Использование GFP-меченый TMEM184A Построить подтверждения гепарин Receptor идентичности

Краткое содержание

Кодирующий конструкцию TMEM184A с GFP меткой на карбокси-конце, предназначенной для экспрессии эукариотических, использовали в тестах, предназначенных для подтверждения идентификации TMEM184A как гепарин рецепторов в клетках сосудов.

Аннотация

Когда новые белки идентифицированы путем изоляции и биоинформатики анализа аффинности на основе, они часто в значительной степени неизвестными свойствами. Антитела против специфических пептидов в пределах предсказанного последовательности позволяют некоторые эксперименты по локализации. Тем не менее, другие возможные взаимодействия с антителами, часто не могут быть исключены. Такая ситуация дала возможность разработать комплекс анализов в зависимости от последовательности белка. В частности, конструкция, содержащая последовательность гена, соединенную с кодирующей последовательностью GFP на С-конце белка, был получен и использован для этих целей. Эксперименты охарактеризовать локализацию, лиганд сродство, и усиление функции изначально были разработаны и проведены , чтобы подтвердить идентификацию TMEM184A как гепарин рецептора ^1. Кроме того, конструкция может быть использована для проведения исследований, касающихся мембранных вопросов топологии и подробные белок-лиганд. В настоящем докладе А.Р.Анж экспериментальных протоколов, основанных на GFP-TMEM184A конструкции, выраженной в клетках сосудов, которые могут быть легко адаптированы для других новых белков.

Введение

Идентификация белков-кандидатов для новых функций часто зависит от аффинности на основе протоколов изоляции с последующим определением частичной последовательности. Недавние примеры вновь выявленных белков включают трансмембранного белка 184А (TMEM184A), гепарин рецептор идентифицирован после того, как гепарин аффинных взаимодействий ¹ и TgPH1 домен белка pleckstrin гомологии , который связывает фосфоинозитидного PI (3,5) P ₂ ^2. Другие новые идентификации белков включает в себя прямой анализ последовательности пептидов , таких как , что с помощью Vit, и др. которые использовали трансмембранных пептидов для идентификации белковых продуктов из ранее охарактеризованных генов ^3. Аналогичным образом , идентификация новых белковых последовательностей может быть осуществлено с использованием биоинформатики поиске ранее характеризуемых семейств белков , таких как идентификация новых белков 4TM ^4. Изучение последовательностей генов аквапорин семьи имеет алтак дали идентификацию новых членов с новыми функциями ^5. После идентификации, анализа функции белка, как правило, следующий шаг, который иногда может быть исследована с помощью специального анализа функции белка, таких как в случае аквапорин.

Когда это возможно, функция вновь идентифицированного белка могут быть изучены с специфической ферментативной или аналогичных функциональных анализов в лабораторных условиях . Поскольку многие функции новых белков зависят от сложных взаимодействий , которые происходят только в интактных клетках или организмов, в анализах пробирке не всегда эффективны. Тем не менее, in vivo на анализы должны быть сконструированы таким образом , что они зависят от последовательности гена. В культуре клеток и / или простых модельных организмов, нокдаун может предоставить подтверждающие доказательства для идентификации белка / функции ^6. С помощью новых белков, идентифицированных как было отмечено выше, часто бывает недостаточно, чтобы просто сбить белок, чтобы подтвердить функцию, А.Н.d дизайн функциональных анализов in vivo на которые зависят от последовательности гена становится важным для характеристики новых белков.

Недавнее определение TMEM184A как рецептор гепарин (который модулирует пролиферацию в гладких мышцах сосудов и воспалительных реакций в эндотелиальных клетках) с использованием аффинной хроматографии и MALDI MS ^{1, 7} предоставляется возможность разработать набор анализов после нокдауна дали результаты , согласующиеся с идентификацией , Недавний обзор подтвердил , что гепарин специфически взаимодействует со многими факторами роста, их рецепторов, компонентов внеклеточного матрикса, рецепторы клеточной адгезии, а также другие белки ^8. В сосудистой системе, гепарин и гепарансульфат протеогликанов (содержащий гепарансульфат цепи сходен по структуре с гепарином) взаимодействуют с несколькими сотнями белков ^9. Для того, чтобы подтвердить, функционально ТНАт TMEM184A был связан с поглощением гепарин и переплета, были разработаны методы, которые использованы генную конструкцию для TMEM184A. Настоящий доклад включает в себя набор анализов на основе GFP-TMEM184A построить для использования в подтверждении идентичности TMEM184A как рецептор гепарином.

Протокол

1. Дизайн GFP-белка Construct

1. Покупка, или дизайн и сборка, конструкция GFP-меченый на основе рассматриваемого белка.
   Примечание: Для получения купленного конструкции, стандартные векторы доступны из коммерческих лабораторий, которые включают все или некоторые из следующих предложений: Для получения мембранного белка, выберите С-концевую расположение GFP, потому что это менее вероятно, мешать мембранном белка. Рассмотрим расширение между интересующим геном и GFP, если есть основания полагать, что С-конец рассматриваемого белка компактно сложить в области белка. Выберите конструкцию для общего выражения эукариотических клеток, но позволяют построить производство в бактериальных системах. Включить сайт расщепления (например, для протеазы TEV), с помощью которого GFP может быть удален, если требуется для некоторых экспериментов, где GFP может помешать активности белка. Добавить другие вставки, такие как дополнительный тег для локализации или аффинность ввзаимодействиями (например, His6). Это не было необходимо для анализов, описанных здесь, но может облегчить другие анализы, или быть полезным непосредственно рядом с геном, перед GFP, если удаление GFP желательно.

2. GFP-TMEM184A экспрессии в клетках сосудов

1. Культура эндотелиальной или клеток гладких мышц сосудов на 0,2% покрытые желатином чашки для культивирования тканей , как сообщалось ранее ^{1, 6, 7.}
2. Добавить 5 мл раствора для культивирования клеток трипсина (0,5% вес / об) к промытой 100 мм или больше, сливающийся блюдо из клеток. Инкубируют при 37 ° С до тех пор, пока клетки не только освобождены от пластины, и передачи клеток в стерильную полипропиленовую центрифужную пробирку.
3. Добавление ингибитора трипсина (например, равного объема регулярных культуральной среды), как он используется в повседневной культуре, к решению клеток / трипсина , чтобы ограничить активность трипсина. Гранул клетки в течение 5 мин при approximленно 600 XG (или соответствующая скорость и время, чтобы просто осадить клетки для стандартной тканевой культуры). Аспирируйте супернатант.
4. Ресуспендируют клеток в 1 мл HeBS (Hepes-буферном физиологическом растворе) буфера для электропорации, ограничивая количество времени клеток в осадке или суспензии. Поместите клеточной суспензии на льду и выполнять оставшиеся шаги на льду.
   Примечание: на пеллетах можно мыть один раз с HeBS до взмучивания.
5. Добавьте достаточный объем GFP-меченый TMEM184A плазмиды в клетки, чтобы достичь конечной концентрации 20 мкг / мл ДНК. Используйте идентичный протокол для GFP конструкции.
6. Поместите примерно 0,4 мл раствора клеток в HeBS в кювету для электропорации. Предварительно охладить кюветах перед использованием.
7. Электропорации клетки с использованием следующих условий: экспоненциальному затуханию, 500 мкФ, ∞ Ом, и 170 В.
   Примечание: Напряжение для данного типа клеток должны быть оптимизированы. Предварительные исследования с эндотелиальной и CEL гладких мышцл типа были выполнены с помощью GFP-винкулин конструкции для определения оптимального значения напряжения отметить, например , ^10.
   1. Для оптимизации электропорации, начните с рекомендациями изготовителя оборудования (которые включают в себя условия для некоторых стандартных типов клетки). Используйте желаемую конструкцию или управления флуоресцентного белка построить аналогичные по размеру и флуоресцентных характеристик до желаемой конструкции.
      Примечание: Малые нуклеиновые кислоты появляются проникать в клетки легче, чем более крупные конструктов, поэтому конструкция с только флуоресцентного белка может быть легче выразить, чем больший.
   2. С помощью флуоресцентной микроскопии для определения жизнеспособности клеток, процент клеток, в которых флуоресцентный конструкция выражается через 24 и 48 ч, а интенсивность экспрессии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Уменьшите напряжение и / или время немного, если выживание низка. Стремитесь самое короткое время между выходом из клеток с поверхности культуры и возвращенияклетки в культуре для повышения выживаемости. Незначительное увеличение времени или второго импульса может улучшить поглощение конструкт, если выживание является высоким, и выражение является низким. Оптимальные условия и выражение будет варьироваться между типами клеток. Если процент клеток, экспрессирующих конструкцию высока, но интенсивность мала, повышение концентрации ДНК и мониторинга трансфектированных клеток в течение долгого времени для обеспечения оптимальной интенсивности, которая будет варьироваться в зависимости от белка полураспада, а также выражение, может повысить интенсивность. Окрашивание интенсивность может быть увеличено для некоторых анализов, в случае необходимости, с помощью иммунофлуоресценции окрашивание GFP с анти-GFP антител
8. После электропорации, семена клеток в шесть 30 мм для тканевых культур скважин с покровные для визуализации или в ткани блюда культуры. Культуры клеток с использованием стандартных процедур клеточной культуры.
9. Дополнительно: Заменить питательную среду после 24 часов, чтобы удалить электропорации буфера СЭП.

3. Визуализация GFP-TMEM184A Локализация

1. Промыть клетки с PBS и осторожном встряхивании после культивирования в течение не менее 24 ч. Ограничение воздействия яркого света, чтобы избежать выцветания GFP.
2. Закрепить клетки с 4% параформальдегида (PFA) в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре при осторожном встряхивании. Избегайте использования каких-либо метанолсодержащий реагенты, которые могут клетки проницаемыми. Фиксирование с метанолом можно использовать, если нет необходимости, чтобы оценить лиганд.
   Внимание: параформальдегид является токсичным. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты. Использование в вытяжном шкафу, с осторожностью, и отказаться от должным образом.
3. Полоскание с PBS, как описано выше. Для окрашивания антител на основе см 3.6 ниже.
4. Маунт-покровные к слайдам с помощью Mowiol или другого подходящего монтажного среды.
5. слайды изображений с помощью конфокальной или флуоресцентного микроскопа с соответствующими наборами фильтров для GFP возбуждения и спектров излучения. Конфокальной микроскопии является предпочтительным из-за способности отдельные пробы в плоскости г. Сохранение изображений в шкале серого для QuЦели antitation в формате TIF (в дополнение к полноцветных изображений для иллюстраций).
6. Для сравнения с WT TMEM184A выраженным клетками, подготовить другие клетки для иммунофлуоресценции с использованием первичных антител , подготовленных к пептиду (ы) из последовательности TMEM184A, например ^1. Идентификация GFP-TEMEM184A также может быть осуществлено с использованием антител против GFP. Оценить оба образца клеток от идентичных методов микроскопии.

4. родамина-гепаринсвязывающий и колокализацию с GFP-TMEM184A-трансфецированных клеток

1. Treat GFP-TMEM184A-экспрессирующих клеток с 100 мкг / мл родамина-гепарина добавляют к культуральной среде, и позволяют клеткам инкубировать в течение определенного промежутка времени, как правило, менее чем на 10 мин для клеток A7r5. Промыть и зафиксировать, как в 3.1 и 3.2.
   Примечание: Оптимальное время и концентрация лиганда зависит от клеточного ответа, интенсивности флуоресценции от интенсивности лиганда и изображения, полученного. Это Концентратион гепарина был применен , поскольку он приводит к более чем 50% ответа в других анализах ^11. Эта концентрация может быть визуализированы с использованием стандартных методов флуоресцентной микроскопии, поэтому не надо было увеличить его. Разбавление родамина-гепарина с немеченых результатами гепарин в нижней флуоресценции в клетках, таким образом, более трудно изображения и количественно.
2. Для количественной оценки родамина-гепаринсвязывающий в связи с GFP-TMEM184A трансфекции, готовят идентичные клетки без трансфицированных GFP-TMEM184A.
3. Изображение клетки с помощью конфокальной микроскопии с соответствующим GFP (488 нм) и родамина (543 нм) возбуждения и излучения - значений (500 530 нм для GFP и больше, чем 560 нм для родамина) для определения совместной локализации. Получение изображений по меньшей мере, 50 клеток, по меньшей мере трех отдельных экспериментов для получения статистических данных. Поддерживать идентичные настройки в экспериментах, и используют образец (ы) управления (например, трансфицированные клетки без обработки) -мна могут быть использованы для стандартизации данных для анализа нескольких экспериментов.
4. Изучите изображения, используя компьютерную программу для определения связывания / поглощения в каждой ячейке для количественного связывания относительной родамин.
   Примечание: TIF изображения должны быть использованы, поскольку они удобны для анализа и могут быть преобразованы в оттенки серого во многих компьютерных программ, если они не были первоначально сохранены в этом формате. Изображение J (бесплатный) был использован в данном анализе, и позволяет площадь и интенсивность пикселя, чтобы измерить для любого заданного пользователем области в изображении.
   1. Используйте инструмент произвольной формы, чтобы окружить ячейку внутри флуоресцентного изображения и использовать инструмент измерения для определения интенсивности в пределах этого пространства.
      Примечание: Эти измерения обеспечивают необходимую информацию для расчета общей интенсивности для определенной пользователем зоны (целой клетки, ядра и т.д.) , что обеспечивает возможность сравнивать различные клетки с различной геометрией. Средняя интенсивность на площади фона могут быть представлены, и что облегчитs коллекция интенсивности фона для анализа.
   2. Экспорт в электронную таблицу для вычисления площади зависит от интенсивности и вычитать фон для той же величину площади. Нормальное флуоресцентное / ячейку для достаточное количество клеток / эксперимента для получения статистической значимости.

5. флуоресцентного резонанса Передача энергии от GFP-TMEM184A к родамина-гепарином

1. Подготовка трансфектированных клеток и инкубировать с 200 мкг / мл родамина-меченый лиганд, в разделе 3.1. Обратите внимание, что время инкубации с флуоресцентным лиганда типа клеток зависит. Устранить только с PFA, и смонтировать слайды для работы с изображениями.
2. Во-первых, возбуждают при 405 нм и изображения для излучения родамина (566 - 685 нм; FRET). Во-вторых, возбуждают на 488 для GFP (изображения на 493 - 530), и в-третьих, возбуждают 561 для родамина (изображения при 566 - 685). Элементы управления без GFP-TMEM184A или без родамина-гепарина имеют решающее значение.

6. Live-ячейки изображения родамина-Hepariп Усвоение

1. Семя GFP-TMEM184A трансфицированных клеток в отдельные блюда, предназначенные для живых клеток и лечения, как в протоколе 3.
   Примечание: Число ячеек, требуемых в зависимости от типа клеток и плотности желаемой. Для того, чтобы свести к минимуму количество времени, клетки в суспензии, не учитываются клетки. Семенной клетки из сливающийся блюдо 100 мм на шесть 35-мм чашках живого изображения для получения клеток вблизи впадения в 48 ч.
2. Через 48 ч, замените носитель с культуральной средой без фенолового красного.
3. Передача блюдо из клеток в конфокальной микроскопии с этапа потепления для поддержания температуры, и фокус микроскопа.
4. Пипеткой 100 мкг / мл родамина-гепарин в блюдо и аккуратно перемешать.
5. Немедленно начать запись изображения в реальном времени. Если не поглощение клеток гепарина не происходит в пределах области в поле зрения, слегка переместить антенну, чтобы идентифицировать клетки с по меньшей мере, один зеленый пузырек, содержащий метку родамина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация возбуждения и излучения особенности являютсятакой же, как для протокола поглощения гепарин (раздел 5). Период времени между изображениями составлял приблизительно 16 лет. Условия эксперимента и микроскопа, как правило, определяют скорость, с которой могут быть получены изображения.

7. Выделение GFP-TMEM184A и GFP из культивируемых клеток

1. После удаления культуральной среды и промыванием PBS, добавляют 2 мл 0,2% (вес / объем) раствор CHAPS 1X PBS с ингибиторами протеазы до 150 мм пластины клеток, экспрессирующих GFP-TMEM184A или GFP (для управления анализах связывания). Скрип клетки из чашки, положите раствор клетки / CHAPS в 15 мл полипропиленовую пробирку на льду, и хорошо перемешать, нажав. Выполните все шаги в ярком свете, чтобы гарантировать, что GFP метка отбеливают для анализа связывания ниже.
2. Для того, чтобы специфически связывать GFP-TMEM184A (или соответствующего управления GFP), добавьте 2 мкг / мл биотинилированного анти-GFP антитела к раствору и инкубируют в течение ночи при 4 ° C с качалки.
3. Добавить 500 мклстрептавидина-агарозы бисером по крайней мере, 5 мл 0,2% CHAPS / PBS и центрифуге при приблизительно 600 мкг в течение от 3 до 5 мин. Удалить супернатант. Повторите еще два раза со свежим CHAPS / PBS, каждый раз. Добавить бусин в раствор антител и клеток и инкубируют в течение ночи при 4 ° C с качалки, чтобы шарики связываться с биотинилированным анти-GFP антитела, связанного с GFP или GFP-TMEM184A.
4. Гранул бисер при центрифугировании (как в 7.3) и удаления несвязанного материала. Добавить ингибиторы по меньшей мере, 5 мл 0,2% CHAPS / PBS / протеазы помыть. Повторить промывку и центрифугирования, по меньшей мере в 3 раза для эффективного удаления несвязанного белка.
5. После удаления последней промывки, инкубировать бусинки с 1 мл 0,2 М глицин / 0,2% CHAPS в PBS (рН до 2,0 с помощью HCl) на льду в течение 3 мин, чтобы диссоциировать антитело-GFP, связывание (что приводит к свободной GFP-TMEM184A или бесплатно GFP). Осторожно перемешать, нажав каждые 30 сек.
6. Центрифуга при приблизительно 600 XG и передавать супернатант, содержащий очищенный рrotein на новую 15 мл трубки с последующей немедленной нейтрализацией с 5 мл 1 М бикарбоната натрия (довести рН до 7).
7. Концентрат образца, используя 10000 Дальтон молекулярную массу СВЕТОТЕНЕВОЙ центробежный концентратор (используют скорость центрифугирования, рекомендованный поставщиком). Когда объем достигает приблизительно 0,5 мл, добавляют 0,2% CHAPS / PBS. Продолжить концентрации и добавляя больше 0,2% CHAPS / PBS до тех пор, по крайней мере, десять томов (раз объем образца начальная) от 0,2% CHAPS / PBS не добавлены.
8. Для того, чтобы определить оценку количества изолированной GFP или GFP-меченый белок, получить поглощение при 280 нм и сравнивают его со стандартной кривой, полученной из бычьего сывороточного альбумина или другого белка управления в том же самом буфере.
   Примечание: Из-за разницы коэффициентов экстинкции, эта концентрация является оценкой, но может обеспечить приблизительную концентрацию белка для облегчения дальнейшего анализа без потерь пробы. Точная концентрация белка может быть сдерживатьдобывали с помощью белкового анализа микро-Lowry они удостоверяться подготовки стандартного белка в том же буфере, что и образец. Дальнейший анализ изолированного белка может быть достигнуто с помощью вестерн-блоттинга изолированного белка (с использованием функции обнаружения антител к GFP), и сравнение с предсказанной молекулярной массой. В качестве альтернативы, использование TMEM184A антител должно приводить к полосе предсказанного размера конструкта, но также может привести к группе WT TMEM184A если димеров (или олигомеров высшего порядка) присутствуют в образце. Оценка чистоты может быть получена путем окрашивания пятном на общий белок из выделенного образца против общего белка из аликвоты исходного материала.

8. In Vitro гепарин Анализ связывания

1. Приготовьте черный покрытые авидином 96-луночного планшета путем промывки 200 мкл 0,2% CHAPS / PBS три раза в течение 5 мин при встряхивании. Готовят идентичную черный неокрашенной 96-луночного планшета с использованием той же процедуры промывки. Подготовитьмакет для экспериментальных образцов (в трех экземплярах), чтобы следовать в процессе анализа. Включить лунки для стандартных концентраций гепарин, управления буфером и лунки с образцами без GFP гепарин для подтверждения отбеливания GFP.
   Примечание: Если оптимизированная изоляция или взаимодействие лиганда буферы различны для рассматриваемого белка, сделать все препараты плиты и мойки с оптимальной буферной системой.
2. Добавьте 100 мкл 60 пмоль / лунку биотинилированного анти-GFP во все лунки в пластине покрытые авидином, где GFP связывание желательно. Количество антитела, достаточно просто насытить имеют высокое сродство авидин в лунках.
   1. Добавить буфер только для всех скважин, используемых для целей контроля (без GFP или GFP-TMEM184A связывание желательно). Уплотнение скважин с накрыватель для предотвращения испарения. Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре при встряхивании.
      Примечание: Объемы добавлены к лункам и времени инкубации основаны на рекомендациях поставщика.
3. Вымойте все лунки три разав течение 5 мин с 200 мкл 0,2% CHAPS / PBS.
4. Добавьте 100 мкл 5 нмоль / лунку GFP-TMEM184A или GFP в соответствующие лунки в пластине покрытые авидином и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре при встряхивании. Вымойте снова, как в 8.3.
   Примечание: Эта была выбрана концентрация белка, чтобы гарантировать, что все сайты насыщали с избытком GFP или GFP-TMEM184A. Это важно, чтобы гарантировать, что то же самое количество белка обязан каждую лунку. Более низкие количества белка также могут насытить сайты, возможность того, что можно было бы рассмотреть путем оценки несвязанного белка, остающегося после инкубации нескольких концентраций белка с пластиной и сравнения несвязанного белка и лиганда анализов связывания.
5. Приготовьте различные концентрации меченого флуоресцеином гепарина, например, 10, 25, 50, 75, 100, 200 мкг / мл, в 0,2% CHAPS / PBS. Сделайте это, и все остальные работы в темноте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При подготовке концентраций, специфические концентрации для других лигандов должны быть определены для Proteiп цель в вопросе. Самая низкая концентрация должна быть обнаруживаемыми в планшет-ридере. Поэтому важно, чтобы сначала определить диапазон, который может быть обнаружен точно в буферной системе, используемой. Затем определяют диапазон, необходимый для получения измеримой связывания. Концентрации флуоресцеином гепарина ниже 10 мкг / мл не последовательно регистрироваться в планшетном ридере при условиях буферных используемых. Аналогичным образом, в то время как родамин-гепарин, такие как используемые в других анализах, могут быть визуализированы в ридере, в буферных условиях и при концентрациях, необходимых для связывания, показания флуоресценции для стандартов не были воспроизводимо с этим иначе флуорофора.
6. Добавьте 100 мкл флуоресцеин-гепарина в соответствующих испытательных скважин в покрытые авидином плит и стандартных концентрация скважин в обоих авидин покрытием и неустановленным покрытием пластины. Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре при встряхивании. Держите пластин в темноте (или фольга покрыта).
7. Использование пластины Reaдер, записывать первоначальную флуоресцентное излучение от гепарина в контрольных лунках обеих пластин и начальной флуоресценции (общей) эмиссии из скважин с иммобилизованным GFP-TMEM184A или GFP в пластине авидин покрытием. При необходимости регулировки усиления прибора, чтобы обеспечить обнаружение флуоресцентного гепарина между самыми низкими и самыми высокими концентрациями.
   Примечание: Убедитесь, что ридер считывает скважины сверху и считывает в оптимальном месте в скважинах, если это регулируется. Для исследования в вопросе, оптимальное расположение было около 75% вниз скважин. Информация, доступная с ридере должны представить предложения, которые являются уникальными для читателя пластины в вопросе для чтения анализы связанного образца в черных пластин.
8. Удалить несвязанного флуоресцентного гепарин из скважин с иммобилизованным GFP-TMEM184A или GFP и поместить в соответствующие лунки в непокрытой черной пластины. Сразу читать флуоресцентное излучение.
9. Добавьте 100 мкл свежей 0,2% CHAPS / PBS назад INTO скважины, из которых флуоресцеин-гепарин был удален, и читать флуоресцентное излучение.
10. Повторите шаги 8.8 - 8.9 3x.
    Примечание: Эти показания от пластины с покрытием указывают на флуоресцеина гепарин, оставшихся в GFP или GFP-TMEM184A скважин. Если значительная флуоресценция обнаруживается в третьем несвязанных образцов, дополнительная промывка должна произойти. Если флуоресценция продолжает быть удалены в каждой промывке, связывание лиганда может быть низкой аффинностью, а условия должны быть пересмотрены. Окончательное чтение представляет собой связанное чтение гепарин.
11. Запись флуоресцентное излучение от удаленных, несвязанных, образцы в неокрашенной пластине, получение номера для каждой стирки. Они являются "несвязанные" чтения.
12. Используйте суммарные значения выбросов, полученные гепарин в 8.7, чтобы подтвердить правильные уровни гепарина добавляли в каждую лунку. Вычтите средние значения фона из значений.
    Примечание: Уэллс без флуоресцеина-гепарином служить в качестве фона из-за антител, GFP и буфера. Averagе фон повторяется, чтобы получить фоновое значение. Вычитание средние показания фона от связанных и несвязанных чтений, чтобы получить фактические значения.
13. Наймите график эмиссии по сравнению с общей флуоресцеин-гепарин добавил, чтобы определить масштаб эмиссии против количества гепарина.
    Примечание: Антитело в одиночку, или антитела и антигена привело к некоторому тушению флуоресценции. Таким образом, общая гепарин была определена на основе общей добавленной гепарина, как отмечено в 8.7.
14. Участок исправленный связанный гепарин против добавленного гепарина для трехкратном повторе как в случае GFP-TMEM184A и случае GFP.
15. Определение свободного лиганда путем добавления несвязанных показания всех промывок для определенной концентрации.

Результаты

В то время как в теории, трансфекция любой конструкции ДНК в клетки могли быть выполнены с помощью липофильных реагентов трансфекции, предыдущие сообщения указывают на более эффективное трансфекция GFP конструкций в эндотелиальных клеток с использованием электропорации ^12. Протокол при условии, здесь, как правило, достигается GFP-построить выражение в более чем 80% первичных полученных эндотелиальных клеток и клеток гладких мышц, используемых. Дизайн конструкции и...

Обсуждение

Протоколы , описанные здесь , были разработаны , чтобы предоставить подтверждающие доказательства для идентификации TMEM184A как гепарин рецепторов в клетках сосудов ^1. Нокдаун методы, которые обычно используются в качестве механизма для подтверждения идентификации новых белков. Тем не менее, некоторые функциональная потеря после нокдауна, как правило, не является достаточным доказательством того, что белок-кандидат на самом деле правильный рецептор (или другой функциональный белок). Важно также,...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
GFP-TMEM184A construct	OriGene	RG213192
Rhodamine-Heparin	Creative PEGorks	HP-204	Светочувствительный
флуоресцеин-гепарин	Creative PEGorks	HP-201	Светочувствительный
Mowiol	EMD Millipore	475904-100GM
Параформальдегид (PFA, без метанола)	Thermo Sci Pierce Biotech, доступно через Fisher Scientific	PI28908 в Fisher	Использование в вытяжном шкафу
Reacti-bind нейтравидиновые пластины (черные 96-луночные тарелки с покрытием Avidin)	Thermo Sci Pierce Biotech, через Fisher Scientific	PI15510 в Fisher	Обратите внимание на срок годности
черные 96-луночные пластины	Corning Life Sciences Plastic, приобретенные через Fisher Scientific	064432 в Fisher
A7r5 сосудистые гладкомышечные клетки линия	ATCC	CRL 1444	Может быть заменена на MEM средние1
BAOEC эндотелиальные клетки аорты крупного рогатого скота	Cell Applications, Inc.	B304-05	Культура, как рекомендовано изначально, может быть заменена на среду MEM для продолжения культивирования1,7
BAOSMC гладкомышечные клетки аорты крупного рогатого скота	Cell Applications, Inc.	B354-05	Культура, как рекомендовано изначально, может быть заменена на среду MEM для продолжения культивирования1
RAOEC эндотелиальных клеток аорты	крысы Cell Applications, Inc.	R304-05a	Культура, как рекомендовано изначально, может быть заменена на среду MEM для продолжения культивирования7
биотинилированный анти-GFP	Thermo Sci Pierce Biotech, через Fisher Scientific	MA5-15256-BTIN
покрытые стрептавидином шарики	Sigma	S1638
HeBS	Доступно от Bio-Rad		Может быть приготовлен в лаборатории. pH составляет 6,8
TMEM184A антитела к N-концу	Santa Cruz Biotechnology	sc292006	Известно только TMEM184A антитело к N-концевой области.
TMEM184A антитела к С-концу	получены от ProSci Inc, Poway, CA	Pro Sci 5681	ProSci используется в Рисунок 1
GFP антитела	Santa Cruz Biotechnology	sc9996	Используется в Рисунок 5
Вторичные антитела, меченные TRITC или Cy3	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA	711 025 152 (ослица против кролика, TRITC) 715 165 150 (ослик против мыши, Cy3)	Минимальная перекрестная реактивность для минимизации любого неспецифического окрашивания.
CHAPS	Куплено у Sigma	C5849	Обратите внимание, что этот конкретный каталожный номер был снят с производства. Поставщик предоставит информацию о замене.
35-мм антенны для съемки в реальном времени	MatTek (Ashland MA)	P35G-1.0 – 20 мм - C
Конфокальный микроскоп	Zeiss	LSM 510 Meta с 63-кратным масляным иммерсионным объективом	Используется для изображений и визуализации в реальном времени в <сильных>Рисунки 1, 2 и 3
Конфокальный микроскоп	Nikon	C2+ с 60-кратным масляным иммерсионным объективом	Используется для изображений в <сильных>Рисунок 5
Конфокальный микроскоп	Zeiss Zeiss	LSM 880 с 63-кратным масляным иммерсионным объективом	Используется для получения изображений в <сильный>Рисунок 2C
Оборудование для электропорации	Bio-Rad	Gene Pulser X-Cell System
Электропорационные кюветы	Доступны в MidSci	EC2L	Также можно приобрести у поставщика оборудования
Считыватель пластин	TECAN TECAN	Infinite® m200 Pro Считыватель пластин	Показания в середине скважин, а не на поверхности.
Компьютерная программа для измерения интенсивности окрашивания	Image J	https://imagej.nih.gov/ij/ Программа и информация доступны в режиме онлайн	Можно использовать любую подходящую программу. Смотрите https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html для получения дополнительной информации
Раствор трипсина для клеточной культуры	Sigma	T4174	приобретен в виде 10-кратного раствора