5796
Заменимые аминокислотыLife Technologies, Invitrogen11140-050
FBSGibco, Invitrogen12483
Anti-Anti (100x)Life Technologies, Invitrogen15240-062
доцетакселSigma-Aldrich01885-5mg-F DMEM
фенол без красныхGibco, Invitrogen21063
Реагент CellLight *BacMam 2.0* GFP-тубулинThermoFisher ScientificC10613Ключевой реагент для экспрессии тубулина GFP в клетках
Реагент CellLight *BacMam 2.0* GFPThermoFisher ScientificB10383Контроль
диметилсульфоксида (ДМСО)Sigma-Aldrich+B9:AA9472301для удаления децетаксела
22-мм стеклянная ковеслипFisher Scientifics12-545-101
6-луночная культуральная пластинаGreiner Bio-One International6-луночная культуральная пластина
Celi DeltaVision Microscopy Imaging SystemsHealthЭта система оснащена метеостанцией для контроля температуры и CO2. Он также оснащен программным обеспечением Worx для деконволюции и контроля замедленной съемки.
Трипсин-ЭДТА (0,25%), феноловый красныйThermoFisher Scientific25200056
набор гемацитометра Bright-Line, Hausser ScientificHausser Scientific, распространяется VWRПоставщик No: 1492 VWR No: 15170-172
GE

Ссылки

  1. Kamangar, F., Dores, G. M., Anderson, W. F. Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J Clin Oncol. 24 (14), 2137-2150 (2006).
  2. Yardley, D. A. Drug resistance and the role of combination chemotherapy in improving patient outcomes. Int J Breast Cancer. 2013, 137414(2013).
  3. Jassem, J., et al. Doxorubicin and paclitaxel versus fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide as first-line therapy for women with metastatic breast cancer: final results of a randomized phase III multicenter trial. J Clin Oncol. 19 (6), 1707-1715 (2001).
  4. Nabholtz, J. M., et al. Docetaxel and doxorubicin compared with doxorubicin and cyclophosphamide as first-line chemotherapy for metastatic breast cancer: results of a randomized, multicenter, phase III trial. J Clin Oncol. 21 (6), 968-975 (2003).
  5. Zelnak, A. Overcoming taxane and anthracycline resistance. Breast J. 16 (3), 309-312 (2010).
  6. Rivera, E. Implications of anthracycline-resistant and taxane-resistant metastatic breast cancer and new therapeutic options. Breast J. 16 (3), 252-263 (2010).
  7. Longley, D. B., Johnston, P. G. Molecular mechanisms of drug resistance. J Pathol. 205 (2), 275-292 (2005).
  8. Downing, K. H., Nogales, E. Crystallographic structure of tubulin: implications for dynamics and drug binding. Cell Struct.Funct. 24 (5), 269-275 (1999).
  9. McGrogan, B. T., Gilmartin, B., Carney, D. N., McCann, A. Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer. Biochim.Biophys.Acta. 1785 (2), 96-132 (2008).
  10. Kamath, K., Oroudjev, E., Jordan, M. A. Determination of microtubule dynamic instability in living cells. Methods Cell Biol. 97, 1-14 (2010).
  11. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 790-803 (2010).
  12. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat.Rev.Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
  13. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J.Cell Sci. 122 (15), 2579-2585 (2009).
  14. Kavallaris, M. Microtubules and resistance to tubulin-binding agents. Nat.Rev.Cancer. 10 (3), 194-204 (2010).
  15. Diaz, J. F., Valpuesta, J. M., Chacon, P., Diakun, G., Andreu, J. M. Changes in microtubule protofilament number induced by Taxol binding to an easily accessible site. Internal microtubule dynamics. J.Biol.Chem. 273 (50), 33803-33810 (1998).
  16. Abal, M., Andreu, J. M., Barasoain, I. Taxanes: microtubule and centrosome targets, and cell cycle dependent mechanisms of action. Curr Cancer Drug Targets. 3 (3), 193-203 (2003).
  17. Wang, H., et al. Multiple mechanisms underlying acquired resistance to taxanes in selected docetaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (37), (2014).
  18. Lal, S., Mahajan, A., Chen, W. N., Chowbay, B. Pharmacogenetics of target genes across doxorubicin disposition pathway: a review. Curr. Drug Metab. 11 (1), 115-128 (2010).
  19. Murray, S., Briasoulis, E., Linardou, H., Bafaloukos, D., Papadimitriou, C. Taxane resistance in breast cancer: mechanisms, predictive biomarkers and circumvention strategies. Cancer Treat.Rev. 38 (7), 890-903 (2012).
  20. Kamath, K., Wilson, L., Cabral, F., Jordan, M. A. BetaIII-tubulin induces paclitaxel resistance in association with reduced effects on microtubule dynamic instability. J.Biol.Chem. 280 (13), 12902-12907 (2005).
  21. Banerjee, A. Increased levels of tyrosinated alpha-, beta(III)-, and beta(IV)-tubulin isotypes in paclitaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 293 (1), 598-601 (2002).
  22. Wiesen, K. M., Xia, S., Yang, C. P., Horwitz, S. B. Wild-type class I beta-tubulin sensitizes Taxol-resistant breast adenocarcinoma cells harboring a beta-tubulin mutation. Cancer Lett. 257 (2), 227-235 (2007).
  23. Iseri, O. D., Kars, M. D., Arpaci, F., Gunduz, U. Gene expression analysis of drug-resistant MCF-7 cells: implications for relation to extracellular matrix proteins. Cancer Chemother.Pharmacol. 65 (3), 447-455 (2010).
  24. Hembruff, S. L., et al. Role of drug transporters and drug accumulation in the temporal acquisition of drug resistance. BMC.Cancer. 8, 318(2008).
  25. Yenjerla, M., Lopus, M., Wilson, L. Analysis of dynamic instability of steady-state microtubules in vitro by video-enhanced differential interference contrast microscopy with an appendix by Emin Oroudjev. Methods Cell Biol. 95, 189-206 (2010).
  26. Sammak, P. J., Gorbsky, G. J., Borisy, G. G. Microtubule dynamics in vivo: a test of mechanisms of turnover. J Cell Biol. 104 (3), 395-405 (1987).
  27. Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. J Cell Biol. 107 (4), 1437-1448 (1988).
  28. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117 (1997).
  29. Walczak, C. E. Microtubule dynamics and tubulin interacting proteins. Curr Opin Cell Biol. 12 (1), 52-56 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GFPin vivo

Похожие статьи