Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Cryosectioning соприкасающихся регионов скелетной мышцы одной мыши для экспрессии генов и гистологических анализов

15.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55058

⸱

12 декабря 2016 г.

1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, University of Georgia

В этой статье

Краткое содержание

Последовательные криопроводники секции собираются для того, чтобы гистологические приложений и обогащение РНК для измерения экспрессии генов с использованием соседних областей от одной мыши скелетных мышц. Высококачественная РНК получают из 20 - 30 мг объединенных криосрезах и измерений непосредственно сопоставлены между приложениями.

Аннотация

С помощью этого метода последовательных криосрезы собираются для того, чтобы обе микроскопии приложений для гистологического исследования тканей и обогащения РНК для экспрессии генов с использованием соседних регионов от одной мыши скелетных мышц. Как правило, это является сложной задачей для достижения адекватного гомогенизации небольших образцов скелетных мышц, поскольку объемы буфера может быть слишком низкой для эффективного применения шлифования, но без достаточного механического разрушения, архитектура плотной ткани ограничивает мышцы проникновения буферных реагентов, в конечном счете вызывает низкий выход РНК. Следуя протоколу, которые сообщаются здесь, 30 мкм срезы собирают и объединяют позволяя cryosectioning и последующее игла гомогенизация, чтобы механически разрушить мышцы, увеличивая площадь поверхности, обнаженную для проникновения буфера. Основные недостатки метода является то, что она требует криостат, и она является относительно низкой пропускной способностью. Тем не менее, высокого качества РНК могут быть получены из небольших образцов объединенном мuscle криосрезы, что делает этот метод доступным для многих различных скелетных мышц и других тканей. Кроме того, этот метод позволяет совпадающая анализы (например, гистопатологии ткани и экспрессии генов) из смежных областей одной скелетной мышцы так , чтобы измерения можно непосредственно сравнивать между приложениями для уменьшения экспериментальной погрешности и для снижения репликативные экспериментов на животных необходимо источник небольшую ткань для несколько приложений.

Введение

Целью данной методики является сделать несколько экспериментальных анализов с помощью различных методов, таких как выражение гистологии и генов, доступных из одного небольшого скелета источника мышечной ткани. Микроскопия приложения являются наиболее чувствительными к образцу методов сохранения, которые необходимо тщательно контролировать, чтобы ограничить образование кристаллов льда артефактов во время криоконсервации. Таким образом, развитие метод основан на передней большеберцовой (TA) мышца замороженные частично покрыта встраивание смолы в охлаждаемой жидким азотом 2-метилбутан ванны -140 ° С в качестве исходного материала для обоих иммунофлюоресценции микроскопии и анализа экспрессии генов.

Необходимость использовать один и тот же исходный материал для различных технических подходов особенно важно для внутримышечных инъекций экспериментов на основе которых левые и правые мышцы представляют различные условия, одно экспериментальное и один элемент управления. Например, в исследованиях регенерации мышц, один мюSCLE вводят токсин , чтобы вызвать повреждение тканей широко распространенное в то время как контралатеральной мышца служит в качестве транспортного средства с впрыском контроля 1. Точно так же исследования генной терапии для мышечных нарушений , как правило , начинают с проверки вектора генной терапии путем внутримышечной инъекции в сравнении с пустым вектором, не связанного вектора или управления транспортным средством на контралатеральной стороне 2. Таким образом, не представляется возможным источником каждой ТП мышцы на другое приложение.

Общие стратегии борьбы с этой проблемой являются: я), чтобы использовать другую группу мышц для каждого приложения, б) использовать дополнительные мышей, или III), чтобы отрезать кусок мышцы для каждого приложения. Тем не менее, существенные различия между группами мышц затрудняют сравнение данных из отдельных приложений, а также дополнительные животные увеличивают расход и плохо обоснованным, если существуют другие альтернативы. Разделив мышцы после рассечения на источник различных приложений является наилучшим вариантом яп много случаев. Тем не менее, мышечные части часто слишком малы , чтобы использовать размельчение под жидким азотом или механическим методам заточной для гомогенизации 2-5. Как мышца является высокоэффективным структурным ткани упакованы с внеклеточным матриксом и сократительных белков, неадекватной механической гомогенизации приводит к низкому выходу последующей ДНК, РНК или белка. Подробно здесь метод позволяет небольшое количество ткани от одного источника мышцы для использования в различных приложениях, а также включение cryosectioning и иглы растирание улучшает механическую гомогенизацию для лучшего выхода РНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры на животных были одобрены Университета Джорджии Institutional уходу и использованию животных комитета при использовании животных протокола A2013 07-016 (Бидл).

1. Криоконсервация нефиксированной скелетных мышц

  1. подготовка
    1. Вырежьте пробки на небольшие квадраты (примерно 1 см х 1 см) с лезвием бритвы, писать на пробке с тонким наконечником маркера, который устойчив к 2-метилбутана для идентификации источника мыши и мышцы, и сделать очень неглубокий порез (примерно 1 мм) по всей верхней поверхности. Вставьте пластиковую покровное в разрез, чтобы использовать для ориентации ткани. Повторяйте, пока пробка не будет готова к каждой ткани, чтобы быть криоконсервации.
    2. Получение жидкого азота, 2-метилбутан, встраивая смолу, низкотемпературный термометр, Пробки, рассечение инструментов, и изучение мыши.
      ВНИМАНИЕ: Жидкий азот представляет собой сжатый газ , который при нагревании может взорваться. Носите лабораторный халат, низкотемпературные перчатки и средства защиты лица при обращении с жидкостью пTrogen; контакта с кожей или глазами может вызвать ожоги или обморожения. 2-метилбутан является легковоспламеняющийся, токсичный, здоровье и опасность для окружающей среды. Использовать средства индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки, защитные очки), откройте фондовый контейнер в вытяжном шкафу, передавать небольшое количество, необходимое для замораживания (как правило, от 200 до 400 мл) в отдельный контейнер, который может быть плотно закрыты, и избегать вдыхания ,
    3. Эвтаназии мышей с утвержденным методом эвтаназии под анестезией. Если коротко, то вставить мышь в ингаляционную камеру с 2,5% изофлуран в кислороде из изофлурановым испарителем, подождите, пока 20 секунд после того, как мыши не перестанет двигаться, чтобы проверить наличие рефлекса педали. Когда рефлекс педали отрицательный, эвтаназии исследовании мыши по цервикальной дислокации 6.
      Примечание: Эвтаназия методы требуют одобрения комитетом по институциональной этике.
    4. Удалить кожу, перекрывающую дистального задней конечности и сократить дистальных передних сухожилия чуть выше лодыжки с тонкой точкой Диссефикция ножницы. Возьмитесь дистальные сухожилия с тонким пинцетом и осторожно потяните вверх и в сторону коленного сустава при одновременном сокращении боковой фасции, чтобы освободить мышцы. Потяните мышцы из перпендикулярно от колена и сделать окончательный разрез акцизными ТА мышцы 7.
      Примечание: Мышца ТА используется здесь в качестве примера, но любая мышь скелетных мышц или сердце может быть заменен на ТП в данном протоколе, если это соответствует экспериментальным целям пользователя. Единственным ограничением является то, что ткань должна быть достаточно мала, чтобы добиться быстрого криоконсервации всей его глубине; Рекомендуется максимальный размер ткани размером 1 см х 1 см.
    5. Повторите на противоположной ноге, и рассекать любые другие ткани, которые будут собраны. Выполнение рассечение как можно быстрее, чтобы ограничить деградацию тканей перед тем криоконсервации.
    6. Orient каждая мышца для поперечных сечений по ее предварительно меченных пробки. Stand мышцы перпендикулярно к пробке с дистальным сухожилием касаясь пробку и верхнюю часть мышц добзаканчивая далеко, в вертикальном положении на покровное.
    7. Криоконсервируют все ткани для гистологического анализа как можно быстрее после вскрытия, предпочтительно в течение 5 мин, но определенно не более чем на 15 мин время, прошедшее с euthanization исходного животного.
  2. Криоконсервация
    1. Начало охлаждения криоконсервации ванну пять минут до конца рассечение. Залить 2-метилбутан в сообщение стакане открытой металлической на глубину около 3 см. Налейте жидкого азота в изолированный контейнер на глубину от 2 до 4 см. Установите мензурку 2-метилбутана в жидкий азот; азот закипит. Избегайте разбрызгивания азота в стакан 2-метилбутан.
      ВНИМАНИЕ: Подготовить замораживании ванну в вытяжном шкафу или хорошо проветриваемом помещении.
    2. Вставьте низкотемпературный термометр в 2-метилбутана для контроля температуры и часто размешать с вилкой, чтобы обеспечить равномерное охлаждение. Продолжайте перемешать и охладить до 2-яthylbutane достигает -140 ° C, при добавлении нового жидкого азота к внешней ванны по мере необходимости.
      Примечание: -140 ° C является оптимальной температурой для минимизации кристаллов льда артефактов в полосатых мышц; другие ткани могут криоконсервируют лучше всего при различных температурах (например, мозга, -90 ° С).
    3. Применить вложение смолы только к нижнему 35 - 50% мышцы, где она встречает пробку и сразу же падение пробку в 2-метилбутана при -140 ° C. Быстро повторяют до 8 тканей на замораживание партии. Перемешивают в течение 30 сек, очищая дно стакана, чтобы гарантировать, что ткани не замерзают в затвердевающий 2-метилбутана.
    4. Используйте вилку, шумовкой или больших щипцов, чтобы вытащить каждую пробку ткани из 2-метилбутана. Быстро удалить покровное, промокните избыток 2-метилбутан в стакан, а затем опустить пробковой ткани в ванну наружного азота. Повторите эти действия для всех остальных пробками в стакане.
    5. Образцы переноса в жидком азоте или на сухом льду до-80 ° C морозильник для хранения.
    6. Если какие-либо ткани остаются для криоконсервации, повторите шаги 1.2.3 1.2.4. Добавить еще 2-метилбутан в стакан или жидким азотом до внешней ванны по мере необходимости и повторное охлаждаться до -140 ° С. Утилизировать используется 2-метилбутана как опасные отходы.

2. Собрать криосрезах для гистологического и РНК-приложений

  1. Приготовление.
    1. Предварительно взвешивают ДНКазы / РНКазы автоклавного трубки на аналитических весах. Затем переместите его в криостат камеру для предварительного охлаждения. Повторяйте, пока трубы не будут готовы для всех пробах и cryosection должны быть собраны.
    2. Для скелетных мышц секционирования, подтверждают, что температура криостат камера -21 до -22 ° С его внутренним термостатом. Передача любых контейнеров с тканями, чтобы разрезать на камеру и дайте контейнер (ы) для уравновешивания до температуры криостата в течение по крайней мере за 15 минут до открытия.
    3. Вставьте новый одноразовый криостата лезвие, С другой стороны , удалить существующий лезвие, спрей с обеззараживающим раствором РНКазы, промыть DDH 2 O и вставьте в криостат для охлаждения. Спрей чистой ткани с 70% этанолом и осторожно протрите лезвия и лезвия прижимную платформу.
      1. Спрей чистую ткань с обеззараживающим раствором РНКазы и протирают криостата щетки. Спрей ткани с DDH 2 O, снова протрите щетки и установить их в криостат камере на чистую поверхность.
        ВНИМАНИЕ: Криостат Лезвие должно быть покрыта ограждением ножа , когда он не используется. Кроме того, раствор обеззараживание РНКазы токсичен и замерзнет с образованием осадка в холодной камере криостата. Поэтому обращаться с осторожностью и избегать его применения в криостат камере.
    4. В криостата камере, поместите гривенник размера капли (примерно 300 мкл) встраивания смолы на теплую образца патроне, установите пробку ткани поверх смолы, нажмите вниз, а затем установите патрон в фрeezing рельс или на быстром замораживании элемента, если доступно.
    5. После того, как вложении затвердеет смолы (белый), добавить дополнительное вложение смолы в верхней части пробки, вокруг нижнего 35% от ткани и нажмите тепла экстрактор в вложению смолы для быстрого замораживания, чтобы лучше стабилизации ткани. Подождите 5 мин до секционирования, чтобы смола полностью затвердеет.
    6. Убедитесь, что зажим образца находится в крайнем нижнем положении, наиболее удаленном от лезвия. Вставьте ткань образца патрона в зажим образца.
  2. Cryosection подготовка.
    1. Ослабить держатель держатель лезвий, установить угол зазора лезвия до 10 ° (или под углом, соответствующим несущей лопасти используется), и снова затянуть. Отпустите тормоз и поверните маховик, чтобы опустить мышцу в сторону лезвия. Оцените близкое расстояние между тканью и лезвием, затем переместите ткань подальше от ножа и задействуйте руки колесный тормоз.
    2. Ослабить регулировки высоты lèveR и переместить держатель лезвий вперед или назад, соответственно, если конец ткани составляет более чем приблизительно 2 мм от ножа или если лезвие ударяет ткань. Затянуть и опустите ткань снова, чтобы проверить расстояние от лезвия. Повторите регулировки, пока диск не будет от 1 до 2 мм от конца ткани путем визуальной оценки.
    3. Опустите ткань в сторону лезвия и оценить угол ткани для поперечных сечений. Зафиксировать маховик и отпустить рычаг зажима образца. Вставьте зажим образца влево или вправо до тех пор, горизонтальная ориентация ткани перпендикулярно к лезвию.
    4. Нажмите образец зажим вверх или вниз, чтобы отрегулировать "у" ориентации, чтобы срезы ткани будет перпендикулярно длинной оси мышцы. Затянуть рычаг зажима образца.
    5. Используйте ход и тонкой подачи вперед для продвижения образца, пока он не коснется лезвия. Если искать участки с определенной глубины ткани, сбросить сумму толщин раздела нулю (верхняя часть ткани).
    6. Установите криостат дифферента функции с толщиной сечения на 30 мкм. Вырезать и отбрасывать секции до тех пор , заранее выбранная глубина для сбора ткани не будет достигнута (например, 400 мкм от вершины).
  3. Сбор криосрезах для экстракции РНК.
    1. Откройте трубу для сбора секций и поместить его рядом с несущей лопасти. С помощью предварительно охлажденный, чистую щетку, чтобы подобрать каждой секции, как это будет вырезана из лезвия и передать cryosection в трубку. Повторяйте, пока объединенные секции не весят 30 мг или желаемой глубины ткани достигается.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для взрослых мышей передней большеберцовой, коллекция из глубины тканей приблизительно от 400 до 4000 мкм, обычно дает 25 - 40 мг. Использование металлических щипцов для передачи участков в пробирку не рекомендуется, поскольку участки имеют тенденцию придерживаться и группироваться на металлической поверхности.
    2. Если вложение смолы окружает мышечную cryosection, блокировка ручного тормоза и использовать лезвие бритвы, чтобысбрить небольшие кусочки смолы, пока не будет только тонкий слой вокруг верхней части мышцы. Режьте всегда смолы с лезвием под углом от мышцы.
      Примечание: Тонкий слой встраивание смолы не существенно ухудшать вниз по течению препарата РНК. Если толщина встраивание смола присутствует, использовать щетки, чтобы дразнить его подальше от мышцы перед перемещением cryosection в трубку сбора.
    3. В качестве альтернативы, бассейн секции на держателе лезвия и передачи в объеме в трубу сбора.
      Примечание: Тем не менее, этот метод имеет тенденцию быть медленнее, и участки, более вероятно, придерживаться и слипаются, что может снизить эффективность иглы гомогенизацией в последующих стадиях.
    4. Быстро поместить Отстоявшийся cryosection трубку в аналитический баланс и отчет трубки веса. Немедленно вернуть трубку к холодной криостата камере для поддержания температуры секции возле -20 ° С. Рассчитайте массу объединенных секций.
      Примечание: Если для выделения РНК будет происходить на рекламуifferent день, не хранить Отстоявшийся cryosection трубки при -80 ° С до использования.
  4. Соберите криосрезах для гистологии.
    1. Нажмите кнопку толщины сечения для прекрасных секционирования и используйте стрелки, чтобы установить толщину криостат секции до 7 мкм (или другой толщины соответствующего раздела, как правило, от 6 до 10 мкм).
      Примечание: Разбавитель секций (от 6 до 10 мкм), следует использовать для гистологических приложений, чтобы гарантировать, что красящие реагенты могут проникать в глубину среза ткани. Тонкие секции могут быть взяты из любой глубины во время cryosectioning, но более глубокие участки, являются предпочтительными, так как встраивание смолы, которая увеличивается с глубиной ткани, не ухудшает гистологическую окрашивания.
    2. Вырезать и отказаться от 4 до 7 секций, чтобы получить последовательную, ровную поверхность ткани. Обратите внимание на глубину ткани.
    3. Вырезать раздел и ориентировать его на поверхности носителя лезвия. Возьмите секцию, быстро и нежно касаясь теплой (комнатной температуры) стекло микроскопараздел на носителе лезвия. Вернуть слайд до комнатной температуры. Продолжайте, пока желаемое количество слайдов не получается. Обратите внимание на глубину окончательной ткани.
      Примечание: Сбор второй участок (дубликат) для каждой ткани рекомендуется.
    4. С полным секционирования, включите ручной тормоз колесо, вернуть образец в положение заднего большинства, и снять патрон ткани. Используйте криостата элемент тепла, чтобы расплавить вложение смолы, держащего пробковой ткани на образец патрона. Удалить пробковой ткани, сухой тканью, и вернуться к хранению.
    5. Повторите процедуру с шага 2.1.2 для каждой оставшейся ткани. Разрешить слайды высохнуть в течение 20 минут после того, как последняя ткань установлена. Затем используйте слайды для гистологического или специфического окрашивания или замораживанием при -80 ° С в коробке слайд, пока они не потребуются.

3. Выделение РНК из консервированной криосрезах

  1. Выделение РНК
    1. Переместить трубку (ы) объединенных в пул криосрезах на льду. Немедленно добавьтеорганический реагент экстракции РНК при соотношении приблизительно 1 мл реагента на 50 мг веса cryosection, обычно 600 мкл на пробирку.
      ВНИМАНИЕ: Выделение РНК реагенты являются токсичными, коррозионные и раздражающим. Следуйте инструкциям производителя по безопасному обращению.
    2. С помощью 1 мл шприц с иглой 18 калибра, начертить РНК-экстракции жидкость вверх и ополаскивают стенки трубки, пока все ткани не суспендируют в растворе. Постарайтесь свести к минимуму пузырьки воздуха во время иглы гомогенизации.
    3. Используйте кончик иглы помять и рассеивать любые слипаются криосрезах и куски, прилипшие к стенке трубы. Triturate гомогенизировать при прохождении пробы вверх и вниз через иглу для пяти ударов, а затем вернуть образец в лед. Повторите оба шага три-пять раз, или столько раз, сколько необходимо, чтобы сорвать все комки и пройти пробу легко через иглу.
    4. Удалите иглу 18 калибра и заменить его 22 калибра иглы. Осторожно трiturate образца в течение пяти ударов, а затем возвращают в лед образец. Повторите тритурационного три-четыре раза, чтобы достичь очень мелкодисперсную гомогената ткани.
      Примечание: Если частицы ткани начинают блокировать иглу при составлении образца, изгнать все пробы из шприца и переключиться обратно на 18 иглы калибра для дальнейшей гомогенизации. Дополнительный этап растирание в порошок с 25 или 26 калибра иглы могут быть добавлены, чтобы получить максимальный выход. Тем не менее, игла может засориться поэтому существует риск образца разливания.
    5. Перемещение образца от льда до комнатной температуры. Выдержите в течение 5 мин для разрушения молекулярных комплексов.
    6. В вытяжном шкафу, добавляют 0,1 мл 1-бром-3-хлорпентан (БКП) на 1 мл реагента, используемого для выделения РНК (этап 3.1.1), как правило, 60 мкл на пробирку. Встряхните трубку энергично вручную в течение 15 сек (Не вихрь). Инкубируйте образца при комнатной температуре в течение 2-х до 3 мин. Затем центрифугу в течение 15 мин при 12000 х г и 4 ° С.
      ВНИМАНИЕ: BCP является легковоспламеняющимся и токсичным. Ручка в вытяжном шкафу и носить перчатки, лабораторный халат и защитные очки.
    7. Осторожно собрать верхнюю водную фазу (бесцветный), содержащий РНК и перенести его в чистую пробирку. Добавить равный объем 70% -ного этанола (в DEPC воды) и вихрем перемешать. Выдержите при комнатной температуре в течение до 10 мин.
      Примечание: средний и нижний интерфазная фенол-BCP фазы могут быть обработаны для геномной ДНК и белка, соответственно, в соответствии с инструкциями изготовителя или собраны в фенол-БКП опасных отходов контейнер для надлежащей утилизации.
  2. очистки РНК.
    1. Следуйте инструкциям производителя для образца связывания, промывки и элюции с незначительными вариациями 8. Например:
    2. Поместите аликвоты ДНКазы / РНКазы воды в бане с температурой 37 ° или инкубатор для предварительного тепло для стадии 3.2.4.
    3. Добавить образец РНК из 3.1.8 выше в колонне очистки и центрифугирование образца в течение 15 секпри 12000 х г при комнатной температуре. Налейте поток через обратно в ту же колонку и повторного центрифуге. Повторите еще один раз, чтобы максимизировать связывание РНК, а затем отбрасывать окончательный поток через.
    4. Выполните шаги мыть в соответствии с инструкциями изготовителя 8. Применить 700 мкл промывочного буфера (не этанол) с колонки, спина в течение 15 сек при 12000 мкг, и отбросить поток через.
    5. Добавьте 500 мкл промывочного буфера (с этанолом) в колонну спина в течение 15 секунд при 12000 х г, и отбросить поток через. Повторите этот шаг один раз.
    6. Спин пустую колонку в течение 1 мин при 12000 х г, чтобы высушить мембрану.
    7. Перенесите столбец спина к чистой RNase-, ДНКазы свободной трубки. Добавьте 40 мкл подогретого ДНКазы / РНКазы воды (от 3.2.1) к центру мембраны колонны. При комнатной температуре, инкубировать в течение 2 мин, а затем центрифугировать в течение 2 мин при 12000 х г.
      Примечание: Объем элюции 40 мкл составляет примерно 1,3 мкл на мг оригиналаткани 30 мг объединенных криосрезах. Регулировка громкости элюирования в зависимости от обстоятельств для различного веса исходной ткани, но не снижают ниже 32 мкл. Второй элюирования, используя приблизительно 0,7 мкл на мг исходной ткани, могут быть добавлены, чтобы увеличить общий выход РНК.
    8. Анализ РНК (колонка элюирования) для концентрации и чистоты с помощью спектрофотометра, электрофорез, и / или Bioanalyzer. Хранить РНК при -80 ° С до тех пор , пока требуется для последующих применений, таких как обратной транскрипции для количественной ПЦР 4.
      Примечание: Лечение ДНКазы рекомендуется перед использованием РНК в последующих применений. Эта процедура может быть выполнена на некоторых колонках очистки РНК перед стадией промывки, в этой конкретной точке следующий столбец элюирования, или на аликвоты РНК в качестве первого шага в любом вниз по течению приложения. РНК должна быть стабильной в течение нескольких лет.

4. Анализ гистологического по Иммунофлуоресцентного Staininг мышечной криосрезах

  1. Простой протокол иммунофлюоресценции.
    1. Используйте гидрофобный ручку, чтобы окружить группу секций на каждом слайде. Аккуратно уронить PBS в кружком области (приблизительно 80 мкл для небольшой площадью поверхности до 500 мкл для большой площади поверхности), стараясь не прикасаться к тканям. Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре.
      Примечание: При использовании замороженных слайдов, удалить слайды от -80 ° C морозильника и инкубировать при комнатной температуре в течение от 20 до 30 мин, чтобы разморозить и высушить, а затем продолжить, как указано выше. Требуется, по меньшей мере, две горки: одна экспериментальная слайд инкубировать в первичных и вторичных антител; и один элемент управления слайд для которых первичное антитело исключается, "единственный" вторичный контроль.
    2. Совет бегунок слейте PBS. Добавить 5% осла сыворотки в PBS (блокирующий раствор) в окружностью области; будьте осторожны, чтобы гарантировать, что участки мышц не высыхают. Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин (или до нескольких часов в камере влажности).
    3. Приготовьте раствор первичного антитела для анализа регенерации мышц. Смешать блокирующего раствора, с антителом eMHC (1:40), и антителом против ColVI (1: 1000). Подготовьте примерно 150 мкл, 300 мкл или 500 мкл для малых, средних или больших площадей скольжения, соответственно. Вихревые в течение 5 секунд, а затем центрифугировать в течение 2 мин при 15000 х г в гранулах любой осадок.
    4. Для экспериментальных слайдов, кончик бегунок слейте блокирующего раствора, а затем добавляют раствор первичного антитела из п.4.1.3. Для вторичного управления слайде, кончик бегунок слейте блокирующего раствора, а затем добавляют свежий раствор блокирующего (без антител). Инкубируйте слайдов в камере влажности при температуре 4 ° С в течение ночи.
      Примечание: Когда пипеткой растворы антител на предметные стекла, всегда тянуть жидкость из верхней части трубы первичного раствора антитела, не нарушают никакого осадка в нижней части трубы.
    5. Совет слайды слейте раствор. Добавьте по каплям PBS к кружком области каждого слайда, чтобы помыть, налить наконечниквыключите, а затем добавить еще PBS и инкубировать в течение 3-х до 5 мин. Повторить в общей сложности трех стирок.
      Примечание: Время стирки является достаточно гибким и может быть увеличена до 20 мин при желании. Как правило, число изменений решение является более важным, чем время.
    6. Подготовка вторичного раствора антител для всех слайдов (в том числе вторичного управления горкой) с использованием 1: 500 разведение красного и зеленого флуорофоров связью вторичными антителами для обнаружения мыши IgG1 (eMHC) и кролика IgG (ColVI) и 1: 10000 разбавления DAPI ядерной пятно.
      1. Например, смешайте 1 мкл DAPI с 9 мкл DDH 2 O , чтобы сделать 1:10 разбавление DAPI. Затем, в течение мкл конечного объема 500, добавить 1,0 мкл анти-мышь IgG1-красный + 1,0 мкл анти-кроличьи IgG-зеленый + 0,5 мкл 1:10 DAPI до 447,5 мкл блокирующего раствора. Вихревой смешивать и центрифугировать в течение 2 мин при 15000 х г в гранулах любой осадок.
        Примечание: В идеале, все вторичные антитела должны быть из того же вида хозяина.
    7. Совет слайды, чтобы слейте последнюю промывку PBS. Добавьте вторичное раствор антител, чтобы покрыть все ткани. Накройте слайды, чтобы защитить их от света и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
      Примечание: Все вторичные антитела должны быть проверены, чтобы иметь минимальную перекрестную реактивность с другими видами в двойных экспериментах маркировки.
    8. Вымойте слайды, как описано в разделе 4.1.5. После последней промывки кончик бегунок слейте PBS и установите предметное стекло на ткани. Добавить 3 до 4 капель водной монтажной сред вдоль одной стороны.
    9. Установите край покровного стекла только до внешнего края монтажной сред. С помощью щипцов, медленно опустите покровное в сторону ткани, а затем отпустите покровное и аккуратно нажмите на него в нужном положении. И, наконец, осторожно нажмите каждый уголок покровное, чтобы стабилизировать его.
    10. Защита слайды от света и хранить при температуре 4 ° С до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для длительного хранения, нанесите тонкий слой лака для ногтей по краю йе покровное, чтобы помочь предотвратить сползание от высыхания.
  2. Гистологическая оценка.
    1. Изображение слайды, использующие эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии с соответствующими фильтрами для обнаружения eMHC (красный); ColVI (зеленый); и DAPI окрашенных ядер (синий), как правило , с использованием 20X объективной 1,5.
    2. Убедитесь , что флуоресцентный сигнал от экспериментальных слайдов отличается от вторичного управления слайд для демонстрации специфичности обнаружения eMHC и ColVI 4.
      Примечание: eMHC положительные регенерирующие волокна должны быть видны из приблизительно от 2 до 7 дней после травмы мышц и переменно у мышей с мышечной дистрофией. Коллаген VI присутствует во внеклеточном матриксе окружающих мышечных волокон, кровеносных сосудов и нервов, а также в больших пучков соединительной ткани пери- и epimysium. DAPI ядерной пятно полезно для идентификации мышечных волокон с центральными ядрами по сравнению с периферийным ядер, указывающие на регенерацию волокон, а также наличие Infiltrating клетки. Некротические или травмированные волокна могут испачкать слабо с вторичным антителом мыши IgG из-за обнаружения эндогенных IgG, который проникает через волокна поврежденных мышечных мембран.
    3. Для количественной оценки регенерации, возьмите перекрывающихся микроскопа фотографии с каждым флуоресцентным фильтром через все изображение. Объедините изображения eMHC, ColVI и DAPI для каждого места , а затем выровнять фотографии реконструировать карту всего раздела 1,5.
    4. Использование программного обеспечения для анализа, подсчета количества eMHC положительных волокон и общее количество волокон, чтобы вычислить недавнюю регенерацию (100 * (# eMHC + волокна / # всего волокна)). Кроме того , подсчитывают количество центрально ядросодержащих волокон из общего количества волокон для измерения регенерации в течение более длительного периода (100 * (# CN + волокна / # Всего волокон)) 1,5.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мышцы cryosection РНК высокого качества и обеспечивает достаточный выход для большинства применений

Анализы шестнадцати скелетных мышечных препаратов РНК приведены в таблице 1 , с использованием 19,4 до 41 мг суммированных передней большеберцовой (TA) мышцы от 8 контрольных мышей. И левые (L) , и правая мышцы (R) TA были подготовлены в экспериментах регенерации с мышцами , собранных через 3 дня после продольного ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для достижения наилучших результатов с помощью этого метода, сохранить вложение смолы, ограниченного нижней трети или половине мышцы во время криоконсервации ткани, потому что избыток смолы замедлит коллекцию объединенных криосрезах и может увеличить вложение загрязнения смолы в изоляции РНК. Кроме того, особое внимание в ходе иглы гомогенизации важно, чтобы максимизировать доходность и минимизировать вероятность засорения иглы. Протокол может быть изменен с помощью шприца Luer-Lok для защиты от потери образцов, если иг...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Автор заявляет, что у нее нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мэдисон Грант, Стивен Фольц, Хейли Застре и Джунна Луан предоставили техническую помощь. Исследование, представленное в этой публикации, было поддержано Национальным институтом артрита, костно-мышечных и кожных заболеваний Национальных институтов здравоохранения под номером AR065077. Содержание является исключительной ответственностью автора и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ПробкаVWR Scientific23420-708Нарезается на небольшие квадратики острым лезвием.
Пластиковый покровный слипFisher Scientific12-547Используется для ориентации мышц во время замерзания.
Термометр низкотемпературныйVWR Scientific89370-158
2-метилбутанSigmaM32631-4LВнимание: опасное химическое вещество. Хранить в легковоспламеняющемся шкафу.
Смола для встраивания: "криоматрица"Thermo Fisher Scientific6769006Другие смолы для встраивания могут быть заменены на криоматриксу.
CryostatThermo Fisher Scientificmicrom HM550 с одноразовым держателем лезвияЛюбого рабочего криостата должно быть достаточно для протокола.
Одноразовое лезвие для криостатаThermo Fisher Scientific3052835Используйте соответствующее лезвие или нож для использования криостата.
Раствор для обеззараживания РНКазы: "РНКаза Зап"Thermo Fisher ScientificAM9780
Аналитические весыMettler ToledoXS64
Кисть для рисованияDaler Rowney214900920Используйте для обработки криосекций. Можно найти в магазинах с простыми художественными принадлежностями.
Лезвие бритвыVWR Scientific55411-050
Предметное стекло для микроскопаVWR Scientific48311600
РНК органический экстракционный реагент: TRIzolThermo Fisher Scientific15596026Внимание: TRIzol является опасным химическим веществом. Примечание: Для извлечения РНК из скелетных мышц рекомендуются только органические реагенты для экстракции.
Игла 18 калибраVWR ScientificBD305185
игла 22 калибраVWR ScientificBD305155
игла 26 калибраVWR ScientificBD305115опционально. Может быть использован для третьего раунда тритурации образца в протоколе экстракции РНК.
Шприц объемом 1 млVWR ScientificBD309659Для образцов с очень высокой ценностью рекомендуется использовать шприц Luer-Lok (<т>например, VWR BD309628).
1-бром-3-хлорпентан (BCP)SigmaB9673
Для 70% этанола в воде DEPC: спирт 200 пробыDecon Laboratories, Inc.+M18027161MСмешайте 35 мл 200 крепкого спирта + 15 мл воды DEPC.
Для 70% этанола в воде DEPC: вода, обработанная DEPCThermo Fisher ScientificAM9922Mix 35 мл спирта 200 крепостей + 15 мл воды DEPC.
Набор для очистки РНК: Мини-набор РНК PureLinkThermo Fisher Scientific12183018AЗаключительные этапы получения РНК.
Вода без ДНКазы/РНазы Также можно использовать воду, обработаннуюGibco10977
Спектрофотометр: Nanodrop 2000Thermo Fisher ScientificNanoDrop 2000
Dnase IThermo Fisher ScientificAM2222Treat очищенной РНК для удаления любого загрязнения ДНК перед последующим применением.
Гидрофобная ручкаThermo Fisher Scientific8899
Dulbecco's PBSGibco14190PBS для протокола иммунофлуоресценции.
Сыворотка ослякаJackson ImmunoResearch Laoratories, Inc017-000-121Регидратируйте обычный запас сыворотки осла в соответствии с инструкциями производителя, затем разбавьте аликвоту до 5% для иммунофлюоресценции. Также можно использовать обычную козью сыворотку.
УниверситетАйовы Исследования развития Hybridoma BankF1.652
Collagen VI антителаFitzgerald Industries#70R-CR009x
Donkey anti-rabbit AlexaFluor488Thermo Fisher ScientificA21206
Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546Thermo Fisher ScientificA21123
DAPI (4',6- diamidino-2-phenylindole)Thermo Fisher ScientificD1306
Водный монтажный материал: PermafluorThermo Fisher ScientificTA-030-FMИспользуйте только монтажный материал, предназначенный для флуоресцентных применений с антивыцветающими свойствами.
Покровное стеклоVWR Scientific16004-314Использование для крепления предметных колец на конце иммунофлуоресценции protocl
Программное обеспечение для анализа изображений: ImageProExpressMedia Cybernetics, Inc.Image-Pro Express, или более продвинутые продуктыFreeware ImageJ также должны работать для ручного подсчета. Более продвинутое программное обеспечение с возможностями сегментации может позволить частично автоматизировать процесс; например, ImageProPremier.
Слияние и отображение изображений разделов: PhotoshopAdobe Photoshop
CardiotoxinSigmaC9659Sigma C9659 снят с производства. Другими вариантами кардиотоксина являются EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; или Ge Script #RP17303; Но они не были подтверждены.
Комплект для обратной транскрипции: Superscript III Система синтеза первой цепиThermo Fisher Scientific18080051Можно использовать любые проверенные высококачественные реагенты для обратной транскрипции.
Стандартная ПЦР: GoTaq Flexi полимеразная системаPromegaM8298Можно использовать любую валидированную высококачественную Taq-полимеразную систему. Если секвенирование ДНК должно использоваться для любого применения после ПЦР, то вместо этого следует использовать высокоточную систему ПЦР.
SYBR зеленыйThermo Fisher ScientificS7585Для использования в количественной ПЦР, когда не используется специальная мастер-смесь для количественной ПЦР. Используйте с SuperROX (для инструментов прикладной биосистемы) и полимеразой и буферами GoTaq Flexi.
ROX: SuperROX, 15 mMBioResearch Technologies, Inc. Novato CASR-1000-10SuperROX более стабилен в реакции ПЦР, поэтому он предпочтительнее для использования в качестве пассивного референтного красителя для количественной ПЦР по сравнению с ROX (карбокси-X-родамин). Для количественной ПЦР с приборами Applied Biosystems
Real-time PCRApplied Biosystems7900HT
DEPC.

Ссылки

  1. Foltz, S. J., et al. Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice. PLoS One. 11 (1), 0147049(2016).
  2. Bartoli, M., et al. Noninvasive monitoring of therapeutic gene transfer in animal models of muscular dystrophies. Gene Ther. 13, 20-28 (2006).
  3. Ip, W. T., Huggins, C. E., Pepe, S., Delbridge, L. M. Evaluating RNA preparation options for archived myocardial biopsies. Heart Lung Circ. 20 (5), 329-331 (2011).
  4. Beedle, A. M., et al. Mouse fukutin deletion impairs dystroglycan processing and recapitulates muscular dystrophy. J. Clin. Invest. 122 (9), 3330-3342 (2012).
  5. Foltz, S. J., et al. Four-week rapamycin treatment improves muscular dystrophy in a fukutin-deficient mouse model of dystroglycanopathy. Skeletal Muscle. 6, 20(2016).
  6. AVMA Guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). Available from: www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx 1-102 (2013).
  7. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat. Protoc. 10, 1612-1624 (2015).
  8. Rump, L. V., Asamoah, B., Gonzalez-Escalona, N. Comparison of commercial RNA extraction kits for preparation of DNA-free total RNA from Salmonella cells. BMC Res. Notes. 3, 211(2010).
  9. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J. Vis. Exp. (45), e2565(2010).
  10. Valdez, M. R., Richardson, J. A., Klein, W. H., Olson, E. N. Failure of Myf5 to support myogenic differentiation without myogenin, MyoD, and MRF4. Dev Biol. 219 (2), 287-298 (2000).
  11. Pavlath, G. K., Dominov, J. A., Kegley, K. M., Miller, J. B. Regeneration of transgenic skeletal muscles with altered timing of expression of the basic helix-loop-helix muscle regulatory factor MRF4. Am. J. Pathol. 162 (5), 1685-1691 (2003).
  12. Chomczynski, P., Mackey, K. Substitution of chloroform by bromo-chloropropane in the single-step method of RNA isolation. Anal. Biochem. 225 (1), 163-164 (1995).
  13. Lee, J. T. Y., Cheung, K. M. C., Leung, V. Y. L. Extraction of RNA from tough tissues with high proteoglycan content by cryosection, second phase separation and high salt precipitation. J. Biol. Methods. 2 (2), 20(2015).
  14. Guo, D., Catchpoole, D. R. Isolation of intact RNA following cryosections of archived frozen tissue. BioTechniques. 34, 48-50 (2003).
  15. Goodpaster, T., Randolph-Habecker, J. A flexible mouse-on-mouse immunohistochemical staining technique adaptable to biotin-free reagents, immunofluorescence, and multiple antibody staining. J. Histochem. Cytochem. 62 (3), 197-204 (2014).
  16. Ikezawa, M., Minami, N., Takahashi, M., Goto, Y., Miike, T., Nonaka, I. Dystrophin gene analysis of 130 patients with Duchenne muscular dystrophy with a special reference to muscle mRNA analysis. Brain Dev. 20 (3), 165-168 (1998).
  17. Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Anal. Biochem. 474, 25-27 (2015).
  18. Espina, V., Heiby, M., Pieroban, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Rev Mol Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Cryosectioning соприкасающихся регионов скелетной мышцы одной мыши для экспрессии генов и гистологических анализов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.