Методическая статья

Выделение и Flow Cytometric Анализ человеческого Endocervical Гамма-Дельта Т-клеток

8.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55038

⸱

6 февраля 2017 г.

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Miller School of Medicine, University of Miami, 2Division of Infectious Diseases, Miller School of Medicine, University of Miami

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем здесь метод выделения для получения эндоцервикальных интраэпителиальных лимфоцитов человека для анализа внутриэпителиальных гамма-дельта Т-клеток. Этот протокол может быть расширен для очистки эндоцервикальных гамма-дельта Т-клеток с помощью магнитных шариков или путем сортировки клеток.

Аннотация

Женского репродуктивного тракта (FRT) иммунная система слизистых оболочек служит в качестве первой линии обороны. Более глубокое понимание слизистой оболочки половых органов, поэтому необходимо для понимания патогенность различных патогенов, включая ВИЧ. Гамма-дельта (GD) Т-клетки являются прототипом «нетрадиционным» Т-клеток и представляют собой относительно небольшое подмножество Т-клеток, определяемых их экспрессии гетеродимерных рецепторов Т-клеток (TCR), состоящих из гамма и дельта цепей. Это отличает их от классических и гораздо более известных CD4 + Т - хелперов и CD8 + цитотоксических Т - клеток, которые определяются альфа-бета - ТКО. GD Т-клетки часто показывают локализацию тканеспецифичную и обогащены эпителия. GD Т-клетки оркестровать иммунные реакции воспаления, наблюдения опухоли, инфекционные болезни и аутоиммунитета.

Здесь мы представляем метод воспроизводимым выделять и анализировать человеческие эндоцервикальные интраэпителиальной GD Т-лимфоциты. Мы гаве использовали эндоцервикальные образцы цитощеточка от женщин, участвующих в женском инфекции исследовании Межведомственная ВИЧ (WIHS). Знание о GD взаимодействий Т-клеток во время условий, в которых есть оскорбление влагалища через слизистую оболочку может быть применен к любому клинического исследования, в которых адресуется через слизистую оболочку уязвимости, включая развитие вагинального microbicides.In Кроме того, знание о ответах через слизистую оболочку GD имеет Т-клеток потенциал для применения клеточной иммунотерапии GD T при лечении инфекционных заболеваний.

Введение

Мы разработали методику использования эндоцервикальные образцов кисти для оценки интраэпителиальной GD Т-клеток. Эндоцервикальный канал выстланы однослойным цилиндрическим эпителием. Внутриэпителиальные лимфоциты представляют фронтовые лимфоциты , проживающих в пределах эпителиального слоя , который может быстро инициировать иммунный ответ при встрече с патогенными микробами 7, 8. Понимание иммунологических событий эндоцервикальной интраэпителиальной купе имеет важное значение для разработки эффективных стратегий для предотвращения инфекций, включая ВИЧ-инфекцию.

Наш метод может быть применен для свежесобранных эндоцервикса образцов человека, а также замороженных эндоцервикса клеток для дальнейшего изучения роли интраэпителиальных GD Т-клеток у женщин с ВИЧ-инфекцией или с высоким риском ВИЧ-инфекции. Основной целью данного протокола является выявление новых иммунологических событий в эндоцервикальной интраэпителиальной отсеке и evaluatклеточные ответы е GD T в качестве маркера уязвимости слизистых оболочек у женщин с ВИЧ-инфекцией.

Существенные пробелы в знаниях вокруг FGT иммунитета частично из-за трудностей в успешном сборе и обработке проб слизистых оболочек. Кроме того, комплекс гетерогенность слизистыми иммунных клеток, а также их взаимосвязанность друг с другом, являются основными проблемами для выявления клинически значимых измерений, которые отражают состояние и способность иммунной системы. Мы разработали метод получения высокоочищенных интраэпителиальной GD Т-клетки, которые могут быть дополнительно проанализированы с использованием высоко уплотненные, одноклеточные технологии, которые могут иметь решающее значение для определения механизмов, лежащих в основе FRT иммунитета.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Учебные мероприятия проводились в Университете отдела исследований ВИЧ Майами в сотрудничестве с Майами женского ВИЧ Межведомственной исследования (WIHS) и Майами Центра исследований СПИДа (CFAR) Совет Обзор .Institutional (Университет Майами Миллер Школа медицины) одобрение было получено до приема на работу и какие-либо оценки или исследования, связанные с процедурами.

1. Endocervical Кисть для сбора проб

Примечание: Участники прошли влагалищное исследование выполняется обученным MD или гинеколога и сбор интраэпителиальной лимфоцитов проводили в зеркалах обследования путем введения цитощеточка.

  1. Участник характеристики
    1. Набирать участников женщин, которые в возрасте от 18 до 45 лет, ведущих активную половую жизнь, не беременна, а не на противозачаточные лекарства или с внутриматочные устройства.
    2. Перед влагалищного исследования, имеют участники подвергаются ничьи 10 мл крови в зеленыйтоп vacutainers гепарин для мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) изоляции. чтобы служить в качестве контроля для эндоцервикальной интраэпителиальной анализа 9.
  2. Сбор образцов эндоцервикса
    1. Вставьте стерильный расширитель соответствующего размера во влагалище без смазки. Используйте теплую воду, чтобы облегчить введение рефлектора и стерильную марлю, чтобы очистить слизь. Положение рефлектора обеспечивает полную визуализацию зева и эктоцервикса.
    2. Вставьте щетку в канала шейки эндоцервикальный канал, пока только щетина ближе всего к руке не видно. Поверните кисть по часовой стрелке на 360 °. Перенести щетку в трубку 15 мл, содержащую 5 мл среды IMDM.
    3. Сразу после сбора поместите пробирку, содержащую цитощеточка на льду. Для того, чтобы получить высокую жизнеспособность собранных интраэпителиальной клеток, доставить цитощеточка в лабораторию и процесса в течение 1 ч.

2. Endocervical Пример Обработка цитощеточка

  1. Вихревая труба, содержащая цитощеточка претендуете канала шейки 4 коротких (10 сек) инсультов.
  2. Центрифуга трубки, содержащая цитощеточка, в течение 10 мин при 250 х г.
  3. Осторожно удалите цитощеточка из трубки (не беспокоить осадок на дне пробирки) и добавляют 1 мл IMDM среде и поместите трубку на льду.
  4. Поместите цитощеточка на ситечко ячейки 100 мм в верхней части 50 мл трубки.
  5. Вымойте цитощеточка с 20 мл IMDM.
  6. Центрифуга трубки в течение 10 мин при 250 х г.
  7. Декантируют супернатант, и осажденные клетки ресуспендируют в 1 мл IMDM и в сочетании с уже ресуспендировали гранулы, описанной в разделе 2.3.
  8. Граф клеток с использованием автоматического счетчика клеток 10 или количества клеток с использованием гемоцитометра путем объединения 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл трипанового синего красителя. Аккуратно пипеткой вверх и вниз в десять раз, чтобы смешать клетки и краситель. Нагрузка 10 мклсмеси в отверстие любой из двух камер гемоцитометра. Граф все ячейки в пяти областях сетки. Держите отдельный подсчет жизнеспособных и нежизнеспособных клеток. Определение жизнеспособности клеток с использованием следующей формулы:% жизнеспособных клеток = нежизнеспособных клеток х 100 / общее количество клеток клетки.
    Определить последующую концентрацию клеток на мл (и общее число клеток) с использованием следующих вычислений. Общее количество клеток на мл = общее количество подсчитанных клеток х (коэффициент разбавления / количество подсчитанных площади) х 10000 клеток / мл.
  9. Замораживание изолированных эндоценвикальных клеток с использованием замораживания среды, содержащей 10% ДМСО и 90% FBS.

3. Проточная цитометрия

  1. Ресуспендируйте 1-3 × 10 5 клеток эндоценвикальных в 100 мкл FACS буфера (PBS , содержащим 1% бычьего сывороточного альбумина
  2. Добавить 1 мкл / 10 6 DEAD поправимо ЖИВОЙ Желтый Мертвый набор и антитела для поверхностных маркеров в концентрациях , описанных в таблице 1 / Cell Stain.
  3. Инкубируйте клетки в течение 30 мин при +4 ° С, в защищенном от света месте.
  4. Добавляют 1 мл FACS буфера, и клетки и центрифужные пробирки в течение 5 мин при 350 х г
  5. Повторное приостановить осадок клеток в 300 мкл 1% параформальдегидом.
  6. Готовят управления компенсацию с использованием бусин и антитела, используемые для окрашивания путем добавления 100 мкл буфера FACS и одну каплю бусинок и ту же концентрацию антител, используемых для окрашивания образца.
  7. Приобретать запятнанные бусы и образцов на проточном цитометре, оборудованном с 405 нм, 488 нм и 635 нм лазеров.

4. Endocervical гамма-дельта Т-клеток изоляции

  1. Магнитная изоляция борта
    1. Повторное приостановить осадок клеток канала шейки (≤10 7 общего числа клеток), описанный в 2.6, в 40 мкл буфера , включенного в гамма - дельта микрогранулами набора TCR ссылка в Таблице материалов и реактивов.
    2. Следуйте инструкциям по установке для протокола окрашивания два этапа: во-первых, остроумиеч анти-TCR-гамма-дельта гаптен-антитело и во-вторых, с анти-гаптен микрогранулы-FITC
    3. После инкубации 15 мин при 4-8 ° С, промыть клетки путем добавления 1 мл буфера и центрифугируют при 300 х г в течение 10 мин. Декантируют супернатант переворачивая пробирку, и нажмите сухой с помощью листа бумаги.
    4. Повторное приостановить осадок клеток в 500 мкл буфера и при условии подготовки магнитную колонку, поместив его в соответствующий магнитный сепаратор в соответствии с протоколом производителя.
    5. Нанести клеточной суспензии на колонку и собирают немаркированные клетки, которые проходят через колонку и мыть 3x с соответствующим количеством буфера (500 мкл). Выполнение стадии промывки путем добавления в буфер в три раза, каждый раз, как только колонна резервуар пуст. Собрать общий сточные воды. Это непомеченная, отрицательная фракция клеток
    6. Удалить столбец образуют магнитный сепаратор и пипеткой 1 мл буфера на колонку и сразу вымывать фракцию с магнитномодулировэнная этикеткойэд клетки, крепко применяя поршень, поставляемый вместе с колонной.
      Примечание: Изолированные гамма-дельта Т-клеток уже флуоресцентно окрашивали для проточной цитометрии анализа, так как магнитно-меченными анти-гаптен микросферы сопрягаются с FITC флуоресцентного красителя.
  2. сортировки клеток
    1. Для сортировки клеток, меток эндоцервикса клеток с жизнеспособностью и фильеры панели антител, как описано в разделе 3.
    2. Установить электронные ворота на живом, CD45 + CD3 + и гамма - дельта - положительных клеток и выполняют сортировку клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Недавно мы проанализировали эндоцервикальные интраэпителиальной GD Т - клетки , и мы были первым , чтобы сообщить о потере эндоцервикальную гамма - дельта Т - клеток у ВИЧ - инфицированных женщин , 9, 11. Здесь мы опишем протокол для выделения и анализа подмножества эндоцервикальную гамма-дельта Т-клеток. Как показано на рисунке 1, Г.Д. Т - клетки могут быть легко обнаружены в образцах из канала шейки матки клето...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Оценка женских нижних половых путей уязвимости слизистой оболочки является важным компонентом клинических исследований, касающихся риска заражения и передачи ВИЧ-инфекции. Обычно FGT уязвимость по отношению к ВИЧ - инфекции оценивали путем измерения растворимых иммуномодуляторы в генитальных выделениях (цитокинов, хемокинов и антимикробных пептидов) 12, 13. Тем не менее, эти биомаркеры являются лишь ориентировочными вагинального воспаления, страдают от физиологи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют коммерческую или иную ассоциацию , которая может привести к конфликту интересов (например, фармацевтической акционерной собственности, консультации, консультативный членство платы, соответствующие патенты, или финансирование исследований).

Благодарности

Мы благодарим участников исследования Майами WIHS за их готовность участвовать в этой работе. Данные в этой рукописи были собраны Межведомственной исследование ВИЧ Майами женщин (WIHS). Содержание данной публикации является исключительной ответственностью авторов и не отражают официальную точку зрения Национального института здоровья (NIH). Эта работа была поддержана Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний и женского инфекционного исследования Межведомственная ВИЧ (WIHS) [грант номер U01 AI103397], Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения [номер гранта P30AI073961], Национальный центр Выросшие трансляционные наук и Национальный институт по проблемам здоровья меньшинств и здравоохранения диспаритета, Национальный институт здравоохранения [номер гранта UL1TR000460 и 1KL2TR000461] и Национальный институт здоровья ребенка и развития человека, Национальный институт здравоохранения [номер гранта K23HD074489].

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Цитобраш Плюс GT (CareFusion, Сан-Диего, Калифорния, США
IMDM, модифицированная среда Dulbecco's от Iscove Автоматизированный счетчик клеток ThermoFisherScientific 12440061
Beckman Coulter (Анализатор жизнеспособности клеток серии Vi-CELLBeckman Coulter496178
ДМСО, диметилсульфоксида Сигма Олдрич D2650
FBS, Фетальная бычья сывороткаInvitrogen, Gibco26140-079
PBSInvitrogen, Gibco10010023
BSASigma AldrichA-9647
LIVE/DEAD Исправляемый набор для окрашивания желтыми мертвыми клетками Life Technologies,L349S9
1% параформальдегидSigma Aldrich D6148
Проточный цитометр Фортесса Becton Dickinson
UltraComp eBeadseBioscience01-2222-42
ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, США)Life TechnologiesA10346
anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit Милтени Милтеньи Биотек Инк.130-050-701
Колонна103-042-201
Сепаратор4124
МС МАКС

Ссылки

  1. Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
  2. Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature. 464, 217-223 (2010).
  3. Hayday, A. C. gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).
  4. Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).
  5. Autran, B., et al. T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection. Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).
  6. Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future. Front Immunol. 5, 687(2014).
  7. Hayday, A. C., Spencer, J. Barrier immunity. Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).
  8. Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).
  9. Strbo, N., et al. Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women. AJRI. 75, 134-145 (2016).
  10. Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).
  11. Alcaide, M. L., et al. Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study. PloS one. 11, e0153045(2016).
  12. Masson, L., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).
  13. Fichorova, R. N., et al. Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives. Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).
  14. Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. JoVE. , (2014).
  15. McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, e85675(2014).
  16. Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

TCRCD45CD3

Похожие статьи