Методическая статья

Коллекция Serum- и фидерных свободной эмбриональных стволовых клеток мыши-кондиционированная среда для подхода бесклеточный

DOI:

10.3791/55035

⸱

8 января 2017 г.

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Smart-aging Convergence Research Center, College of Medicine, Yeungnam University, 2Physiology and Experimental Medicine Program, The Hospital for Sick Children Research Institute, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол обеспечивает способ сбора эмбриональных стволовых клеток мыши (МЕСК) -conditioned среда (МЕСК-СМ), полученные из сыворотки (эмбриональной бычьей сыворотки, ФБС) - и фидерные (мышиные эмбриональные фибробласты, MEFs) -свободных условия для ячейки -бесплатно подход. Это может быть применимо для лечения старения и возрастного заболеваний.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способность эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) генерировать различные типы клеток открыла новые возможности в области регенеративной медицины. Однако, несмотря на их преимущества, опухолевый потенциал ЭСК и ИПСК долгое время был барьером для клинического применения. Интересно, что было показано, что ЭСК продуцируют несколько растворимых факторов, которые могут способствовать регенерации тканей и задерживать клеточное старение, что позволяет предположить, что ЭСК и ИПСК также могут быть использованы в качестве метода бесклеточного вмешательства. В связи с этим метод забора кондиционированной среды эмбриональных стволовых клеток мыши (mESC-CM) мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESC-CM) с минимальной контаминацией компонентов сыворотки (фетальной бычьей сыворотки, FBS) и фидерных клеток (эмбриональных фибробластов мыши, MEFs) оказался весьма востребованным. В настоящем исследовании представлен оптимизированный метод сбора mESC-CM в условиях отсутствия сыворотки и фидеров, а также для определения характеристик mESC-CM с использованием множественных считываний, связанных со старением. Этот протокол обеспечит метод сбора чистых мЭСК-специфичных секреторных факторов без загрязнения сыворотки и фидера.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целью этого протокола является сбор эмбриональных стволовых клеток мыши (MESC) -conditioned среды (MESC-CM) из serum- и фидерных свободных условиях культивирования и охарактеризовать его биологические функции.

В общем, эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) имеют большой потенциал для регенеративной медицины и клеточной терапии в связи с их плюрипотентности и способность к самообновлению 1-3. Тем не менее, прямая трансплантация стволовых клеток имеет ряд ограничений, например, иммунного отторжения и образования опухолей 4,5. Таким образом, подход бесклеточная может обеспечить альтернативную терапевтическую стратегию для восстановительной медицины и старения вмешательств 6,7.

Старение рассматривается как сотовый аналог старения тканей и органов, характеризующееся постоянным состоянием остановки роста, измененной физиологии клеток и поведения. Старение является основным фактором риска для распространенных заболеваний, включая рак, сердечно-сосудистые заболевания, тYpe диабет 2, и нейродегенеративные 8. Одним из очевидных признаков старения является снижение регенеративного потенциала тканей, которое вызвано старением стволовых клеток и истощение 9. Многие значительные исследования показали фармакологическую молекулы, такие как рапамицин 9, ресвератрол 10 и метформина 11 и системных факторов , переносимых с кровью, а именно GDF11 12, которые имеют возможность последовательно задерживать старение и увеличить продолжительность срока службы.

В настоящем исследовании, MESC-СМ был собран без сыворотки (эмбриональной телячьей сыворотки, FBS) и фидер (эмбриональных фибробластов мыши, МЭФ) слоев, чтобы исключить загрязнение факторов в сыворотке крови и секреторных факторов из MEFs. Эти условия позволили для serum- и фидерной свободной СМ, что, следовательно, позволило точно идентифицировать MESC специфических секреторных факторов.

Этот предложенный протокол является высокоэффективным, относительно экономически эффективным и легкодействовать. Этот метод дает представление о характеристике МЕСК полученных из растворимых факторов, которые могут опосредовать противоопухолевый эффект старения, который может быть использован для разработки безопасной и потенциально выгодного бесклеточной терапевтического подхода к вмешательствах по причине старения заболеваний, ассоциированных и других восстановительно лечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Схема на serum- и фидерных свободный протокол сбора CM показан на рисунке 1.

1. Материалы (Получение MEFs, Medium, тарелки, и решения)

  1. Приготовьте 500 мл среды для культивирования MEFs. Дополнение модифицированную Dilbecco среду Eagle (DMEM) с добавлением 10% FBS (качество ESC), 50 ед / мл пенициллина и 50 мг / мл стрептомицина.
  2. Изолировать MEFs из эмбрионов следуя установленным рутинного протокола 13 и поддерживать их в MEF среде.
  3. Приготовьте 500 мл среды для культивирования mESCs. DMEM дополнена 15% FBS и 2 мМ L-глутамина, 100 мкМ заменимых аминокислот (NEAA), 100 мкМ бета-меркаптоэтанола, 100 ед / мл ингибирующий лейкоз фактор (LIF), 50 ед / мл пенициллина и 50 мг / мл стрептомицина.
  4. Готовят желатинизированного пластины (5 желатинизированный пластины / 1 МЕСК пластинчатые) путем покрытия 10 см чашки культуры клеток с 5 мл 0,1% раствора желатина. Выдержите в течение не менее 10 мин при комнатной температуре.
  5. Приготовьте 500 мл Сниженная сыворотки среды для бессывороточной состояния mESCs. Дополнение Снижение сыворотки носителя с 1,2 г бикарбоната натрия (рН 7,0). Смесь фильтруют через бутылочной верхний фильтр 0,2 мкм.
  6. Подготовьте стареющих связанный -галактозидазу (SA β-гал) окрашивание раствора для обнаружения стареющих клеток: 1 мг / мл X-Gal (растворенный в диметилформамиде, DMF), 40 мМ лимонной кислоты / натрий-фосфатного буфера (рН 6,0) , 5 мМ кровяной соли, 5 мМ ферроцианида калия, 150 мМ NaCl, и 2 мМ MgCl 2 , 14.
    ВНИМАНИЕ: (опасных) DMF является токсичным и коррозионным раствором. Использовать средства индивидуальной защиты (например, нитриловые или латексные перчатки, лабораторный халат и очки) при обработке раствора. Используйте вытяжку.
  7. Приготовьте 500 мл среды к культуре фибробластов кожи человека (HDFS, NHDF-Ad-Дер-Фибробласт). Дополнение DMEM с добавлением 10% FBS и 100 ед / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина.
jove_title "> 2. Культура эмбриональных стволовых клеток мыши (рис 1А и 2А)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все действия, описанные в клеточной культуре биологической безопасности капюшоном.

  1. Обработать MEFs с 20 мл MEF среды, содержащей 10 мкг / мл митомицина в 15 см клеточной культуральной чашки с. Инкубировать в течение 2 ч при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
  2. Аспирируйте среды от MEFs. Промывают клетки с PBS три раза. Добавьте 3 мл трипсин-ЭДТА (ТЕ, 1x) и инкубировать в течение 3 мин при 37 ° С и 5% CO 2. Через 3 минуты, нейтрализовать TE 6 мл MEF среды и центрифуги в течение 3 мин при 300 х г.
  3. Ресуспендируют в 5 мл среды MEF. Определить количество клеток в полученной суспензии клеток с использованием окрашивания трипановым синим и гемоцитометра. Пластинчатые инактивированные МЭФ (фидерные) при плотности 2 × 10 6 клеток на 10 см для культивирования клеток блюдо в MEF среде. Инкубировать в течение 24 ч при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
  4. Замените носитель MEF с MESC средой через 24 часа после нанесения покрытия фидер (наследующий день).
  5. Табличка mESCs (G4 гибрид F1 ES клеток) при плотности 2 × 10 6 клеток на фидере с MESC средой. Инкубировать в течение 48 часов при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: омолаживающий эффект MESC-CM, вероятно , сильнее , когда нижний пассажа mESCs используются 15-17. Мы приобрели линию G4 MESC от доктора Андраш Надь в научно-исследовательском институте Lunenfeld-Таненбаума, больницы Маунт Синай 25 Орд Street, Toronto, ON, m5t 3H7, Канада.
  6. Сохранить клетки при относительно высокой плотности и проход на 70-80% в суб-сливающийся состоянии. Замените среду со свежей средой MESC ежедневно.

3. Сбор Serum- и фидеров свободной среды, кондиционированной (Фигура 1В и 2В)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все действия, описанные в клеточной культуре биологической безопасности капюшоном.

  1. Промыть пластину МЕСК с 5 мл PBS. Добавьте 1 мл TE (2.5x) и инкубировать в течение 3 мин при 37 ° С и 5% CO 2. Через 3 минуты, нейтрализовать ТЕ с 2 мл мЭСК mediuм и центрифуги в течение 3 мин при 300 х г.
  2. Ресуспендируют в 5 мл среды МЕСК и пластины 1 мл в каждую желатин покрытием блюдо культуры (5 желатинизированный пластины / 1 МЕСК пластины) в МЕСК среде. Культура при 37 ° С и 5% СО 2 до 80-85% слияния будет достигнута.
  3. Промыть mESCs с достаточным количеством PBS, чтобы покрыть клетки (8 мл на 10 см пластины) в течение 10 мин на каждую промывку, в общей сложности на трех стирок. Выдержите в Reduced Serum среде в течение 24 ч при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стадия промывки важно, чтобы предотвратить загрязнение FBS. Важно следить за время инкубации 18,19.
  4. Собирают МЕСК-CM в 50 мл коническую пробирку и центрифугируют в течение 20 мин при 2500 х г. Собирают раствор надосадочной (СМ) после центрифугирования. Смесь фильтруют через бутылочной верхний фильтр 0,2 мкм.

4. Влияние эмбриональных стволовых клеток мыши-кондиционированная среда (MESC-CM)

Примечание: Эффекты МЕСК-СМ были подтверждены несколькими методами, такими какSA β-гал анализ, анализ клеточного цикла, и QRT-PCR.

  1. С. А. β-гал анализа (рис 3A)
    1. Семенной HDFS при плотности 2 × 10 4 клеток на лунку в 6-луночные планшеты в среде HDF. Инкубируют в течение ночи при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
    2. После инкубации в течение ночи, отбрасывать половину среды HDF и добавьте МЕСК-CM и контрольной среде. Инкубировать в течение 72 часов при температуре 37 ° С и 5% CO 2. среда управления является производным от сыворотки среде (уменьшенная Сыворотка Медиа) в чашке желатин покрытием в отсутствие mESCs.
    3. Промывают клетки с достаточным количеством PBS, чтобы покрыть клетки (2 мл на 6-луночный планшет) в течение 30 секунд на каждую промывку, в общей сложности на двух промываний. Добавить 3,7% параформальдегида (PFA) для фиксации. Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре.
      ВНИМАНИЕ: (опасных) параформальдегид является токсичным и коррозионным раствором. Использовать средства индивидуальной защиты (например, нитриловые или латексные перчатки, лабораторный халат и очки) при обработке раствора.Используйте вытяжку.
    4. Аспирируйте решение фиксации. Промыть фиксированные клетки с PBS в два раза, как это описано в шаге 4.1.3.
    5. Добавить раствор β-гал окрашивания SA (1-2 мл на лунку в 6-луночный планшет). Выдержите в течение 17,5 ч при 37 ° С.
      Примечание: Не следует инкубировать в CO 2 инкубаторе.
    6. Аспирируйте окрашивание раствора β-гал SA и промыть клетки с PBS в два раза, как это описано в шаге 4.1.3.
    7. Добавить раствор эозином для борьбы с окрашиванием. Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре. Промывают клетки с PBS в два раза, как это описано в шаге 4.1.3.
    8. Клетки изображение при 100-кратном увеличении с помощью светового микроскопа и захвата изображений с помощью прикрепленного цифровую камеру для последующего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество ячеек можно пересчитать в слепым методом и процент SA β-гал положительных голубых клеток может быть вычислена.
  2. Анализ клеточного цикла (рис 3B)
    1. Семенной HDFS при плотности8 х 10 4 клеток на лунку в сотовом Петри культуры 6 см в HDF среде. Инкубируют в течение ночи при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
    2. После инкубации в течение ночи, отбрасывать половину среды HDF и добавьте МЕСК-CM и контрольной среде. Инкубировать в течение 24 ч при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
    3. Trypsinize клетки, как описано в шаге 3.1, и центрифуге в течение 5 мин при 300 х г. Промывают клетки с холодным раствором PBS (PBS , 0,5 мМ CaCl 2 и 2% FBS, 1 мл в 1,5 мл пробирку) дважды и центрифуге в течение 3 мин при 2500 х г. Ресуспендируют в 100 мкл холодного раствора PBS.
    4. Закрепить клетки путем сбрасывания 200 мкл холодного этанола в то время как встряхиванием. Хранить при температуре 4 ° С в течение по меньшей мере 1 ч.
    5. Промывают клетки с холодным раствором PBS в два раза, как это описано в шаге 4.2.3.
    6. Ресуспендируют клеток в 250 мкл буфера цитрата натрия (1,12%, рН 8,5), содержащего 50 мкг / мл РНКазы. Инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С.
    7. Добавить 250 мкл цитрат натриябуфер, содержащий йодид 50 мкг / мл пропиди. Инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре.
    8. Мера 10000 клеток в каждом образце с помощью проточной цитометрии 20.
  3. QRT-PCR (рис 3C)
    1. HDFS семян и добавить MESC-CM, как описано в пунктах 4.1.1 и 4.1.2.
    2. Изолировать тотальной РНК из HDFS с использованием набора для экстракции РНК в соответствии с протоколом производителя. Количественно экстрагированной суммарной РНК в с использованием спектрофотометра 21.
    3. Синтеза кДНК путем добавления 1 мкг полной РНК в 20 мкл реакционной смеси , содержащей олиго (дТ) праймеров и М-MLV обратной транскриптазы, в соответствии с протоколом производителя 20.
    4. Измеряют амплификации кДНК с ПЦР в реальном времени машины, используя зеленый Master Mix ПЦР и специфических праймеров ген (Приложение таблица 1). Нормализовать данные с помощью выражения GAPDH. Используйте следующий протокол ПЦР: начальная деnaturation в течение 10 мин при 95 ° С; 45 циклов в течение 15 сек при 95 ° С, 20 сек при 55 ° С, и 35 с при 72 ° С; и кривой плавления стадия в течение 15 сек при 95 ° С, 1 мин при 60 ° С, 30 с при 95 ° С и 5 сек при 60 ° C 15.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первоначально mESCs поддерживаются на MEF фидера в MESC среде с FBS и другими добавками (Фигуры 1А и 2А). CM была собрана из mESCs в Reduced Serum СМИ без фидерного слоя, FBS или других добавок (Фигуры 1В и 2В). Это состояние культуры позволяет нам собирать MESC-Specific кондиционированной среды без потенциального загрязнения факторами из питателя, FBS, или другие добавки. Контрольную среду собирали при тех же самых усло...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для успешного сбора serum- и фидерных свободного MESC-CM, следующие предложения должны быть приняты во внимание. Наиболее важным фактором является то, используя ранние прохождение mESCs для сбора MESC-CM. Ранее было показано, что раннее прохождение MESC-CM имеет лучшие омолаживающие эффекты по сравнению с концом прохода mESCs. Проход количество mESCs Сообщалось , что влияет на их потенциал развития 16 и плюрипотентности 17.

Хотя необходимы дополнительные исследования дл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Программой фундаментальных исследований (Science 2013R1A1A2060930) и Научно-исследовательский центр медицинской программы (2015R1A5A2009124) в рамках Национального исследовательского фонда Кореи (СРН), финансируемого Министерством науки, ИКТ и будущего планирования. Это исследование также поддерживается начинающей операционный грант из больницы для больных детей (HK Sung). Мы хотели бы поблагодарить Лору Barwell и Сара JS Ким за отличную помощь в редактировании рукописи и д-р Андраш Надь для обеспечения линии G4 MESC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEMInvitrogen#11960-044
FBSInvitrogen#3004433320%, ES клеточного качества
Пенициллин и стрептомицинInvitrogen#1514050 единиц/мл пенициллин и 50  мг/мл стрептомицин
L-глутаминInvitrogen#250302  mM
Заменимые аминокислоты (NEAA)Invitrogen#11140100  &микро; М
&бета;-меркаптоэтанол Сигма#M3148100  &микро; M
фактор ингибирования лейкемии Миллипора#ESG1107100 единиц/мл
OPTI-MEMInvitrogen#22600
X-gal Сигма#B42521 мг/мл
параформальдегид (ПФА)СигмаP61483,70%
диметилформамид (ДМФА)Сигма#D4551
Феррицианид калияОлдрич#4559465 мМ
ферроцианид калияОлдрич#4559895 мМ
NaClСигма#S7653150 мМ
MgCl2Sigma#M23932 мМ
митомицина CSigma#M428710  &микро; г/мл
Propidium iodide Сигма#P417050  &микро; г/мл
ТРИзолАмбион#15596018
M-MLV обратная транскрипт-тазаPromega#M170B
Power SYBR Green PCR master mix Прикладные биосистемы#4367659
HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast LONZA#CC-2511
Фильтр для бутылкиCorning#4305130.2 м

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model. Nat Commun. 3, 608(2012).
  3. Woo, D. H., et al. Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice. Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).
  4. Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  5. Moon, S. H., et al. A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation. Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).
  6. Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age. Circulation. 118, 9-16 (2008).
  7. Lazarous, D. F., et al. Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial. J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).
  8. Adams, P. D. Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence. Mol Cell. 36, 2-14 (2009).
  9. Harrison, D. E., et al. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. Nature. 460, 392-395 (2009).
  10. Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan. Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).
  11. Martin-Montalvo, A., et al. Metformin improves healthspan and lifespan in mice. Nat Commun. 4, 2192(2013).
  12. Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153, 828-839 (2013).
  13. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  14. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  15. Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway. FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).
  16. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).
  17. Li, X. Y., et al. Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation. Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).
  18. Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS. J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).
  19. Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).
  20. Kim, K. S., et al. Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells. Aging Cell. 6, 535-545 (2007).
  21. Kim, K. S., et al. Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism. Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).
  22. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи