Методическая статья

Настраиваемый гидрогели от легочного внеклеточной матрицы для 3D клеточных культур

DOI:

10.3791/55094

⸱

17 января 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Virginia Commonwealth University, 2Department of Physiology and Biophysics, Virginia Commonwealth University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это метод для создания 3-мерной клеточной культуры леску от легочной внеклеточного матрикса. Неповрежденными легких перерабатывается в гидрогели, которые могут поддерживать рост клеток в трех измерениях.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем метод для создания нескольких компонентов гидрогели для культивирования клеток в пробирке клеток легочной культуры. Начиная с здоровой ткани EN блок легкого из свиных, крысы или мыши, ткань перфузию и погружают в последующих химических моющих средств для удаления остатков клеток. Гистологическое сравнение ткани до и после обработки, подтверждает удаление более 95% двухцепочечной ДНК и альфа-галактозидазы окрашивание предполагает, что большинство клеточных остатков удаляется. После того, как decellularization, ткань подвергают лиофилизации, а затем cryomilled в порошок. Порошок матрицы переваривается в течение 48 ч в кислом растворе пепсином и затем нейтрализуют с образованием раствора Прегелем. Гелеобразования раствора Прегелем может быть индуцирована путем инкубации при 37 ° С и может быть использован сразу же после нейтрализации или хранили при 4 ° С в течение до двух недель. Покрытия могут быть сформированы с использованием раствора Прегелем на необработанной пластины для CELL вложение. Клетки могут быть взвешенными в Прегелем до начала самосборки для достижения 3D культуры, высевали на поверхности формованного геля, из которого клетки могут мигрировать через строительные леса, или плакированной на покрытиях. Изменения в стратегии представлены может повлиять на температуру гелеобразования, прочность, или размеры фрагментов белка. За образованием гидрогеля, жесткость гидрогель может быть увеличена с помощью генипин.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Перевод результатов in vitro в клинику является одной из самых сложных проблем, стоящих перед биомедицинскими исследователями. Исследования in vitro на пластике тканевых культур проще, удобнее и поддерживают высокую жизнеспособность клеток. 1 Этот подход является разумной отправной точкой, но результаты имеют ограниченную клиническую трансляцию. Лаборатории все чаще внедряют трехмерные конструкции, чтобы заменить традиционные двумерные методы. Обзоры доступны для многих трехмерных сред, от биологических каркасов до полимерных каркасов. 2,3

Биологические каркасы могут имитировать характеристики сред in vivo, поскольку они содержат многие белковые и гликозаминогликановые компоненты нативного матрикса и предоставляют знакомые места связывания для прикрепления и распознавания клетками. Было показано, что материалы, полученные из внеклеточного матрикса (ВКМ), являются эффективными каркасами для прикрепления и пролиферации клеток. 4 Одна из проблем, ограничивающая применение гидрогелевых платформ ECM, связана с их слабыми механическими свойствами после гелеобразования. Нативная ткань часто имеет механические свойства, которые в разы выше, чем у гидрогелей. Нетоксичные сшивающие агенты могут повысить механические свойства гидрогелей, чтобы лучше имитировать нативную тканевую среду. Генипин является нетоксичным, природным сшивающим агентом, полученным из растений гардении и способным точно подстраивать механические свойства ECM к изменениям концентрации генипина5,6.

Почти все клетки в организме существуют и организуются на ВКМ, которую они либо производят, либо поддерживают. Новый акцент на универсальном значении ЭКМ в организации, состоянии и функционировании каждого органа или системы вызвал производство матричных платформ для исследований in vitro. Подслизистая оболочка тонкой кишки свиньи является наиболее широко изученным природным каркасом и используется для регенерации сухожилий, связок, скелетных мышц4 и даже костей7. Матрицы из других органов и донорских видов также продемонстрировали хороший потенциал регенерации тканей. Использование чужеродных компонентов ЭХМ вызывает минимальные проблемы с иммуномодуляцией. После удаления клеточного вещества хозяина оставшаяся ВКМ будет аналогична по содержанию аминокислот и организации всемдругим видам млекопитающих8. Существует растущее мнение о том, что лучшим способом изучения взаимодействий между клеткой и ЭКМ in vitro является использование органоспецифичных каркасов ВКМ. Каждый орган обеспечивает уникальный состав белков и протеогликанов для создания клеточных ниш. Ниши обеспечивают структурное, функциональное и даже ферментативное расщепление внеклеточного матрикса, способствуя биофизической передаче сигналов. Для получения микроокружения in vitro, наиболее похожего на микроокружение in vivo, использование тканеспецифичной ВКМ позволит оптимизировать клеточные ниши для исследований.

Целью этого протокола является предоставление метода создания гидрогелевого каркаса, уникального для ЭКМ легких. Этот метод обеспечивает платформу для исследования in vitro взаимодействий клеток легких и ВКМ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Решение стерильный фильтр Направления
DIH 2 O да DIH 2 O; стерильно фильтруют
0,1% Тритон Х-100 Раствор да Под вытяжкой добавляют 100 мкл тритона-X 100 раствора до 100 мл DIH 2 O и перемешивают до полного растворения;
стерильный фильтр.
2% деоксихолатом Решение да Под вытяжкой добавляют 2 г раствора натрия деоксихолатом
на 100 мл DIH 2 O и перемешивают до полного растворения; Стерильный фильтр
1 М NaCl да Добавить 58,44 г NaCl в 1 л DIH 2 O; перемешивать до растворения;
стерильный фильтр
ДНКазы решение да Добавить 12000единиц ДНКазы до 1 л DIH 2 O; Добавить 0,156 г MgSO 4
(Безводная), и 0,222 г CaCl 2; перемешивать до растворения; стерильный фильтр
PBS да Комбинат 27,2 г Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (гептагидрата двухосновного),
80 г NaCl и 2 г KCl с 10 л DIH 2 O; перемешивать до растворения; отрегулировать рН до 7,4; стерильный фильтр

Таблица 1: Решения , необходимые для тканей Decellularization. Сделать решения выше для процесса decellularization. Хранить при температуре 4 ° С. Приблизительно 2,5 л потребуется для одного свиных легких.

1. Гидрогель Формирование

  1. Свиной Lung Decellularization (адаптировано из ссылок 9,10)
    1. Получите, собственная блока нормальный свиную легких, от бойни, с сердцем и Vasculature нетронутыми.
    2. Используйте ножницы ткани или скальпель, чтобы отсечь сердце, резки сосудистую сеть как можно ближе к сердцу, оставаясь васкулатура будет использоваться в последующих стадиях для перфузии.
    3. Тщательно отсечь соединительной ткани вокруг трахеи, бронхов и сосудистую сеть, используя скальпель или ножницы.
      Примечание: Определите лучшее легкое, чтобы использовать для остальной части процедуры, выбирая легкие без больших разрезов или проколов через плевры и большого количества ателектазов или окклюзии сосудов, которые могут препятствовать эффективности процесса decellularization.
    4. Срежьте неоптимальный легкие оставляя как можно больше бронх, прикрепленные к трахее, как возможно (сердца, соединительной ткани и лопастями удаленного легкого могут быть удалены). Там должно быть одно легкое, которые остаются прикрепленными к трахее и сосудистую сеть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраните секции для гистологического исследования, если это необходимо. 9
    5. Закрыть отключенные бронхи с зажимами или швом к рРевент избыток обратного потока.
    1. Подготовьте decellularization решения и хранить в холодильнике при 4 ° С , пока не понадобится (таблица 1).
    2. С помощью ручного насоса каннюлирован, чтобы соответствовать легочной артерии, заливать легочной ткани 3 раза дистиллированной водой через обе легочной артерии и трахеи. Заливать сосудистую первый каждый раз. Начинают с около 1 л в сосудистую сеть и 1,5 л в трахею для каждого перфузией, а также продукты распада клеток удаляется больше жидкости может перфузию через систему.
    3. Заливать как сосудистую и трахеи с Triton раствором X-100.
    4. Погрузите ткань легкого в Triton растворе X-100 в течение 24 ч при 4 ° С.
    5. Заливать васкулатура и трахеи 3 раза дистиллированной водой для полоскания.
    6. Заливать как сосудистую и трахеи с деоксихолата раствором.
    7. Submerge срезах тканей в дезоксихолате в течение 24 ч при температуре 4 ° С.
    8. Заливать васкулатура и трахеи 3 раза дистиллированной водой для полоскания.
    9. Заливать как сосудистую и трахеи с раствором NaCl.
    10. Погрузите ткань в отфильтрованном растворе NaCl в течение 1 часа при 4 ° С.
    11. Заливать васкулатура и трахеи 3 раза дистиллированной водой для полоскания.
    12. Заливать как сосудистую и трахеи с ДНКазы раствором.
    13. Погрузите ткань в отфильтрованного раствора ДНКазы в течение 1 ч при 4 ° С.
    14. Заливать как сосудистую и трахею 5 раз PBS.
    15. Отсечь заметное хрящевой ткани, трахеи и все канальцы 2 мм или больше в диаметре (в основном найдены вокруг рубчика и медиальных отделах легких) от проводящих дыхательных путей, оставляя только дыхательные зоны (в основном периферийные районы).
    16. Рассеките ткани в 1-дюймовые секций или меньше. Ориентация ткани не имеет значения для этого шага.
    17. Слить лишнюю жидкость и поместить ткань в 50 мл конические пробирки. Замораживание ткани при температуре -80 ° С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраните секции для гистологии, чтобы обеспечить удаление клеток и клеточных Дебрис, при желании. Мы используем H & E, α-галактозидазы, PicoGreen, гидроксипролин, нингидрином, Альциановый синий, SDS-PAGE и масс-спектрометрии, чтобы охарактеризовать. 9
  2. Обработка легких
    1. Удалите крышки из замороженных труб, содержащих decellularized легочной ткани.
    2. Поместите фильтровальную бумагу над отверстием трубки и закрепите резинкой.
      Примечание: Трубка и содержимое должно по-прежнему быть заморожены в противном случае поместить в -80 ° C до тех пор, пока заморожен.
    3. Лиофилизации ткани, пока весь избыток жидкости не исчезнет, ​​с использованием сублимационной сушилки в соответствии с инструкциями производителя. Хранить при температуре -80 ° С до готовности к мельнице.
    4. Перед началом добавления жидкого азота в морозильной камере мельницы для охлаждения и изоляции внутренних компонентов к условиям труда.
    5. Удалить магнитную мельницы бар из мельницы трубки и добавить ткань для того чтобы покрыть дно.
    6. Заменить мельницы бар и добавить свободно упакованной ткани. Бар мельница должна по-прежнему свободно перемещаться.
    7. Закройте трубку мельницы и ПЛАCE в морозильной камере мельницы.
    8. Заполните жидким азотом до максимальной линии заполнения.
    9. Морозильник мельница все ткани в мелкий порошок (примерно 5 мин, скорость сдавление ~ 600 мин -1), в поликарбонатного цилиндра с ударника из нержавеющей стали, а также из нержавеющей стали конечными заглушками с использованием морозильной мельницы в соответствии с инструкциями производителя. Хранить при температуре -80 ° С до готовности к использованию.
  3. Микропористая образование геля (8 мг / мл) (адаптировано из ссылок 9,11)
    1. Добавить 1% (вес / объем) decellularized порошка и 0,1% (вес / об) пепсина до 0,01 М HCl при постоянном перемешивании (должны быть в состоянии увидеть поток на верхнем уровне жидкости), при комнатной температуре, в течение 48 ч.
      Примечание: Порошок статически заряжен, поэтому добавление HCl после того, как порошок дает возможность вымыть избыток от стенок трубы.
    2. После гидролиза в течение 48 часов, поместите раствор и реагенты на льду в течение 5 мин.
    3. Использование охлажденный 10% (об / об) 0,1 М NaOH, А.Н.г 11,11% (об / об) в 10 раз PBS, (чтобы довести весь раствор до 1х концентрацию), довести переваренной белкового раствора в физиологическом рН 7,4.
      Примечание: Решение теперь можно хранить при температуре 4 ° С в течение одной недели. Выполнение кинетики гелеобразования с использованием Реологии 9 при желании.

2. Сшивка гидрогели для улучшения высокой механической прочностью

  1. Растворы с концентрацией 1%, 0,1% и 0,01% вес / об раствора сшивающего генипин готовили путем растворения необходимого количества генипин порошка в 10% ДМСО.
  2. Vortex раствор каждые 15 мин в течение 1 часа.
  3. Добавить генипин решение для применения ECM гидрогели (100 мкл для каждой лунки 96-луночного планшета), которые ранее были собраны в части 1.3.4.
  4. Оставьте каждое сообщение ЕСМ гидрогель сшивание в течение 24 ч при 37 ° С.
  5. Промыть ECM-гидрогелевые 3 раза PBS, пока промывной раствор больше не синий. Сшитые гидрогели будет готово для дальнейшей характеристики и CEисследования LL культуры.

3. Культура клеток с микропористой Gel

  1. Двумерная покрытие
    1. Используя решение из 1.3.3, добавить 20 мкл Прегелем раствора в каждую лунку 96-луночного необработанной планшет для тканевых культур.
    2. Охладить в течение ночи при 4 ° С, чтобы позволить адсорбции белка на пластине.
    3. Раствор Аспирируйте ПРЕГЕЛЯ и промыть PBS.
    4. Пассаж клетки 9.
    5. Добавить 10000 клеток / см 2 в лунки.
    6. Увеличение средств массовой информации до 100 мкл на лунку и инкубировать при температуре 37 ° C.
  2. Трехмерная клеточная культура 9
    1. Использование раствора из 1.3.3, ресуспендируют осажденные клетки до концентрации 1000000 клеток / мл Прегелем раствора.
    2. Быстро обойтись 16 мкл ПРЕГЕЛЯ-клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета, чтобы сформировать густой гидрогель ~ 500 мкм для культуры клеток 3D.
    3. Инкубировать при 37 ° С в течение 30мин для геля с образованием.
    4. Добавьте 100 мкл среды в верхней части, образованных гидрогелей и инкубировать при 37 ° С.
  3. Трехмерные культуры клеток на переменной жесткости гелей
    1. Использование раствора из 1.3.3, пипетка 100 мкл Прегелем раствора в каждую лунку 96-луночного планшета.
    2. Инкубируют при 37 ° С в течение 30 минут для геля для образования.
      Примечание: Сшивка шаги со стороны 2 может быть использован здесь.
    3. Пассаж клетки 9.
    4. Добавить 10000 клеток / см 2 в лунки.
    5. Увеличение средств массовой информации до 100 мкл на лунку и инкубировать при температуре 37 ° C.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя этот метод, мы изготовили гидрогели из нормальной свиньи, крысы и легких мышей (рисунок 1). Обработанные легкие обеспечивают, по оценкам, 5 мг, 40 мг и 10 г порошка ECM соответственно. Обзор процесса показана на рисунке 2. Ключевые визуализации во время процесса включают в себя: белый вид легких после ополаскивания дезоксихолат; после образования Прегелем, раствор должен быть непрозрачным, и раствор должен появиться гомогенным в течение несколь...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одним из неотъемлемых аспектов биологии является самоорганизация молекул в иерархических структур, которые выполняют определенную задачу. 13 В лаборатории, самосборка зависит от целого ряда факторов , таких как концентрация соли, рН и продолжительности сбраживания. Как показала практика, самоорганизующейся гидрогелевые формы, когда солюбилизировать белки возвращают к физиологической температуре. Гидрогель формируется способна стимулировать клеточную пролиферацию и прикрепление в пробирке.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить Smithfield фермы за пожертвование неповрежденную свиную легочной ткани. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Ху Янг, доктор Кристина Тан и отделение хирургии VCU Plastic за предоставленную нам возможность использовать свое оборудование. Гидрогеля и тканевые образцы были приготовлены для SEM на VCU кафедры анатомии и нейробиологии Микроскопия фонда при поддержке, в частности, путем финансирования из NIH-NINDS Центр Основной Grant 5 P30 NS047463 и, в частности, по форме финансирование NIH-NCI онкологический центр поддержки Грант P30 CA016059. SEM изображения образцов на VCU Nanotechnology Ядро характеризации фонда (НКК). Эта работа финансировалась Национальным научным фондом, CMMI 1351162.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Triton X-100 Fisher ScientificBP151-100Использовать в вытяжном шкафу с защитой глаз и перчатками.
Дезоксихолат натрияSigma-AldrichD6750-100gИспользовать в капюшоне с защитой глаз и перчатками.
Сульфат магнияSigma-AldrichM7506-500GНет
Хлорид кальцияSigma-AldrichC1016-500GНет
DNазаSigma-AldrichD5025-150KUNone
HClSigma-Aldrich258148-500MLИспользуйте с защитой глаз и перчатками.
PepsinSigma-AldrichP6887-5GИспользовать в вытяжном шкафу с защитой глаз и перчатками.
Гидроксид натрияFisher ScientificBP359-500Использовать с защитой глаз и перчатками.
GenipinWako Chemicals078-03021Использовать в вытяжном шкафу с защитой глаз и перчатками.
PBS 10xКачество Биологический119-069-151Нет
PBSVWR45000-448Нет
Фильтровальная бумагаВатман8519Н/Д
Ручной насосFisher Scientific10-239-1Н/Д
Стакан для выпускниковVitLab445941Н/Д
CryomillSPEX6700Используйте криоперчатки и глаз защита.
ЛиофилизаторFTS FlexiDryИспользуйте перчатки.
РеометрDiscoveryHR-2Используйте перчатки и защитные очки.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, J., Cuddihy, M., Kotov, N. Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. 14, (2008).
  2. Haycock, J. W. 3D Cell Culture. , Humana Press. (2011).
  3. Walker, J. M., Ed, Epithelial cell culture protocols. , Humana Press: Springer. New York: New York. (2012).
  4. Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta Biomater. 5 (1), 1-13 (2009).
  5. Koo, H. -J., Lim, K. -H., Jung, H. -J., Park, E. -H. Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract, geniposide and genipin. J. Ethnopharmacol. 103 (3), 496-500 (2006).
  6. Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels to Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).
  7. Suckow, M. A., Voytik-Harbin, S. L., Terril, L. A., Badylak, S. F. Enhanced bone regeneration using porcine small intestinal submucosa. J. Invest. Surg. 12 (5), 277-287 (1998).
  8. Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl. Res. J. Lab. Clin. Med. 163 (4), 268-285 (2014).
  9. Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. J.Biomed.Mater.Res.A. , (2016).
  10. Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
  11. Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
  12. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS One. 5 (9), e12905(2010).
  13. Ratner, B. D., Bryant, S. J. Biomaterials: where we have been and where we are going. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 41-75 (2004).
  14. Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nat Protoc. 7 (6), 1138-1144 (2012).
  15. Zhang, W. -J., et al. The reconstruction of lung alveolus-like structure in collagen-matrigel/microcapsules scaffolds in vitro. J. Cell. Mol. Med. 15 (9), 1878-1886 (2011).
  16. Booth, A. J., et al. Acellular Normal and Fibrotic Human Lung Matrices as a Culture System for In Vitro Investigation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 186 (9), 866-876 (2016).
  17. Matsuda, A., et al. Evidence for human lung stem cells. N. Engl. J. Med. 364 (19), 1795-1806 (2011).
  18. Zuo, W., et al. p63+Krt5+ distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517 (7536), 616-620 (2015).
  19. Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
  20. Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. Ann Thorac Surg. 96 (3), 1046-1055 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи