активация аутофагии является полезным в профилактике целого ряда заболеваний. Одним из физиологических подходов к индукции аутофагии в естественных условиях является физические упражнения. Здесь мы покажем, как активировать аутофагию с помощью аэробных упражнений и измерения уровней аутофагии у мышей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Активация аутофагии аэробикой у мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Аутофагия — это лизосомальный путь деградации, необходимый для гомеостаза, функции и дифференцировки клеток. В условиях стресса аутофагия индуцируется и нацелена на различные грузы, такие как объемный цитозоль, поврежденные органеллы и неправильно свернутые белки, для деградации лизосом. Полученные молекулы питательных веществ перерабатываются обратно в цитозоль для синтеза нового белка и производства АТФ. Активация аутофагии оказывает благотворное влияние на патогенез многих заболеваний, и сообщалось о фармакологических и физиологических стратегиях активации аутофагии. Аэробные упражнения недавно были идентифицированы как эффективный индуктор аутофагии во многих органах у мышей, включая мышцы, печень, сердце и мозг. Здесь мы показываем процедуры индуцирования аутофагии in vivo либо с помощью принудительных упражнений на беговой дорожке, либо добровольного бега на колесах. Мы также демонстрируем микроскопические и биохимические методы количественного анализа уровней аутофагии в тканях мышей с использованием маркерных белков LC3 и p62, которые транспортируются в лизосомы и разрушаются в них вместе с аутофагосомами.
Введение
Аутофагия является эволюционно консервативны путь деградации, который индуцируется в ответ на различные стрессовых условиях , таких как голод и гипоксии 1, 2. Во время аутофагии, двойные мембранные везикулы, называемые автофагосомы, включают ненужные или поврежденные субклеточных компонентов и транспортировать их в лизосомы для деградации 3. Базальный аутофагия имеет важное значение для клеточной функции и развития организма, а также ослабленным базальной аутофагии замешан во многих расстройств, в том числе нейродегенерации онкогенеза и диабета 2 -го типа 4,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры с участием животных были проведены в соответствии с руководящими принципами, утвержденными Institutional уходу и использованию животных комитета Северо-западного университета (IACUC) путем.
1. Модели для мышей
- Используйте 8-12-недельных мышей в подготовке упражнений. Для обнаружения осуществляется индуцированной аутофагии в естественных условиях, использовать GFP-LC3 трансгенных мышей (C57BL / 6 фона) для визуализации и исследования мышей C57BL / 6 для биохимических анализов.
2. Упражнение-индуцированной Аутофагия
- Настройка беговой дорожки - принудительное осуществление
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот протокол описывает два различных метода для индукции аутофагии в тканях мыши с помощью аэробных упражнений: в общей сложности 90 мин принудительного упражнений на многополосной беговой дорожке в протекала на два дня акклиматизации; или две недели добровольного упражнения на беговой колесе используется однослойных размещались мышей. В каждом протоколе упражнений, мы можем измерить поток аутофагии с помощью флуоресцентной микроскопии и Вестерн-блот-анализа в различных органах.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Аутофагия является катаболический процесс, который дает энергию и уменьшает цитотоксичность лизосомной деградации компонентов цитоплазмы или поврежденных органелл. Изучение аутофагию важно понимать регулирование клеточного гомеостаза и механизмов ответа на стресс. Новые модели и методологии , возникающие в области исследований 15, чтобы изучить , как нарушенная аутофагия способствует многочисленных патологических процессов 16, 17.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Мы благодарим Лабораторию гистологии и фенотипирования мышей Северо-Западного университета за техническую поддержку и помощь, а также Нобору Мидзусима (Университет Токио) за предоставление трансгенных мышей GFP-LC3. А. Р. и К. Х. были поддержаны стартовыми фондами Северо-Западного университета и грантом Национальных институтов здравоохранения (DK094980).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Беговая дорожка | Columbus Instruments | 150-RM Exer 3/6 | |
| Беговое колесо мыши | Super Pet | 100079365 | диаметр 11,4 см |
| Одометр | Колокольчик | DASHBOARD 100 | |
| Шприцевой насос | KD Scientific | KDS100 | |
| Флуоресцентный микроскоп | Nikon | Модель: инвертированный микроскоп ECLIPSE | |
| Криостат | Leica | CM 1850UV | |
| Гомогенизатор | IKA | 003737001 / Модель: T10 Basic S1 | |
| Chloroquine | CAYMAN CHEMICAL COMPANY | 14194 | |
| Parafolmaldehye | SIGMA-ALDRICH | P6148 | Требуются средства индивидуальной защиты. Этот продукт может выделять газ формальдегид, химическое вещество, которое, как известно, вызывает рак. |
| Монтажная среда | Vector Laboratories | H-1200 | |
| p62 антитело | BD Biosciences | 610833 | |
| LC3 антитело | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| 2x Laemmli Sample | Buffer Bio-Rad Laboratories | 161-0737 | |
| ImageJ | NIH |
Ссылки
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).
- Tracy, K., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
