Методическая статья

Коллекция Serum- и фидерных свободной эмбриональных стволовых клеток мыши-кондиционированная среда для подхода бесклеточный

DOI:

10.3791/55035

⸱

8 января 2017 г.

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Smart-aging Convergence Research Center, College of Medicine, Yeungnam University, 2Physiology and Experimental Medicine Program, The Hospital for Sick Children Research Institute, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол обеспечивает способ сбора эмбриональных стволовых клеток мыши (МЕСК) -conditioned среда (МЕСК-СМ), полученные из сыворотки (эмбриональной бычьей сыворотки, ФБС) - и фидерные (мышиные эмбриональные фибробласты, MEFs) -свободных условия для ячейки -бесплатно подход. Это может быть применимо для лечения старения и возрастного заболеваний.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способность эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) генерировать различные типы клеток открыла новые возможности в области регенеративной медицины. Однако, несмотря на их преимущества, опухолевый потенциал ЭСК и ИПСК долгое время был барьером для клинического применения. Интересно, что было показано, что ЭСК продуцируют несколько растворимых факторов, которые могут способствовать регенерации тканей и задерживать клеточное старение, что позволяет предположить, что ЭСК и ИПСК также могут быть использованы в качестве метода бесклеточного вмешательства. В связи с этим метод забора кондиционированной среды эмбриональных стволовых клеток мыши (mESC-CM) мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESC-CM) с минимальной контаминацией компонентов сыворотки (фетальной бычьей сыворотки, FBS) и фидерных клеток (эмбриональных фибробластов мыши, MEFs) оказался весьма востребованным. В настоящем исследовании представлен оптимизированный метод сбора mESC-CM в условиях отсутствия сыворотки и фидеров, а также для определения характеристик mESC-CM с использованием множественных считываний, связанных со старением. Этот протокол обеспечит метод сбора чистых мЭСК-специфичных секреторных факторов без загрязнения сыворотки и фидера.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целью этого протокола является сбор эмбриональных стволовых клеток мыши (MESC) -conditioned среды (MESC-CM) из serum- и фидерных свободных условиях культивирования и охарактеризовать его биологические функции.

В общем, эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) имеют большой потенциал для регенеративной медицины и клеточной терапии в связи с их плюрипотентности и способность к самообновлению 1-3. Тем не менее, прямая трансплантация стволовых клеток имеет ряд ограничений, например, иммунного отторжения и образования опухолей 4,5. Таким образом, подход бесклеточная может обеспечить альтернативную терапевтическую стратегию дл....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Схема на serum- и фидерных свободный протокол сбора CM показан на рисунке 1.

1. Материалы (Получение MEFs, Medium, тарелки, и решения)

  1. Приготовьте 500 мл среды для культивирования MEFs. Дополнение модифицированную Dilbecco среду Eagle (DMEM) с добавлением 10% FBS (качество ESC), 50 ед / мл пенициллина и 50 мг / мл стрептомицина.
  2. Изолировать MEFs из эмбрионов следуя установленным рутинного протокола 13 и поддерживать их в MEF среде.
  3. Приготовьте 500 мл среды для культивирования mESCs. DMEM дополнена 15% FBS и 2 мМ L-глутамина, 100 мкМ заменимых аминокислот (NEAA), 100 мкМ бета-меркаптоэтанол....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первоначально mESCs поддерживаются на MEF фидера в MESC среде с FBS и другими добавками (Фигуры 1А и 2А). CM была собрана из mESCs в Reduced Serum СМИ без фидерного слоя, FBS или других добавок (Фигуры 1В и 2В). Это состояние культуры позволяет нам собирать MESC-Specific кондиционированной среды без потенциального загрязнения факторами из питателя, FBS, или другие добавки. Контрольную среду собирали при тех же самых усло.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для успешного сбора serum- и фидерных свободного MESC-CM, следующие предложения должны быть приняты во внимание. Наиболее важным фактором является то, используя ранние прохождение mESCs для сбора MESC-CM. Ранее было показано, что раннее прохождение MESC-CM имеет лучшие омолаживающие эффекты по сравнению с концом прохода mESCs. Проход количество mESCs Сообщалось , что влияет на их потенциал развития 16 и плюрипотентности 17.

Хотя необходимы дополнительные исследования дл.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Программой фундаментальных исследований (Science 2013R1A1A2060930) и Научно-исследовательский центр медицинской программы (2015R1A5A2009124) в рамках Национального исследовательского фонда Кореи (СРН), финансируемого Министерством науки, ИКТ и будущего планирования. Это исследование также поддерживается начинающей операционный грант из больницы для больных детей (HK Sung). Мы хотели бы поблагодарить Лору Barwell и Сара JS Ким за отличную помощь в редактировании рукописи и д-р Андраш Надь для обеспечения линии G4 MESC.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEMInvitrogen#11960-044
FBSInvitrogen#3004433320%, ES клеточного качества
Пенициллин и стрептомицинInvitrogen#1514050 единиц/мл пенициллин и 50  мг/мл стрептомицин
L-глутаминInvitrogen#250302  mM
Заменимые аминокислоты (NEAA)Invitrogen#11140100  &микро; М
&бета;-меркаптоэтанол Сигма#M3148100  &микро; M
фактор ингибирования лейкемии Миллипора#ESG1107100 единиц/мл
OPTI-MEMInvitrogen#22600
X-gal Сигма#B42521 мг/мл
параформальдегид (ПФА)СигмаP61483,70%
диметилформамид (ДМФА)Сигма#D4551
Феррицианид калияОлдрич#4559465 мМ
ферроцианид калияОлдрич#4559895 мМ
NaClСигма#S7653150 мМ
MgCl2Sigma#M23932 мМ
митомицина CSigma#M428710  &микро; г/мл
Propidium iodide Сигма#P417050  &микро; г/мл
ТРИзолАмбион#15596018
M-MLV обратная транскрипт-тазаPromega#M170B
Power SYBR Green PCR master mix Прикладные биосистемы#4367659
HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast LONZA#CC-2511
Фильтр для бутылкиCorning#4305130.2 м

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи