Методическая статья

Использование моноцитов монослоя анализе для оценки Fcγ рецептор-опосредованного Фагоцитоз

19.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55039

⸱

2 января 2017 г.

 , 
1Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 2Centre for Innovation, Canadian Blood Services

В этой статье

Краткое содержание

Моноцитарный монослойный анализ (MMA) - это анализ in vitro, в котором используются изолированные первичные моноциты, полученные из периферической цельной крови млекопитающих, для оценки Fcγ-рецептора (FcγR)-опосредованного фагоцитоза.

Аннотация

Хотя первоначально разработанный для прогнозирования исходов переливания серологически несовместимой крови, моноцитарный монослойный анализ (MMA) является очень универсальным анализом in vitro, который может быть модифицирован для изучения различных аспектов антител и Fcγ-рецептора (FcγR)-опосредованного фагоцитоза как в исследовательских, так и в клинических условиях. В анализе используются адгезивные моноциты из мононуклеарных клеток периферической крови, выделенных из цельной крови млекопитающих. ММА был описан для использования в исследованиях как на людях, так и на мышах. Эти моноциты экспрессируют FcγR (например, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB и FcγRIIIA), которые участвуют в иммунных реакциях. MMA использует механизм FcγR-опосредованных взаимодействий, в частности, фагоцитоза, когда сенсибилизированные антителами эритроциты (RBC) прилипают и/или активируют FcγR и впоследствии фагоцитируются моноцитами. In vivo, в первую очередь тканевые макрофаги, обнаруженные в селезенке и печени, осуществляют FcγR-опосредованный фагоцитоз антител-опсонизированных эритроцитов, вызывая внесосудистый гемолиз. Оценивая уровень фагоцитоза с помощью ММА, можно исследовать различные аспекты FcγR-опосредованного процесса in vivo. Некоторые области применения ММА включают прогнозирование клинической значимости алло- или аутоантител в условиях переливания, оценку препаратов-кандидатов, которые способствуют или ингибируют фагоцитоз, а также сочетание анализа с флуоресцентной микроскопией или традиционным западным иммуноблоттингом для изучения нисходящих сигнальных эффектов препаратов или антител, взаимодействующих с FcγR. Некоторые ограничения включают трудоемкость этого метода, который занимает целый день от начала до конца, и требование одобрения исследовательской этики для работы с кровью млекопитающих. Тем не менее, при усердии и адекватной подготовке, результаты ММА могут быть получены в течение 24 часов.

Введение

Моноцитарный монослойный анализ (MMA) - это анализ in vitro, первоначально разработанный для лучшего прогнозирования результатов переливания крови у пациентов с ауто- или аллоантителами к эритроцитам (эритроцитам)1-5. Оценивая влияние антител к эритроцитам в опосредующем фагоцитоз, опосредованный Fcγ-рецептором (FcγR)-опосредованным с помощью этого анализа in vitro, можно предсказать клинический исход in vivo. Действительно, ММА успешно используется для предотвращения иммунного разрушения антителоспособных эритроцитов, несмотря на переливание серологически несовместимойкрови. Типичная процедура предварительного переливания крови для тестирования на совместимость, также называемая перекрестным соответствием, включает в себя серологические методы, которые включают определение типа крови пациента на антигены ABO и резус-фактор и скрининг на наличие антител к эритроцитаму пациента. Кровь, совместимая по АВО/резус-фактору, отбирается, и если антитела присутствуют, предпринимается попытка идентифицировать их, чтобы в дальнейшем можно было выбрать кровь для переливания, чтобы избежать этих антигенов. Идеальный результат перекрестного согласования происходит, когда вся донорская кровь серологически совместима с кровью пациента, что снижает риск посттрансфузионного гемолиза7. Тем не менее, эта система недостаточна для небольшой группы пациентов, которые получили аллоиммунизацию после повторного переливания крови или беременности. У этих пациентов вырабатываются аллоантитела против специфических антигенов эритроцитов. Некоторые из них продуцируют антитела к антигенам с очень высокой частотой в общей популяции, и, таким образом, становится все труднее для перекрестного сопоставления8,9. Сложность усложняется тем, что не все аллоантитела являются клинически значимыми; другими словами, связывание аллоантитела с эритроцитами, обнаруженными серологическим тестом, не обязательно приводит к гемолизу при переливании антигенположительной, несовместимой крови. ММА был первоначально разработан для оценки потенциального клинического значения серологически несовместимой крови в условиях переливаниякрови 1-5.

Поскольку известно, что внесосудистый гемолиз антител-связанных эритроцитов опосредован мононуклеарной фагоцитарной системой, первичные моноциты/макрофаги используются при разработке диагностических анализов. Первый анализ взаимодействия моноцитов, эритроцитов и антител был опубликован в 1975 году, но использованные неоптимальные условия привели только к образованию розетки (связыванию эритроцитов с периферией моноцита), и фагоцитоза не наблюдалось. Значительные изменения в анализе были внесены несколькими группами, что привело к анализу, для которого уровень фагоцитоза связанных с аллоантителами эритроцитов может быть коррелирован с клиническим исходом гемолиза1-5. Недавно были изучены оптимальные условия хранения клинических образцов и дальнейшая оптимизация условий анализа с целью повышения полезности клинического перекрестного сопоставления ММА с использованием аутологичных образцов пациентов11.

В дополнение к MMA для прогнозирования исходов переливания были использованы три других диагностических метода: тест на высвобождение 51Cr, розетточный тест и хемилюминесцентный тест (CLT). В тесте на высвобождение 51Cr пациенту вводят 51меченый Cr донорский эритроцит, а период полувыведения меченых эритроцитов контролируется и является прогностическим для выживаемости или клиренса после переливаниякрови 12,13. Поскольку в этом методе используются радиоактивные материалы, он применяется редко. Розеточный тест включает в себя смешивание и инкубацию моноцитов с эритроцитами и количественную оценку уровня образования розетки (без фагоцитоза)14. Клиническое значение антител in vivo включает активный фагоцитоз макрофагов, обнаруженных в селезенке и/или печени; Таким образом, данный метод не обеспечивает релевантного считывания фагоцитоза. CLT использует люминол для мониторинга окислительного взрыва во время фагоцитоза моноцитов эритроцитов, поскольку люминол флуоресцирует синим цветом при окислении в фагосоме15. Этот метод хорош, но загрязнение нейтрофилами может исказить показания. Параллельные сравнения были проведены для оценки чувствительности, практичности и воспроизводимости четырех доступных методов, и CLT и MMA были оценены выше16. Тем не менее, CLT в основном используется для оценки гемолитической болезни плода и новорожденного (HDFN), и оптимальный pH анализа 8,0 может поставить под угрозу уровень фагоцитоза11.

В дополнение к своей диагностической и клинической полезности, MMA был модифицирован для других исследовательских целей. Действительно, ММА может служить не только функциональным анализом для устранения расхождений между серологией и биологией, но и использоваться для ретроспективного исследования причины гемолизапосле внутривенной иммуноглобулиновой терапии (ВВИГ). Он также был использован для изучения структуры-функции химических ингибиторов FcγR-опосредованного фагоцитоза18-20 и для изучения нисходящей сигнализации FcγR-опосредованного фагоцитоза21. В нашей лаборатории, в дополнение к использованию человеческого ММА, мы разрабатываем мышиный ММА с использованием первичных мононуклеарных клеток периферической крови мыши (PBMC) и аутологичных эритроцитов. Обоснование заключается в том, что скрининг антител, которые могут индуцировать FcγR-опосредованный фагоцитоз, является промежуточным звеном в развитии мышиной модели аутоиммунной гемолитической анемии (АМСЗ) in vivo (неопубликованные данные). Различные модификации сосредоточены на различных аспектах взаимодействия антител IgG и FcγR, которые индуцируют фагоцитоз.

Протокол

Получить разрешение на использование человеческих образцов по исследовательской этике платы / этическими комитетами, и получить подписанное согласие от всех доноров. ММА также может быть выполнена с использованием РВМС мышей таким же образом, как человеческий анализа, после получения одобрения использования животных по этике. ММА использует методы асептики культуры ткани.

Примечание: см Рисунок 1.

Примечание: Хотя мы рекомендуем применение биоизоляции шкафа 2-го уровня в процессе анализа для поддержания асептики, поскольку метод является лишь "краткосрочный" метод культуры, не хватает на самом деле времени для бактерий загрязнять анализа. Таким образом, если уровень 2 биоизоляции шкафа не существует, а не покупать один раз для этого анализа, анализ может быть выполнен за пределами биосдерживанию шкафа, на открытом стенде. Использование 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2, тем не менее, это не вариант , и должен быть использован дляоптимальные результаты.

1. периферической крови мононуклеарных клеток Изоляция

  1. Получить всю кровь человека от здорового донора или пациента через венепункции с использованием vacutainers, содержащих кислотно-цитрат-декстрозы (ACD) антикоагулянт (желто-топ трубки).
    Примечание: цельную кровь можно хранить в ДСА при комнатной температуре (18-22 ° С) в течение до 36 ч , прежде чем перейти к следующему шагу 11. Как правило, 1-2 10-мл пробирки Vacutainer цельной крови достаточно для анализа.
  2. Развести цельной крови 1: 1 об / об в теплой полной среде RPMI (RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 20 мМ HEPES и 0,01 мг / мл гентамицина).
  3. Изолировать одноядерные клетки периферической крови (МНПК) из разбавленных цельной крови с помощью центрифугирования в градиенте плотности, в соответствии с рекомендациями производителя (см перечень материалов). Слой разбавленную кровь очень медленно по градиенту плотности (подогревают до комнатной температуры, 18-22 ° C).
    Примечание: сведение к минимуму количества Mixiнг на границе раздела для оптимального разделения крови путем тщательного наслоения смесь крови по каплям способом или с помощью пипетки.
    1. Разрешить смесь крови медленно слой на поверхности верхней части градиента плотности, помещая наконечник пипетки близко к градиенту плотности и позволяя смеси крови стекать вниз по стороне трубки очень медленно.
    2. В зависимости от масштаба эксперимента, слоя 10 мл смеси крови на вершине 3 мл градиента плотности (в трубе 15 мл) или слой 35 мл смеси крови на вершине 15 мл градиента плотности (в 50 мл трубка). Как правило, 10 мл цельной крови дает 10 миллионов МНПК, с некоторыми донорами к донору вариации.
      Примечание: Очень важно, что нет никакого смешивания смеси крови с градиентом плотности. Смесь крови должен слой на поверхности градиент плотности и медленно подниматься, пока вся кровь не дойдет до верхней части градиента плотности.
    3. Центрифуга слоистую смесь при 700 мкг в течение 30 мин без тормозов. CENTRifuged смесь должна разделиться на 5 слоев (сверху вниз): плазма, охристые пальто (содержащие МНПК), градиент плотности материала, гранулоциты и RBCs.
    4. Удаляют большую часть плазмы и осторожно извлечь содержимое охристые пальто (РВМС) в новый 15-мл трубки с помощью пипетки Пастера и всасывания лампу.
      Примечание: Удаление слоя светлого сгустка крови эффективно осуществляется путем применения всасывания на пипетки Пастера, выполняя круговое движение вокруг внешней стороны слоя, с кончиком пипетки напротив трубки.
  4. Промыть Выделенную МНПК три раза рН 7,3 фосфатно-солевом буфере (PBS) путем центрифугирования при 350 х г в течение 10 мин (с полными тормозами) между промывками. Развести осадок МКПК в полной среде RPMI. В зависимости от размера гранул, 3-7 мл среды достаточна.
  5. Граф РВМС с использованием трипанового синего и гемоцитометра. Только рассчитывать те клетки, которые не осквернена трипановым синим. Reconstitutе РВМС до 1750000 клеток / мл в полной среде RPMI.
  6. Семенной 400 мкл (700000 клеток) в каждую лунку 8-камеры слайде. Инкубировать слайд в 37 ° C, полностью увлажненном инкубаторе тканевых культур (с добавлением 5% CO 2) в течение 1 часа , чтобы позволить моноциты / макрофаги придерживаться.

2. Предварительная обработка прилипших моноцитов

Примечание: Этот шаг необходим только в том случае ищет пути ингибировать или усиливать фагоцитоз.

  1. Предварительная обработка придерживалась моноцитов с любым препаратом (ами) или соединением (ями), представляющих интерес. Развести препарат (ы) или другого исследуемого материала до нужной концентрации с использованием полной среды RPMI.
    Примечание: Например, 200 мкг / мл иммуноглобулин, как правило, используется для получения 95-100% ингибирование фагоцитоза при использовании человеческих моноцитов.
  2. Отберите и отбросить супернатант, содержащий любые не прилипшие клетки из 8-камеры слайде после 1-часовой инкубации (после стадии 1.6). Замените его на 400мкл лекарственного препарата или другого лечения и инкубировать в течение 1 ч при 37 ° С.
    1. При аспирационных и замене решения в 8-камеры слайде, убедитесь, чтобы контролировать поток флюидов, так что слабо прилипшие клетки не отрываться. Кроме того, работают только с 2-3 пустых лунок в то время, и избежать высыхания лунок.
      Примечание: Как правило, каждая обработка выполняется в технических трехкратном повторе.

3. Опсонизация из R 2 R 2 красных кровяных клеток

Примечание: R 2 R 2 , используемый здесь, получены из коллекции Центра крови (Canadian Blood Services), но они также являются коммерчески доступными. Опсонированных R 2 R 2 Эритроциты используют в качестве положительного контроля для FcγR-опосредованного фагоцитоза. Наивные R 2 R 2 следует хранить в растворе Alsever ( в, чтобы продлить срок годности) при 4 ° С в течение 1 месяца. Решение Alsever выполнен в доме и состоит из 0,8% Вес / об тринатрийцитрата (дигидрат), 1,9% вес / об декстрозы, 0,42% вес / об хлорида натрия и 0,05% вес / об раствором лимонной кислоты (моногидрат). Если R 2 R 2 клетки отсутствуют, другие Резус-phenotyped клетки, такие как R 1 , R 2, R 1 , R 1, R 1 г, или R 2 г, могут быть использованы.

  1. Мытье R 2 R 2 (CDE / CDE) красных кровяных клеток в PBS в общей сложности три раза с помощью центрифугирования при 350 мкг в течение 5 минут каждый.
    Примечание: Количество эритроцитах, необходимых зависит от экспериментального размера и может быть снова рассчитанным. Всегда мыть избыточное количество эритроцитах, так как эритроциты теряются во время каждой стирки из-за лизиса или во время удаления надосадочной жидкости. Например, в эксперименте с 5 процедур и 2 управления, все проведенные в технических трехкратном повторе, имеется в общей сложности 21 скважины. 21 лунок с 400 мкл / лунку 1,25% смеси РБК указывает на то, что 105 мкл упакованной, опсонизированным необходимы РБК. 200 мкл RBC должен быть первоначально моют и 150 & #181, L должно быть опсонизированным чтобы гарантировать, что имеется достаточное количество эритроцитах на этапе фагоцитоза.
  2. Opsonize промытый R 2 R 2 лепешку смесью 1: 1 об / об поликлональные анти-D антител из сыворотки крови человека и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37 ° С, с периодическим перемешиванием.
    Примечание: Если поликлональные анти-D антитела не доступны, можно использовать моноклональные анти-D-антитела, которые являются коммерчески доступными, или анти-D, который обычно используется для Rh иммунной профилактики, которая может быть получена из банков крови или переливания Сервисы. Тестирование Оптимизация должна проводиться в начале, при настройке анализа, и всякий раз, когда переключение много не-титровали поликлональных антител или переключение на моноклональное антитело. Это позволяет определить оптимальную концентрацию или объем анти-D, необходимого для теста антиглобулиновой (IAT) результат между 3+ и 4+ и в результате фагоцитоза между 70-90 фагоцитирующих эритроцитах на 100 моноцитов подсчитанных.
  3. Промыть opsonizeD R 2 R 2 в общей сложности три раза в PBS с помощью центрифугирования при 350 мкг в течение 5 минут каждый.
    Примечание: Успешное опсонизации R 2 R 2 может быть подтверждена путем осуществления непрямой IAT. Если коротко, то вторичные поликлональные анти-человеческие антитела добавляют для связывания первичных антител opsonizing на RBC поверхностях, и усиленный сигнал можно наблюдать в виде гемагглютинации. Подробный протокол производитель может быть найден в файле дополнительных материалов.
  4. Разведите промытый R 2 R 2 гранулы до 1,25% об / об с использованием полной среды RPMI.
    Примечание: Избыточный опсонированных R 2 R 2 могут быть сохранены в растворе Alsever в при 4 ° С в течение до недели.

4. Fc рецептор-опосредованного фагоцитоза

  1. Аспирируйте лекарственное средство или среда супернатант из 8-камеры слайд и добавить 400 мкл 1,25% об / об R 2 R 2 смеси. Инкубируют при 37 ° С в течение 2 ч.
  2. в кормовой частиэр 2 ч инкубации, удалите камеры с помощью адаптеров производителя. Промокните избыток R 2 R 2 на бумажное полотенце. Убедитесь, что слайд не высыхает.
  3. Заполните 100-мл химический стакан с PBS. Погрузитесь и мыть слайд, медленно перемещая слайд вперед и назад (около 30-40 ходов) , чтобы удалить большую часть ун-фагоцитированы R 2 R 2.
  4. Удалить слайд из PBS. Промокните излишки PBS, используя бумажное полотенце или ткань и Высушите слайд.
  5. Закрепите высушенный на воздухе слайд в 100% метанола в течение 45 с. Затем, воздушно-сухой фиксированный слайд.
    Примечание: Слайды могут быть закреплены с помощью другого метода , который является более совместимым для окрашивания вниз по течению, такие как Грюнвальд-Гимза 21 или пятно Райт-Гимза 22.
  6. Установите слайд, используя в доме-производства elvanol гистологическая среда (или другой коммерчески доступный гистологическая среда) и добавить покровные.
    Примечание: Elvanol монтажная среда состоит из 15% вес / объем росмолы спирт lyvinyl и 30% об / об глицерине в PBS. Смесь нагревают до тех пор, вся смола не растворится и глицерин, гомогенно смешанным. Это может быть заменен другими коммерчески доступными монтажной средой.
  7. Разрешить монтирование высохнуть в течение ночи перед количественной оценки.

5. Количественное фагоцитоза

  1. С помощью фазово-контрастного микроскопа и 40X линзы объектива, вручную определить количество фагоцитирующих событий путем подсчета по меньшей мере , 200 моноциты и количество фагоцитирующих R 2 R 2 в пределах этих моноцитов. Иметь один счетчик в каждой руке , чтобы одновременно определить число моноцитов и число фагоцитированы R 2 R 2.
  2. Получите среднюю фагоцитарную индекс путем деления числа фагоцитирующих R 2 R 2 по количеству моноцитов и умножения на 100. Экспресс данные как среднее значение (среднее значение фагоцитарного индекса) ± стандартная ошибка среднего (SEM).

Результаты

Следуя важные шаги на рисунке 1 и процедуре , описанной выше, ММА может быть воспроизводимо выполняется. Иммуноглобулин был использован в качестве примера для ингибирования фагоцитоза на рисунке 2. Иммуноглобулин, как известно, связывает и блокирует рецепторы Fc, препятствуя таким образом вниз по течению исход фагоцитоза. Титрованием количество IVIG , используемый, наблюдается ингибирование в зависимости от дозы, в которой при концентрации выше 200 мкг / мл в результате близко к ингибированию 100% и концентрации ниже 0,5 мкг / мл не ингибирует у всех (фиг.2А). Когда индексы фагоцитирующих трансформируются и нормализованы к положительному управления R 2 R 2 , в качестве 0% ингибирования, ингибированного кривой с IC 50 3 мкг / мл может быть определена (Фигура 2В).

В дополнение к выполнению анализа последовательно, quantificaние анализа иногда может быть затруднено. Рисунок 3 представляет собой совокупность фазово-контрастной микроскопии изображений различных горок ММА. С опытом микроскопии, можно отличить моноцитов от загрязняющего РБК (Рисунок 3D) или вакуоли из фагоцитированных RBC (рис 3B). Плотные скопления клеток и / или их остатков следует избегать во время количественной оценки (рис 3Е и F). Кроме того , следует избегать чрезмерного opsonizing на R 2 R 2 RBC, что привело бы к повышенному фагоцитоза , что overcrowds интерьер моноцитов и препятствует точной количественной оценки (рис 3C).

figure-results-1
Рисунок 1. Принципиальная схема ММА. Шаг за шагом изображение важнейших шагов в ММА: выделения РВМС из цельной крови, кормления, приклеенный monocytэс с опсонизированным R 2 R 2, и промывки камеры слайды. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. Внутривенный IgG (иммуноглобулин) ингибирует фагоцитоз в пробирке с использованием ММА. Иммуноглобулин, как известно, ингибирует фагоцитоз и используется в качестве контроля торможения в человеческом ММА. (А) Титрование ИГВВ привело к зависимому от дозы ингибирование фагоцитоза по сравнению с необработанным R 2 R 2 управления. Результаты показывают среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM) п = 3 экспериментов. Статистический анализ проводили с использованием Стьюдента -TEST: ** P≤0.01 и *** P≤0.001. (B) Ингибирование кривая ВВИГ с IC 50 °F 3 мкг / мл (пунктирная линия). Результаты показывают данные нормализованы к необработанным R 2 R 2 (0% ингибирования); среднее значение ± SEM из N = 3 экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3. фазово-контрастной микроскопии изображений образца слайдов под 40 - кратном увеличении. (A) Идеальный слайд , в котором моноциты фагоцитированы 1-2 R 2 R 2 в среднем (черные стрелки с характерным ореола свечения), с очень немногими, загрязняющего ун-фагоцитированных R 2 R 2 в фоновом режиме (белые стрелки). (B) Как показано на этом слайде, моноциты иногда имеют увеличенные вакуоли (белые стрелки), которые могут быть ошибочно приняты за фагоцитированы R 2 R 2. (C </ сильный>) Когда R 2 R 2 были более опсонизированным, более 4-5 фагоцитированы R 2 R 2 на моноциты (черные стрелки) делают точный подсчет трудно, так как R 2 R 2 переполнены в моноцитов и отдельной клетке границы нельзя отличить. (D) Недостаточная промывка слайде приводит к обильному R 2 R 2 загрязнения (белые стрелки), которые могут быть ошибочно приняты за прилипших эритроцитах. (Е) Иногда, моноциты и загрязняющие Эритроциты могут образовывать кластеры. Кластеры также указывают на бактериальное загрязнение, чего следует избегать. (F) Моноциты могут образовывать более крупные агрегаты, которые следует избегать во время количественной оценки. Используя случайный выбор полей для просмотра, панель А то, что обычно наблюдается, если ММА была выполнена должным образом. Шкала бар составляет 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесьдля просмотра увеличенной версии этой фигуры.

Обсуждение

ММА является трудоемкая техника, которая требует специальных знаний как в тканевой культуре и микроскопии. Есть несколько важных шагов для обеспечения успеха: 1) генерация моноцитов монослоя; 2) опсонизация из эритроцитах, и 3) ручной Количественное. Моноцитов монослой не прилипает очень сильно к камере горкой, так что физиологический рН должно поддерживаться на протяжении всего теста 11 и достаточное количество МНПК должны быть посеяны. Энергичное пипеток, которые могли бы нарушить прилипшие клетки, следует избегать. Один из подходов, чтобы всегда удалять и добавлять решения из того же угла камеры и чтобы гарантировать, что движение происходит медленно и постепенно. Точно так же, в течение последней стадии промывки, чтобы удалить избыток RBCs, движение должно быть медленным и устойчивым. Это обеспечивает минимальное нарушение к монослоя при этом удаляя большую часть не-фагоцитированы эритроцитах. Недостаточная промывка приведет к высокому фоне загрязняющими эритроцитах, что делает ручной кваntification трудно. Во- вторых, R 2 R 2 Эритроциты должны быть достаточно опсонизированным для получения среднего фагоцитарный индекс 80-120 для управления фагоцитоза. Этот желаемый диапазон фагоцитарной баланс между простотой подсчета (например, моноциты с более чем 5 фагоцитированы Эритроциты трудно точно количественно) и поддержание достаточного количества фагоцитоза для статистического анализа. Степень опсонизация может быть подтверждена IAT, и чтение между 3+ до 4+ требуется. R 2 R 2 Эритроциты должны быть отброшены , если есть избыток лизиса во время стирки, когда надосадочную жидкость становится темно - красным, или когда значительное снижение фагоцитоза наблюдается в экспериментах , в связи со старением клеток при хранении. И, наконец, руководство Количественное с помощью микроскопа может быть сложно, особенно при сравнении между отсчеты персонала лаборатории и между экспериментами. Рассматривая ту же область на каждую лунку, или просто путем подсчета больше клеток, Более последовательным граф может быть получен. Бок о бок обучение с опытным специалистом и использование назначенного набора учебных слайдов рекомендуется.

Одним из основных критика ММА является субъективность ручной шага количественной оценки. Тем не менее, с надлежащей подготовки, последовательность может быть получена через различные счетчики. Другим ограничением является то внутренние различия доноров к-донора в моноцитов фагоцитарных способностей и в R уровней экспрессии антигена 2 поверхности 2 R, которая является источником изменения данных при работе с человеческими образцами.

Другие альтернативные методы доступны для изучения FcγR-опосредованный фагоцитоз. Большинство коммерческих наборов используют выход флюоресценции для мониторинга фагоцитоз (например, bioparticles, рН-чувствительный флуоресцентный белок, или IgG , меченные флуоресцентными латексные шарики). Использование флуоресцентного продукции делает предложение более объективной количественной оценки, но также необходимо конрим доступности, стоимости, а также обучение, связанное с использованием флуоресцентного микроскопа или проточного цитометра, а также последовавшей зависимости от коммерчески доступных наборов.

И, наконец, этот анализ может быть изменен в зависимости от вопроса исследования. Например, при тестировании ингибирования наркотиков фагоцитоза, моноциты могут либо быть предварительно обработаны или совместно инкубировали с обоими препаратами и опсонизированных эритроцитах (т.е. конкуренция анализ). Расположенный ниже по потоку передачи сигналов антител различных подтипов, химерные антитела или рекомбинантные конструкты также могут быть проверены. С недавних прорывов в разработке универсального антигена-нуль крови через 24, ММА может быть использован в начальных экранах этих антиген-нуль эритроцитах с различными антителами , чтобы оценить , существует ли действительно снижена эффективность в инициировании фагоцитоз.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят Канадскую службу крови за награду по программе стипендий для выпускников T.N.T. Это исследование получило финансовую поддержку от Центра инноваций Канадской службы крови, финансируемого федеральным правительством (Министерством здравоохранения Канады) и провинциальными и территориальными министерствами здравоохранения. Изложенные в настоящем документе взгляды не отражают точку зрения федерального, провинциального или территориального правительств Канады.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Кислотные цитрата декстрозы (ACD) вакутайнерыBDREF364606
RPMI 1640SigmaR8758
HEPESBioshopHEP003.100
Фетальная бычья сывороткаMulticell 080150
ГентамицинGibco15710-64
Ficoll-Paque PLUSGE17-1440-03https://www.gelifesciences.com/
Фосфатный буферный физиологический растворSigmaD8537
8-камерные предметные стеклаLab-Tek-ll154534
R2R2 (cDE/cDE) эритроцитыКанадская службаКоммерчески доступно (например, http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)
Поликлональный анти-D из сыворотки крови человекаGamma BiologicsDIN 02247724Может быть заменен коммерчески доступным моноклональным анти-D или резус-иммуноглобулином
100% метаноломCaledon6700-1-42
Поливиниловая спиртовая смолаSigmaP8136Может быть заменен на имеющееся в продаже крепление
UltraPure глицеринInvitrogen15514-011
Защитные накладкиVWR48366 067
Novaclone anti-IgGImmucorgamma5461023Опционально для IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf)
крови

Ссылки

  1. Hunt, J. S., Beck, M. L., Hardman, J. T., Tegtmeier, G. E., Bayer, W. L. Characterization of human erythrocyte alloantibodies by IgG subclass and monocyte interaction. Am J Clin Pathol. 74 (3), 259-264 (1980).
  2. Schanfield, M. S., Stevens, J. O., Bauman, D. The detection of clinically significant erythrocyte alloantibodies using a human mononuclear phagocyte assay. Transfusion. 21 (5), 571-576 (1981).
  3. Branch, D. R., Gallagher, M. T., Mison, A. P., Sysiokian, A. L., Petz, L. D. In vitro determination of red cell alloantibody significance using an assay of monocyte-macrophage interaction with sensitized erythrocytes. Br J Haematol. 56 (1), 19-29 (1984).
  4. Hunt, J. S., Beck, M. L., Wood, G. W. Monocyte-mediated erythrocyte destruction. A comparative study of current methods. Transfusion. 21 (6), 735-738 (1981).
  5. Noumsi, G. T., Billingsley, K. L., Moulds, J. M. Successful transfusion of antigen positive blood to alloimmunised patients using a monocyte monolayer assay. Transfus Med. 25 (2), 92-100 (2015).
  6. Moulds, J. M. Introduction to antibodies and complement. Transf Apher Sci. 40 (3), 185-188 (2009).
  7. Grandstaff Moulds, M. K. Antibody identification. Transf Apher Sci. 40 (3), 195-197 (2009).
  8. Hendrickson, J. E., Tormey, C. A., Shaz, B. H. Red blood cell alloimmunization mitigation strategies. Transfus Med Rev. 28 (3), 137-144 (2014).
  9. Hamilton, J. R. Common and frequently encountered antibodies. Transfus Apher Sci. 40 (3), 189-194 (2009).
  10. Kenna, M. A., Cooper, R. A., Schrieber, A. D. Effect of papain on the interaction between human monocytes, erythrocytes and IgG. Blood. 46 (2), 245-252 (1975).
  11. Tong, T. N., et al. Optimal conditions for the performance of a monocyte monolayer assay. Transfusion. , Epub ahead of print (2016).
  12. Gray, S. J., Sterling, K. The tagging of red cells and plasma proteins with radioactive chromium. J Clin Invest. 29 (12), 1604-1613 (1950).
  13. Mollison, P. L., Veall, N. The use of the isotope 51Cr as a label for red cells. Br J Haematol. 1 (1), 62-74 (1955).
  14. Sebring, E. S., Polesky, H. F. Detection of fetal hemorrhage in Rh immune globulin candidates. A rosetting technique using enzyme-treated Rh2Rh2 indicator erythrocytes. Transfusion. 22 (6), 468-471 (1982).
  15. Downing, I., Templeton, J. G., Mitchell, R., Fraser, R. H. A chemiluminescence assay for erythrophagocytosis. J Biolumin Chemilumin. 5 (4), 243-250 (1990).
  16. Fabron, A. Jr, et al. Application of noninvasive phagocytic cellular assays using autologous monocytes to assess red cell alloantibodies in sickle cell patients. Transfus Apher Sci. 31 (1), 29-35 (2004).
  17. Michelis, F. V., et al. Acute hemolysis after intravenous immunoglobulin amid host factors of ABO-mismatched bone marrow transplantation, inflammation, and activated mononuclear phagocytes. Transfusion. 54 (3), 681-690 (2014).
  18. Rampersad, G. C., et al. Chemical compounds that target thiol-disulfide groups on mononuclear phagocytes inhibit immune mediated phagocytosis of red blood cells. Transfusion. 45 (3), 384-393 (2005).
  19. Purohit, M. K., et al. Structure-activity relationships of pyrazole derivatives as potential therapeutics for immune thrombocytopenias. Bioorg Med Chem. 22 (9), 2739-2752 (2014).
  20. Neschadim, A., Kotra, L. P., Branch, D. R. Small molecule phagocytosis inhibitors for immune cytopenias. Autoimmun Rev. 15 (8), 843-847 (2016).
  21. Fitzer-Attas, C. J., et al. Fcgamma receptor-mediated phagocytosis in macrophages lacking the Src family tyrosine kinases Hck, Fgr, and Lyn. J. Exp Med. 191 (4), 669-682 (2000).
  22. Allhorn, M., et al. The IgG-specific endoglycosidase EndoS inhibits both cellular and complement-mediated autoimmune hemolysis. Blood. 115 (24), 5080-5088 (2010).
  23. Li, L., et al. Inhibition of phagocytic recognition of anti-D opsonized Rh D+ RBC by polymer-mediate immunocamouflage. Am J Hematol. 90 (12), 1165-1170 (2015).
  24. Kwan, D. H., et al. Toward efficient enzymes for the generation of universal blood through structure-guided directed evolution. J Am Chem Soc. 137 (17), 5695-5705 (2015).

Перепечатки и разрешения

Теги

Фагоцитоз через Fc-рецепторыантитело-опосредованный фагоцитозмононуклеарные клетки периферической кровиопсонизация эритроцитовфазово-контрастная микроскопияфлуоресцентная микроскопиявестерн-блоттингингибирование внутривенным иммуноглобулиноманализ для трансфузиологии
Использование моноцитов монослоя анализе для оценки Fcγ рецептор-опосредованного Фагоцитоз
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.