Модель для периневральная инвазия в области головы и шеи карцинома роговых клеток

Краткое содержание

Периневральная инвазия (ПНИ) является общим признаком плоскоклеточного рака головы и шеи (HNSCC), обеспечивая более низкие показатели выживаемости. Его механизмы плохо изучены. Используя нейриты, полученные из ганглиев спинного корешка мыши, ограниченных полутвердым матриксом, можно исследовать пути, участвующие в PNI клеточных линий HNSCC.

Аннотация

Периневральная инвазия (ПНИ) обнаруживается примерно в 40% плоскоклеточных карцином головы и шеи (HNSCC). Несмотря на мультимодальное лечение с хирургией, лучевой и химиотерапией, локорегионарные рецидивы и отдаленные метастазы встречаются чаще, а общая выживаемость снижается на 40% по сравнению с HNSCC без ПНИ. Исследования in vitro путей, участвующих в HNSCC PNI, исторически были сложными из-за отсутствия последовательного, воспроизводимого анализа. Здесь описана адаптация анализа ганглия дорсального корешка (DRG) для исследования PNI при HNSCC. В этой модели DRG извлекаются из позвоночного столба принесенной в жертву обнаженной мыши и помещаются в полутвердую матрицу. В течение последующих дней нейриты генерируются и растут радиально из клеточных тел DRG. Затем клеточные линии HNSCC размещаются периферически вокруг матрицы и проникают преимущественно вдоль нейритов в сторону DRG. Этот метод позволяет быстро оценить несколько условий обработки с очень высокими показателями успешности и воспроизводимости анализа.

Введение

Плоскоклеточный рак головы и шеи (HNSCC) является шестым по распространенности раком в США, с 10 000 смертей в год по всей стране и 300 000 смертей в год по всему миру¹. Общий прогноз для HNSCC остается неизменным на уровне 50% в течение последних нескольких десятилетий. Периневральная инвазия (ПНИ) является одним из наиболее заметных патологических признаков, предвещающих плохой прогноз у пациентов с HNSCC. К сожалению, ПНИ является частым явлением при ГНЦК и может быть обнаружена у 40% пациентов с ГНЦК^2,3.

PNI - это процесс, с помощью которого злокачественные клетки следуют вдоль нервов к соседним тканям, обеспечивая более высокие скорости локального и отдаленного распространения. Соответственно, PNI-положительные опухоли HNSCC имеют более высокую частоту локорегионарных рецидивов и отдаленных метастазов, что приводит к более низкой общей выживаемости по сравнению с пациентами с HNSCC без PNI^4-8.

Хотя лечение пациентов с ПНИ обычно максимизируется за счет использования хирургии, лучевой и химиотерапии, общая выживаемость этих пациентов все же снижается до 40% по сравнению с пациентами без ПНИ^9-11. Таким образом, очевидно, что существующие методы лечения HNSCC неэффективны в улучшении неблагоприятного прогноза, связанного с ПНИ. Подход к разработке таргетной терапии против ПНИ в ГНЦК был затруднен из-за слабого понимания факторов, регулирующих этот процесс. Отчасти это является следствием отсутствия согласованной модели in vitro для изучения ПНИ в HNSCC.

В последние годы несколько групп использовали модель in vitro для изучения ПНИ при преимущественно раке поджелудочной железы и предстательной железы^12-19. Эта модель использует нейриты, полученные из ганглиев дорсальных корешков, выделенных от мышей или крыс, в качестве суррогата для инвазии крупных нервов. Ганглии дорсальных корешков зафиксированы в обедненном фактором полутвердом матриксе, который представляет собой смесь солюбилизированных белков базальной мембраны, секретируемую клетками саркомы мышей Энгельбрета-Холма-Роя. Эта матрица позволяет отращивать нейриты и отслеживать отдельные раковые клетки вдоль этих нейритов. Здесь описана адаптация данной модели для обследования ПНИ в HNSCC.

Протокол

1. Приготовление культуральной среды и блюда (10 мин)

1. Добавьте 100 мкл Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) в лунки V-образным дном 96-луночного.
2. Удалить предварительно аликвоты флакона приблизительно 100 мкл полужидкой матрицы из морозильной камеры 20 ° C и поместите его непосредственно на льду.
   Примечание: Сделайте это до дорзального корневого ганглия (DRG) урожай, потому что полутвердые матрица занимает около 30 минут, чтобы добраться до жидкого состояния на льду, которая необходима для последующих шагов. Неспособность держать полутвердые матрицы на льду в любое время приведет матрицу капельку некачественный.
3. Этикетка со стеклянным дном культуры плиты с несмываемыми чернилами, создавая уникальные идентификаторы в каждом из четырех углов на нижней поверхности пластины. Место пластин правой стороной вверх на льду для охлаждения поверхности пластины.
   Примечание: выходы Каждая мышь 32 - 40 DRG, поэтому маркировать их от 1 до 40. Не надо предварительно холодок пидомашнее животное советы, как и охлажденные советы будут согревать в течение размещения капель матрицы, потенциально вводя различия в матричной последовательности.

2. Препарирование крысиных DRG (45 мин)

1. Эвтаназии в бестимусных голых мышей в соответствии с конкретными лабораторных протоколов, например, путем использования СО ₂ камеры и торакотомии.
2. Настройте область рассечение и микроскоп. Используйте чистую, стерилизуют и плоскую нижнюю сторону полистирола контейнеров для 15- или 50-мл конические пробирки.
   Примечание: Кроме того, они пригодны для использования в качестве поверхности рассекает, поскольку они недороги, одноразовые, и позволяют фиксации позвоночника с помощью булавок или игл. Используйте только стерилизованные инструменты и иглы.
3. Под естественным зрением, сделать продольный разрез вдоль позвоночника от корня хвоста к голове мыши с парой прямых или изогнутых тонких ножниц.
4. Используйте те же ножницы, чтобы поперечно разделяй ниже SacrАль позвоночника. Рассеките обе стороны позвоночника вплоть до основания черепа, используя ножницы. На данный момент, убедитесь, что шейный отдел позвоночника перерезают краниальном, насколько это возможно с помощью ножниц.
5. Обратите внимание на цервикальный конец позвоночника под операционным микроскопом при низкой мощности. Белый спинного мозга проявляется в середине костным кольцом, которое окружено различными количествами параспинальных мышц и мягких тканей.
6. Отделить спинной или превосходящую аспект первых 2 - 3 тел позвонков с микроскопическими пружинными ножницами. Используя пружинящее действие ножниц, открыть этот первоначальный костистые вырезать, чтобы гарантировать, что позвоночный рассечение тела произошел в средней линии. Продолжить небольшими шагами по направлению к крестцового отдела позвоночника, а затем рассекают позвоночника, выполнив одинаковые разрезы на брюшной или нижней аспекте тел позвонков.
   Примечание: необеспечение средней линии рассечения костного позвоночника приведет к снижению выхода DRG.
7. В This точка, позвоночник делится на две половины. Поместите один полугидрата позвоночник в сторону, со спинным мозгом на месте и лицевой стороной вниз на стерильную тарелку.
   Примечание: Выход из спинного мозга в месте будет препятствовать ДРГ от высыхания, так как DRGs глубоко в спинной мозг.
8. Закрепите либо конец другого полугидрата позвоночника с двумя 18-калибровочных игл на полистирольной рассечения платформе. Начиная с шейки матки конца (что очевидно, так как позвоночник уже, КСГ ближе друг к другу, и есть ребро инсерций), осторожно отгибают спинной мозг от приблизительно 4 вертебральных уровней.
9. Обратите внимание на сенсорные нервы (обычно два), соединяющие DRG. В области, где нервы вставки к DRG, мягко понять окружающие фасции с микроскопическими щипцов. Проанализируйте и дифферента этот фасции и другие нервные ткани с микроскопическими пружинными ножницами, чтобы освободить DRG. Нежный втягивание принесет DRG из своей позиции в костяной позвоночника.
   Примечание: УвеличениеМикроскоп мощности на этом этапе является полезным. Размозжение к DRG существенно ограничит рост невритов. Чтобы избежать этого, никогда не захватывая DRG непосредственно, а скорее путем захвата окружающих фасции.
10. Обрежьте периферических нервов (The DRG обычно имеет один периферийный нерв, который глубоко по отношению к рассекает зрения) с микроскопическими пружинными ножницами, чтобы освободить DRG.
    Примечание: Это проще всего выяснить, где нервные окончания и DRG начинается в то время как по напряжению, так что делает это сокращение как можно ближе к DRG на данный момент является идеальным. После этого дистальной ветви вырезают, ближние ветви обрезают, а также.
11. Обрежьте DRG любых паразитных нервных волокон или фасциальным вложений с помощью микроскопических пружинных ножниц. После адекватной изоляции, поместите DRG в комнатной температуре среды в 96-луночного V-образным дном.
    Примечание: Размещение темный фон под пластина делает визуализируя суб-мм белый DRGs легче. Только поместите один DRG в EACч хорошо; Таким образом, они могут быть объяснены более легко в последующих стадиях.
12. Повторите этот процесс весь путь вниз один полугидрата позвоночника, а затем другой. Каждая сторона дает 16 - 20 ДРГ, на общую сумму 32 - 40.
    Примечание: Если есть меньше DRGs, чем это, рассечение позвоночника необходимо проводить дальнейшую цефально и / или каудально. В DRGs становятся все более менее хорошо определена как один идет каудально.

3. Получение полутвёрдые Matrix Капельки (<1 мин на пластину)

1. Удалить один стакан хорошо нижнюю пластину из льда и поместите его на блок со льдом под операционным микроскопом. Убедитесь, что аликвоты матрицы остается на льду во все времена.
2. Поместите капельку 1,5-мкл матрицы в каждом из четырех углов со стеклянным дном пластины с 2-х мкл или 10-мкл micropipetter, оставляя расстояние по крайней мере, столь же большой, как и сама капельке от края стекла скважины.
   1. Поместите кончик пипетки непосредственно настекло под углом 45 градусов. Медленно пипеткой матрицу. Медленно отойти от стеклянным дном после того, как матрица занимается на пластине.
      Примечание: поверхностное натяжение между матрицей и стеклом должны создать идеальный полушарии каждый раз.
   2. Прекратить пипеткой непосредственно перед верхушкой пуст, так как непреднамеренное нагнетание воздуха в матрицу капельке составляет диаметр матрицы капельке гораздо большей и трудно удалить.
      Примечание: Используя вторую руку, чтобы стабилизировать пипетирования руку способствует более точного размещения.

4. Вставка DRG в полутвёрдые Matrix Капельки (<2 мин на пластину)

1. Оставьте пластину с матричными капель на короткое время при комнатной температуре (~ 1 мин). Это слегка напрягается матрицу, что делает его более легким для точного размещения DRG.
2. Совок (не понимают) DRG мягко с закрытыми микроскопическими пинцетом в левой руке. Опять же, темный фон, на маленький, белыйDRG облегчает визуализацию. Перенести DRG на кончик 21 иглы калибра в правой руке. Эта передача будет оставить остаточный носитель на пинцетом.
3. Аккуратно вставьте DRG в середину капельке матрицы с использованием 21 калибра иглы (рисунок 1). Большую часть времени, то КСГ легко релиз в матрицу и затем могут быть расположены по центру с иглой.
   1. Если КСГ прилипает к игле, использовать микроскопические щипцов, чтобы подтолкнуть DRG от иглы и в матрицу капельке. Фитиль от избыточных средств массовой информации из микроскопических щипцов с лаборатории салфеткой.
      Примечание: Введение средств массовой информации к матрице будет изменять диаметр, объем и последовательность анализа. Льдины с цветом или цветного фона письменной форме обеспечивает контраст, что облегчает визуализацию этого сложного процесса.
4. После того, как пластина имеет все четыре ДРГ, выполнить окончательную проверку, чтобы убедиться, что КСГ находится в центре матрицы капельке. приспосабливатьсяпо мере необходимости с 21-GUAGE иглой.
5. Перенести заполненную пластину на 37 ° С инкубатор. Это позволит укрепить полутвердый матрицу и зафиксировать DRG в заданном положении.
6. Повторите этот процесс для всех КСГ. Поместите пустой капли матрицы без DRG в качестве отрицательного контроля.
7. Добавить 4 мл среды DMEM с 10% FBS сред для каждого стеклянным дном пластины после завершения всех пластин и подвергая их 37 ° C инкубаторе в течение не менее 3 мин. Поместите пластину под небольшим углом и медленно добавить среды, таким образом, что он постепенно вступает в контакт с частями матрицы-DRG.
   Примечание: Если среда добавляется слишком быстро или энергично, матрицу и / или DRG может стать выбили.
8. Хранить анализы в 37 ° C инкубаторе в течение следующих 48 - 72 ч.
   Примечание: Периодическое рассмотрение анализов покажут круговую разрастание нейритов в направлении матрицы края (рисунок 2). Когда невриты больше, чем три четверти пути к матрице, егоУместно высевания клеток.

5. Подготовка головы и шеи клеток рака

Примечание: кроме головы и шеи клетки карциномы сквамозных клеток линии могут быть использованы в этой экспериментальной конструкции.

1. Поддержание плоскоклеточного линии клеток карциномы клеток в DMEM с 10% FBS в предпочтительных колбах или чашках для культивирования в 37 ° С инкубатор. Для подготовки клеток для экспериментов, а также засасывания все среды из культуральной колбы или блюдо и мыть его дважды PBS. Суспендирования клеток путем добавления соответствующего количества 0,025% трипсина в течение 5 мин с последующим DMEM с добавлением 10% FBS. Пипетка 4 мл клеточной и средств массовой смеси в культуральных чашках 6-мл.
   Примечание: Культуру пластина 6-мл обеспечивает более чем достаточное количество клеток, даже при менее чем 50% сплошности.
2. Expose клеточных линий ПРГШ к различным условиям за 24 ч до окрашивания и высева на анализе DRG. Повторная доза состояние после того, как клетки высевали, чтобы поддерживать последовательную environmeнт.
   Примечание: Добавить антитела, факторы роста, цитокины или других молекул к посуде клеточных культур 1 - 2 дней после рассечения мыши и имплантации DRG в матрицу.
3. Добавить люминесцентные клеточные пятна 1 ч до посева клеток (2 - 3 дня после сбора DRG и имплантации в матрицу).
   Примечание: Конкретные пятна, используемые здесь свободно проходят через клеточную мембрану; Тем не менее, после того, как взаимодействовать с внутриклеточными тиоловых групп, пятно остается внутри клетки и передается дочерним клеткам. Окрашивания значительно облегчает визуализацию в анализах. Эти временные пятна идеально подходят для этих анализов, поскольку флуоресценции присутствует в течение 2 - 3 дней, что сроки проведения этих экспериментов. Он также позволяет использование множества различных цветов и устраняет необходимость в создании флуоресцентного белка-трансфекции клеточных линий.
   1. Готовят 10 мкМ раствора красителя путем смешивания 2 мкл 10 мМ пятна запас клеток в 2 мл не содержащей сыворотки DMEMдля каждого состояния клеток. Подогреть это до 37 ° C перед добавлением к клеткам.
   2. Удалите культуральную среду внутри пластины 6-мл, оставляя прилипшие ПРГШ клетки на пластине. Добавить 2 мл фосфатного буферного раствора (PBS) и удалить 2 мл 10 мкМ клеток пятно / бессывороточной DMEM добавляли к каждой пластине
   3. Возвращение культуральную пластину 6 мл с клеточным пятном на 37 ° C инкубаторе в течение 40 мин.
   4. Через 40 минут, аспирата среду. Добавляют 2 мл PBS, а затем аспирацию его. Добавить 1 мл 0,025% трипсина к каждой пластине, и заменить их на 37 ° С инкубатор.
   5. Добавьте 2 мл DMEM с добавлением 10% FBS после 3 - 5 мин и переносят суспендированных клеток в конической трубе 15 мл. Спин клетки и ресуспендировали их в 1 мл DMEM с добавлением 10% FBS.
   6. Граф клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток, а затем добавить DMEM с 10% FBS для создания конечной концентрации клеток 300000 клеток на мл.

6. Покрытие головы и NКлетки рака Eck

1. Удалите с прозрачным дном пластины с матрицей-DRG анализов из инкубатора.
   Примечание: Опять же, они уместны, когда невриты, по меньшей мере 75% пути к краю матрицы, как правило, происходит через 2 - 3 дней. Это лучше всего видно с использованием по меньшей мере, объектив 10X.
2. Аспирируйте среды внутри стеклянным дном тарелку. Полностью аспирата среды внутри стекла хорошо без удаления матрицы DRG единиц.
3. Оформи 200 мкл 300000 клеток / мл среды с использованием пипетки 200-мкл. Поместите две капли ячеек над каждым анализом матрицы-DRG. Выполните этот шаг для каждой матрицы капельке, создавая четыре повторения каждого состояния ячейки на одной пластине.
   Примечание: полусферическую форму матрицы позволяет клеткам располагаться в кольце по периферии анализа (рис 3а, 3b) На рис. Нахождение пипетку с гладкой спусковой крючок делает размещение равномерного капель намного легче.
4. Подтвердите аналогичные числа клеток и диstribution различных условий клеток при 4X микроскопии.
5. Поместите прозрачным дном листы в 37 ° C инкубаторе в течение примерно 60 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, есть только небольшой объем клеток и средств массовой информации (~ 150 мкл), анализы не высыхают до нескольких часов времени инкубатора не прошло.
6. Через 60 мин осторожно добавляют 4 мл среды DMEM с 10% FBS, вдоль боковой стенки со стеклянным дном тарелку.
   Примечание: В течение определенного периода времени, клетки частично прилипают к нижней пластине, и способ добавления среды не нарушает клетки. Различные типы клеток может занять больше или меньше времени, чтобы начать прилипать к стеклянным дном тарелку.
7. Заменить любые экзогенные препараты или факторы роста в это время, чтобы сохранить прежние уровни концентрации.
8. Возвращение анализов на 37 ° С инкубатор, за исключением того, когда они исследуют под микроскопом. Количественно результаты этого анализа с помощью микроскопического изображения. Если коротко, то рассчитывать пряди периневральным инвазиив четырех квадрантах с использованием 4X микроскопического изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: микроскоп с 4-кратным объективных и флуоресцентных возможностей достаточно для фото-документирующего анализов. Размер анализов прекрасно вписывается в поле объектива 4X, который подробно описан достаточно, чтобы захватить отдельные районы периневральным вторжения. Периневральная инвазия становится очевидным в течение 24 ч, а за 48 ч, целостность анализов начинает ослабевать, так как опухолевые клетки делятся по периферии матрицы и вторжению. За 48 часов, есть также существенный отлив фибробластов от DRG, который затеняет визуализацию с использованием микроскопии светлого. Поэтому желательно фото-документировать результаты с 4 - кратным микроскопом , по крайней мере в два раза в течение этого окна (например, через 24 и 48 ч после посева клеток опухоли). Помните, что эти 3-мерные анализы, и это трудно полностью изображению весь анализ. Большинство периневральная инвазия происходит в плоскости, из нижней части пластины, где Тон клетки встроены в матрицу немного выше нижней части пластины. Поскольку этот самолет находится близко к горизонтали, подавляющее большинство невриты с опухолевыми клетками захватываются в образе одноуровневой в 4 раза.

Результаты

После рассечения DRG и размещение в матрице капельке, появление анализа должно походить на рисунок 1. Обратите внимание , что DRG не является идеально круглым, но по центру внутри матрицы капельке. Это позволяет разрастание нейритов в 360 градусов, как показано частично на фиг.2. Имейте в виду, что некоторые части DRG посылать невриты быстрее и в большем количестве, чем другие, как правило, соответствующие где эфферентные и афферентные нервные ветви вошл...

Обсуждение

Критические шаги в рамках Протокола

Наиболее важные шаги в рамках этого протокола являются точное рассечение и извлечение спинальных ганглиях. Правильное перерезка позвоночника и срединный-продольного деления на две Hemi-шипов имеют решающее значение для получения большого количества DRG. Во время вскрытия отдельных КСГ, ганглий никогда не следует обращаться непосредственно, а окружающие фасции должны быть схвачена с микроскопическими щипцов. Несоблюдение эт...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMEM/F-12 50/50 Смесь с L-глутамином и 15 мМ HEPES	Corning Cellgro	10-090-CV	Манассас, Вирджиния
Фетальная бычья сыворотка	Atlanta biologicals	S11150	Flowery Branch, GA
0,25% Трипсин-ЭДТА (1x)	Life Technologies Corporation	25200056	Гранд-Айленд, Нью-Йорк
Фосфатный буферный физиологический раствор 1x	Corning	21-040-CM	Манассас, Вирджиния
Matrigel hESC-Qualif Mouse	Corning Incorporated	354277	Бедфорд, Массачусетс
Гамма Облученные 35 мм стеклянные донные чашки	для культуры MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Ашленд, Массачусетс
SteREO Discovery.V8 Операционный микроскоп	Carl Zeiss Microimaging	495015-0021-000	Торнвуд, штат Нью-Йорк
Источник света Schott ACE I	Schott	A20500	Германия
CellTracker	Life Technologies Corporation	C2925	Карлсбад, Калифорния
BD BD Игла PrecisionGlide 18 G и 21 G	BD	305195	Франклин Лейкс, Нью-Джерси
Микродиссекционирующий пинцет премиум-класса	Гарвардский аппарат	60-3851	Холлистон, Массачусетс
Премиум тонкая операционная стандартная	Гарвардский аппарат	52-2789	Холлистон, Массачусетс
Пружинные ножницы премиум-класса	Гарвард Аппарат	60-3923	Холлистон, Массачусетс
Перевязочные щипцы	Гарвардский аппарат	72-8949	Холлистон, Массачусетс
Атимические обнаженные мыши (002019)	Лаборатория Джексона	002019	Бар-Харбор, Мэн