Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Создание пролиферативный тетраплоид клеток из нетрансформированных фибробластах человека

6.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55028

⸱

8 января 2017 г.

 , 
1Division of Morphological Science, Biomedical Research Center, Saitama Medical University, 2Department of Pathology, International Medical Center, Saitama Medical University

В этой статье

Краткое содержание

Хотя пролиферативные полиплоидные клетки необходимы для анализа хромосомной нестабильности полиплоидных клеток, создание таких клеток из нетрансформированных клеток человека является непростой задачей. В настоящем докладе описываются относительно простые процедуры создания пролиферативных тетраплоидных клеток, свободных от диплоидной популяции из нормальных фибробластов человека.

Аннотация

Полиплоидные (в основном тетраплоидные) клетки часто наблюдаются в предопухолевых поражениях тканей человека, и считается, что их хромосомная нестабильность ответственна за канцерогенез в таких тканях. Несмотря на то, что пролиферативные полиплоидные клетки необходимы для анализа хромосомной нестабильности полиплоидных клеток, создание таких клеток из нетрансформированных клеток человека является довольно сложной задачей. Индукция тетраплоидии химическими агентами обычно приводит к смешению диплоидных и тетраплоидных популяций, и в большинстве исследований использовалась сортировка или клонирование клеток, активируемых флуоресценцией, путем ограничения разведения для отделения тетраплоидных клеток от диплоидных. Однако эти процедуры являются трудоемкими и трудоемкими. В настоящем отчете описан относительно простой протокол индуцирования пролиферативных тетраплоидных клеток из нормальных фибробластов человека с минимальным загрязнением диплоидными клетками. Вкратце, протокол состоит из следующих этапов: остановка клеток в митозе демеколцином (ДК), сбор митотических клеток после стряхивания, инкубация собранных клеток с ДК в течение еще 3 дней и инкубация клеток в безлекарственной среде (они возобновляют пролиферацию в виде тетраплоидных клеток в течение нескольких дней). В зависимости от типа клеток, сбор митотических клеток путем стряхивания может быть опущен. Этот протокол обеспечивает простой и осуществимый метод создания пролиферативных тетраплоидных клеток из нормальных фибробластов человека. Тетраплоидные клетки, созданные с помощью этого метода, могут быть полезной моделью для изучения хромосомной нестабильности и онкогенного потенциала полиплоидных клеток человека.

Введение

Полиплоидии наблюдается не только в специализированных тканях млекопитающих, но и в различных патологических состояниях, таких как рак и дегенеративные заболевания. Полиплоидных ( в основном тетраплоидных) клетки часто наблюдаются в предраковых поражений тканей человека, таких как рак пищевода 1,2 или плоскоклеточного интраэпителиальных поражений Барретта шейки 3,4, и рассматривались как источник злокачественных анеуплоидных клеток в этих тканях 5 , 6. Хотя предполагается, что превращение тетраплоид в анеуплоидных клеток может стать важным событием на ранних стадиях онкогенеза, механизмы, участвующие в этом процессе, полностью не поняты. Это отчасти потому , что не в пробирке модель не была доступна , где нетрансформированных полиплоидные клетки человека могут распространяться.

Некоторые исследователи индуцированных тетраплоидия в нетрансформированных эпителиальных клеток человека через поколения двуядерных клеток с помощью Inhibiting цитокинез 7-9. В этом способе, однако, ненужные диплоидные клетки , должны быть устранены с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS) 7,8 или клонировании лимитирующим разведением 9. Поскольку эти процедуры являются трудоемкими и не легко выполнить, более простые методы, чтобы установить нетрансформированных тетраплоидных клетки желательны для проведения исследований в этой области.

В настоящем докладе мы опишем протокол о создании пролиферативные тетраплоидных клеток из нормальных человеческих фибробластов или теломераза-увековечены фибробластов человека относительно простыми процедурами. Процедуры используют яд шпинделя демеколцин (DC), чтобы арестовать диплоидных клеток в митозе и делящихся клеток, собранных стряхивая дополнительно обрабатывают DC. Диплоидные клетки, обработанные митоза DC в течение длительного времени преобразовать в тетраплоидным G1 клеток, и эти клетки пролиферируют в тетраплоидных клеток после остановки роста в течение нескольких дней после удаления наркотиков. Этот протокол обеспечиваетэффективный метод для создания полезной модели для изучения взаимосвязи между хромосомной нестабильностью и онкогенного потенциала полиплоидных клеток человека.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Культура клеток

  1. Получение клеток, чтобы вызвать тетраплоидия. На сегодняшний день было подтверждено, что этот метод может быть применен к фибробласты клеточных линий человека ТИГ-1, BJ, IMR-90 и теломераза-увековеченную TIG-1 (TIG-ХТ).
  2. Рост клеток в минимальной основной среде с модификацией & alpha; или любой другой среде для культивирования клеток, подходящей для типа клеток, чтобы изучаться с добавлением 10% (об / об) инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS), путем инкубирования в 5% (об / v) атмосфере СО 2 при 37 ° С. Прохождение клетки каждые 3 или 4 дня не должна превышать плотность субконфлюентные.
    Примечание: Уровень Удвоение населения (PDL) следует вычислять каждый раз при пассажей для оценки роста клеток и клеток возраста. PDL можно вычислить из числа клеток высевали в чашку (N1) и числа клеток, выделенных на следующей пассирования (N2) с использованием следующей формулы (Х является начальным PDL). PDL = X + (вход N1 - N2 журнал) / Log 2

2. Индукция и Эстаblishment тетраплоидных клеток из диплоидных фибробластах

  1. Побудить тетраплоидия без вытряхиваемого.
    Примечание: Некоторые клеточные штаммы (например , TIG-1) может стать почти полностью тетраплоидный путем непрерывной обработки с демеколцин (DC) следующим образом .
    1. Прохождение клеток в одну или две 100-мм чашек в день до начала лечения, чтобы побудить тетраплоидия. Как правило, готовят 5 х 10 5 до 1 × 10 6 клеток на чашку для индукции тетраплоидных клеток.
    2. Treat экспоненциально растущие клетки со средой, содержащей 0,1 мкг / мл DC в течение 4 дней.
    3. Заменить DC-среду , содержащую со средой , свободной от наркотиков и инкубировать клеток в 5% (об / об) атмосфере СО 2 при 37 ° С. Клетки, как правило, возобновить пролиферацию в течение 1 недели.
  2. Побудить тетраплоидия с вытряхиваемого.
    Примечание: Большинство клеток становятся смесью диплоидных и тетраплоидных популяций в результате простого лечения DC описано выше (2.1). Таким образом, некоторые модификации рrocedure ликвидировать диплоидной популяции необходимо следующим образом (рисунок 1).
    1. Прохождение клеток в несколько T75 колб за день до лечения, чтобы побудить тетраплоидия. Как правило, готовят по меньшей мере , 5 × 10 6 клеток (1 × 10 6 клеток на колбу) для индукции тетраплоидных клеток.
    2. Лечить экспоненциально растущих клеток со средой, содержащей 0,1 мкг / мл DC в течение 16 - 18 ч, чтобы арестовать клетки в митозе. Время, необходимое для ареста клеток в митозе, может зависеть от клеток-мишеней, и должны быть определены с помощью предварительных экспериментов, чтобы получить как можно больше митотических клеток, как это возможно. Например, медленнее растущие клетки должны быть обработаны DC в течение более длительного времени, чем более высокими темпами роста клеток.
      Примечание: Если клетки обрабатывают слишком долго на этом этапе, они могут подвергнуться митотическую проскальзывание и прилипают к поверхности посуды, что делает невозможным собрать митотических клеток путем вытряхиваемого на следующей стадии.
    3. Собирают DC-арестованными митотических клеток с помощью вытряхиваемого метода, в КНIch свободно прилипшие митотические клетки собирают осторожном встряхивании колб и промывки среды с последующим центрифугированием (300 XG, 5 мин). Подсчитать количество клеток с помощью соответствующего метода в этом шаге.
    4. Reseed собранных митотических клеток в культуральных чашках 60 мм и лечения клеток с помощью 0,1 мкг / мл DC в течение еще 3 дней. Семенной более 1 × 10 6 митотических клеток на чашку, потому что меньше , чем 10% клеток , могут выжить в этом лечении.
    5. Заменить DC-среде, содержащей со средой, свободной от наркотиков и ждать, пока клетки возобновить пролиферацию, которое обычно происходит в течение 1 недели.
  3. Прохождение клетки так же, как исходных диплоидных клеток.

3. Изучение плоидности ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Это хорошо установленный порядок и техническое руководство следует передать подробные процедуры и технические советы.

  1. Урожай клетки (5 × 10 5 - 1 × 10 6) путем инкубирования клеток с мошенником раствором0,05% содержащих трипсин и 0,02% ЭДТА в течение 10 мин при 37 ° С, и нейтрализуют трипсин средой, содержащей 10% FBS.
  2. Центрифуга клеток в среде и мыть их ресуспендирования в 5 мл фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) с последующим центрифугированием (300 XG, 5 мин).
  3. Подготовка клеток для анализа ДНК с помощью одного из следующих двух методов
    1. Способ анализа нефиксированных клеток 10
      Примечание: Этот метод может быть выполнен с использованием коммерчески доступного набора для анализа клеточного цикла. Образцы, полученные с помощью этого метода следует анализировать непосредственно, потому что клетки не являются фиксированными в порядке, и окрашивают ядра будут повредиться со временем.
      1. Вымойте клеток с 40 мМ цитратного буфера, содержащего 250 мМ сахарозы. В дальнейшем обработать клетки с 250 мкл 0,1% (об / об) Nonidet P40 и 30 мкг / мл трипсина в 200 мкл 40 мМ цитратного буфера, содержащего 250 мМ сахарозы в течение 10 мин при комнатной температуре.
      2. Добавить 200 мкл 0,5 мкг / мл трипсина Inhibitor и 0,1 мкг / мл РНКазы А в 40 мМ цитратном буфере, содержащем 250 мМ сахарозы, и инкубируют клетки в течение 10 мин при комнатной температуре.
      3. Добавить 200 мкл 0,4 мг / мл пропидий йодида (PI), в 40 мМ цитратном буфере, содержащем 250 мМ сахарозы, и инкубируют клетки в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы окрасить клеточные ядра.
    2. Способ анализа фиксированные клетки
      1. Закрепить клетки с 80% -ным этанолом, приостановив клеток в 1 мл PBS, добавляя 4 мл 100% по каплям этанола при перемешивании суспензии клеток и оставить его при комнатной температуре в течение 30 мин. Клетки в этой закрепителя можно хранить при -20 ° C в течение нескольких недель.
      2. Промыть клетки путем ресуспендирования их в 5 мл PBS с последующим центрифугированием (300 XG, 5 мин). Treat клетки с 0,5 мг / мл РНКазы А и окрашивают их с 50 мкг / мл пропидиума йодида (PI) (475 мкл 0,5 мг / мл РНКазы А и 25 мкл 1 мг / мл PI) в течение 30 мин при комнатной температуре.
  4. Анализ содержания ДНК тон ячеек с помощью проточного цитометра с 488 нм лазером и фильтром эмиссии красного канала (длинный пас> 610 нм). Анализ эталонного образца, полученного из подлинных диплоидных клеток, в то же время для оценки плоидности клеток-мишеней.
    1. В качестве альтернативы, добавить флуоресценции стандартных бусин для оценки соотношения интенсивности флуоресценции диплоидных клеток по сравнению с бусинами. Используйте 'высоты импульса против широтно - импульсной' вариант потока цитометр различать между отдельными тетраплоидных клеток и сгустки диплоидных клеток 11.

4. Исследование хромосомных графов и анализа кариотипа

ПРИМЕЧАНИЕ: Все это хорошо установленные процедуры и техническое руководство или протоколы изготовителя должны быть переданы для детальных процедур и технических советов.

  1. Лечить экспоненциально растущих клеток с 0,1 мкг / мл DC в течение 4 часов, чтобы задержать клетки в метафазе.
  2. Подготовить хромосомные слайды.
      Клетки для уборки урожая ( по крайней мере , 5 × 10 5 клеток) по трипсином и подвесить в среде , содержащей FBS.
    1. Центрифуга клеток в среде (300 XG, 5 мин) и обрабатывают гипотонический раствор (5 мл 0,075 М KCl) при 37 ° С в течение 10 мин.
    2. Закрепить и приостановить клетки в фиксаторе Карнуа (метанол: уксусная кислота = 3: 1).
    3. Распространение клеток на предметное стекло, понижая небольшого объема (25 - 35 мкл) клеточной суспензии. Дополнительные шаги, такие как воздействие горячего пара может быть необходимо для улучшения хромосому распространения.
  3. Пятно клетки для подсчета хромосом или анализа кариотипа или многоцветной флуоресценции в гибридизация (mFISH).
    1. Хромосомные имеет значение.
      1. Пятно клетки с 5% -ным раствором Гимза (или 5 мкг / мл PI, содержащий 0,5 мг / мл РНКазы А для флуоресцентной микроскопии) в течение 15 - 20 мин.
      2. Цифровым фотографировать, по меньшей мере 50 метафазных клеток.
      3. Подсчитать количество хромосом на клетку с помощью анализа изображений Softwaповторно после ручного отделения трогательные и перекрывающихся хромосомами с помощью программного обеспечения для редактирования фотографий. Хотя число хромосом может быть забит вручную, рекомендуется компьютеризированные подсчета очков.
    2. анализ кариотипа
      Примечание: Этот анализ должен выполняться квалифицированным специалистом или профессиональной компании.
      1. Пятно клетки по стандартной методике G-обвязочной 12.
      2. Анализ хромосом , чтобы сделать стандартные karyograms 12.
    3. mFISH
      Примечание: Этот шаг не является обязательным и должно быть выполнено в случае необходимости.
      1. Пятно клеток с использованием разноцветные рыбы зондов для хромосом человека в соответствии с протоколом производителя 13.
      2. Анализ хромосом с помощью флуоресцентного микроскопа с подходящими фильтрами и программное обеспечение для анализа mFISH 13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

По нашему опыту, клетки TIG-1 могут быть сделаны почти полностью тетраплоид простой непрерывной обработкой 0,1 мкг / мл DC в течение 4 дней (Рисунок 2А). В противоположность этому, другие фибробласта штаммы, такие как BJ или кондиционированной IMR-90, а также клетки TIG-ХТ, стала смесь диплоидных и тетраплоидных популяций следующих той же обработке, и выделение митотических клеток с помощью вытряхиваемого метода необходимо в течение лечения постоянным током (обычно 16 - ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Одна из основных проблем в индукции тетраплоидия из диплоидных клеток с помощью химических агентов, либо с помощью ингибиторов цитокинеза или ингибиторами шпинделя, является то, что клетки часто становятся смесью диплоидных и тетраплоидных популяций, и тетраплоидные клетки должны быть отделены от диплоидных клеток. Наиболее распространенные подходы к выделению тетраплоидной населения, свободного от диплоидных клеток используют FACS или клонировании путем ограничения разведения. Тем не менее, эти процедуры являются трудо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Благодарим госпожу Мацумото за техническую помощь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
MEM-αSigma-AldrichM8042-500ML
Trypsin-EDTASigma-AldrichT4174
FBSSigma-Aldrich172012-500ML
Раствор демеколцина (10 μ г/мл в HBSS)Sigma-AldrichD1925-10ML
BD CycleTES Plus наборы реагентов ДНКBD Biosciences#340242Для исследования плоидности ДНК методом проточной цитометрии
Хромосома человека многоцветный FISH зонд 24XCyteMetaSystems#D-0125-060-DIНеобходим специализированный набор фильтров и программное обеспечение для анализа mFISH
Система визуализации Isis с программным обеспечением mFISH Необходим специализированный комплект щуповMetaSystems

Ссылки

  1. Rabinovitch, P., et al. Predictors of progression in Barrett's esophagus III: baseline flow cytometric variables. Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).
  2. Galipeau, P., et al. NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma. PLoS Med. 4 (2), e67(2007).
  3. Olaharski, A., et al. Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis. Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).
  4. Liu, Y., et al. p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy. Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).
  5. Davoli, T., de Lange, T. The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
  6. Fox, D., Duronio, R. Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease. Development. 140, 3-12 (2013).
  7. Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437, 1043-1047 (2005).
  8. Ganem, N., et al. Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation. Cell. 158 (4), 833-848 (2014).
  9. Kuznetsova, A., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).
  10. Vindeløv, L., Christensen, I. Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis. Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).
  11. Darzynkiewicz, Z., Juan, G. DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis. Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5(2001).
  12. Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. Chromosome analysis guidelines preliminary report. Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).
  13. Liehr, T., et al. Multicolor FISH probe sets and their applications. Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).
  14. Ohshima, S., Seyama, A. Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts. Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).
  15. Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Front. Oncol. 3, 198(2013).
  16. Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts. Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).
  17. Di Leonardo, A., et al. DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function. Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).
  18. Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1. Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).
  19. Vogel, C., et al. Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy. Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).
  20. Aylon, Y., Oren, M. p53: Guardian of ploidy. Mol. Oncol. 5 (4), 315-323 (2011).
  21. Uetake, Y., Sluder, G. Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a "tetraploidy checkpoint". J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).
  22. Ganem, N., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131, 437-440 (2007).
  23. Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization. Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Создание пролиферативный тетраплоид клеток из нетрансформированных фибробластах человека
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.