Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Активация аутофагии аэробикой у мышей

12.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55099

⸱

3 февраля 2017 г.

 , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Northwestern University

В этой статье

Краткое содержание

активация аутофагии является полезным в профилактике целого ряда заболеваний. Одним из физиологических подходов к индукции аутофагии в естественных условиях является физические упражнения. Здесь мы покажем, как активировать аутофагию с помощью аэробных упражнений и измерения уровней аутофагии у мышей.

Аннотация

Аутофагия — это лизосомальный путь деградации, необходимый для гомеостаза, функции и дифференцировки клеток. В условиях стресса аутофагия индуцируется и нацелена на различные грузы, такие как объемный цитозоль, поврежденные органеллы и неправильно свернутые белки, для деградации лизосом. Полученные молекулы питательных веществ перерабатываются обратно в цитозоль для синтеза нового белка и производства АТФ. Активация аутофагии оказывает благотворное влияние на патогенез многих заболеваний, и сообщалось о фармакологических и физиологических стратегиях активации аутофагии. Аэробные упражнения недавно были идентифицированы как эффективный индуктор аутофагии во многих органах у мышей, включая мышцы, печень, сердце и мозг. Здесь мы показываем процедуры индуцирования аутофагии in vivo либо с помощью принудительных упражнений на беговой дорожке, либо добровольного бега на колесах. Мы также демонстрируем микроскопические и биохимические методы количественного анализа уровней аутофагии в тканях мышей с использованием маркерных белков LC3 и p62, которые транспортируются в лизосомы и разрушаются в них вместе с аутофагосомами.

Введение

Аутофагия является эволюционно консервативны путь деградации, который индуцируется в ответ на различные стрессовых условиях , таких как голод и гипоксии 1, 2. Во время аутофагии, двойные мембранные везикулы, называемые автофагосомы, включают ненужные или поврежденные субклеточных компонентов и транспортировать их в лизосомы для деградации 3. Базальный аутофагия имеет важное значение для клеточной функции и развития организма, а также ослабленным базальной аутофагии замешан во многих расстройств, в том числе нейродегенерации онкогенеза и диабета 2 -го типа 4, 5, 6.

Наиболее известным физиологическим аутофагия индуктором является голодание. Тем не менее, он имеет два основных ограничения. Во- первых, голодание занимает длительный период , чтобы эффективно вызывать аутофагию у животных, например, 48 часов ограничения пищи у мышейв большинстве органов. Во-вторых, голодание едва индуцирует аутофагию мозга, из-за относительно стабильные поставки питательных веществ в головном мозге. На самом деле, это также трудно обнаружить индукцию аутофагии низкомолекулярных индукторов, поскольку многие лекарства не могут проходить через гематоэнцефалический барьер. Таким образом, чтобы лучше проанализировать функцию активации аутофагии в патогенезе заболевания, мы обнаружили , что в последнее время упражнения является более сильным физиологическим способом , чтобы вызвать автофагию в течение короткого периода времени , 7, 8, 9. По сравнению с голоданием, аутофагия эффективно индуцируется беговой дорожке так быстро, как 30 мин. Таким образом, физические упражнения является удобным и мощным физиологический подход к изучению механизма аутофагии в опосредовании пользы для здоровья и профилактики заболеваний.

Есть несколько белковых маркеров для выявления аутофагии активности, в том числе LC3 и p62. LC3 (микротрубочки белок, ассоциированный с 1A / 1B-C светHain 3) является цитозольного белка (LC3-я форма), который конъюгирован с PE (фосфатидилэтаноламина) при индукции аутофагии. ПЭ-липоилироваться LC3 (LC3-II форма) набирается на autophagosomal мембран и могут быть использованы для визуализации автофагосомы когда метили GFP. Его транслокации из цитозоля в пунктате структуры автофагосомы под микроскопом является показателем индукции аутофагии. p62 является грузовой рецептор аутофагией субстратов (таких как Убиквитинирование белки), и включен в автофагосомы, а также. Так как белок разлагается в лизосомах вместе с автофагосомы, его уровни могут быть использованы для измерения потока аутофагии. Здесь мы покажем, как использовать эти маркеры для количественного определения аутофагию в различных тканях мышей, вызванных аэробных упражнений, включая принудительную упражнения (беговая дорожка) и добровольного упражнения (бег колес). Те же самые процедуры , также могут быть применены для измерения в естественных условиях аутофагии после лечения других индукторов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры с участием животных были проведены в соответствии с руководящими принципами, утвержденными Institutional уходу и использованию животных комитета Северо-западного университета (IACUC) путем.

1. Модели для мышей

  1. Используйте 8-12-недельных мышей в подготовке упражнений. Для обнаружения осуществляется индуцированной аутофагии в естественных условиях, использовать GFP-LC3 трансгенных мышей (C57BL / 6 фона) для визуализации и исследования мышей C57BL / 6 для биохимических анализов.

2. Упражнение-индуцированной Аутофагия

  1. Настройка беговой дорожки - принудительное осуществление
    1. Акклиматизироваться и обучить мышей на 10 ° в гору открытой беговой дорожке в течение 2-х дней. На 1 -й день, упражнения мышей в течение 5 мин при 8 м / мин, а на 2 -й день, упражнения мышей в течение 5 мин при 8 м / мин , а затем еще на 5 мин при 10 м / мин 10. Призовите мышей бежать аккуратным рукой подталкивание.
    2. На 3 - й день, пусть мышей пройти одну схватку работать в течение 90 мин на 10 ° в гору беговой дорожке, ЗАПУСКнг со скоростью 10 м / мин. Через 40 мин, увеличить скорость на беговой дорожке со скоростью 1 м / мин через каждые 10 мин в течение в общей сложности 30 минут, а затем увеличить скорость со скоростью 1 м / мин через каждые 5 мин до тех пор, пока не достигнет 17 м / мин, в общей сложности 90 минут времени тренировки и 1070 метров пробега.
    3. Установить электрический стимул в диапазоне низкой интенсивности (1,2 Гц), а также поощрять мышей бежать, чтобы избежать повторного ножной шок.
    4. Для сбора ткани, усыпить мышей путем изофлуран ингаляции, с последующим смещением шейных позвонков сразу после тренировки. Другие методы, одобренные эвтаназии также могут быть использованы, такие как CO2 или IP-инъекции других анестезирующих средств. Уровень аутофагии, кажется, не будут затронуты методами эвтаназии.
  2. Запуск установки колеса - добровольное упражнение
    1. Поместите мышь-ходовое колесо (диаметр 11,4 см) внутри клетки с одним-размещались мыши.
    2. Проверка выполняется с помощью мощности велосипеда одометр.Настройка параметров колеса [расстояние (в мм) за один полный оборот колеса] на 358 (11,4 * π). Измерьте расстояние пробега после 24 часов.
    3. Пусть мышь работать добровольно в течение 2-х недель при работающем колеса. Для сбора ткани, пожертвуйте мышь утром после периода эксплуатации.

3. Аутофагия Flux Оценка

  1. Для измерения аутофагической потока под покоя и нагрузки условий, лечения мышей с ингибитором аутофагии хлорохин в течение трех дней, и сравнить их с мышей, которым вводили PBS.
    1. Растворите хлорохин в PBS (5 мг / мл), и вводят хлорохин мышам внутрибрюшинно в дозе 50 мг / кг / день в течение трех последовательных дней. Жертвоприношение мышей и собирать тканей 3 ч после последней инъекции.
    2. Для мышей, осуществляемой, предварительно обработать их с хлорохин в течение двух последовательных дней в дозе 50 мг / кг / день. На третий день, впрыскивать мышей с той же концентрацией хлорохин, и после того, как90 мин пусть они работают на беговой дорожке в течение еще 90 мин.
    3. Эвтаназии мышей изофлуран ингаляции, с последующим смещением шейных позвонков. Сбор тканей сразу же после запуска, таким образом, что общее время инкубации хлорохин такой же, как контроль (покоя) у мышей (3 ч).
      Примечание: В качестве альтернативы, использовать одну инъекцию хлорохин, чтобы определить поток аутофагии в тканях мыши.

4. Ткань для уборки урожая и фиксация

  1. До начала сбора ткани готовят забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) и свежий 4% параформальдегида (PFA, предостережение: средства индивидуальной защиты требуется) в PBS при конечного рН 7,4. Хранить оба раствора при 4 ° С.
  2. Наполните 30 мл шприц с 15 - 20 мл 4% PFA (для GFP-LC3 мышей). Соедините шприц с 20 G иглой катетера.
  3. После физических упражнений, эвтаназии мышей путем изофлуран ингаляции, с последующим смещением шейных позвонков.
  4. Поместите животное на чистую рабочую поверхность на ее баск. Вырезать и открыть грудную полость, сокращая диафрагму, чтобы обнажить сердце.
  5. Сделайте небольшой надрез на печень, чтобы кровь вышла, и ввести в общей сложности 15 мл 4% PFA медленно в правый желудочек сердца через катетер, пока легкие и печень не полностью перевернуть бледно. Заливать мышь сразу же после тренировки, используя шприцевой насос с постоянной скоростью потока 90 мл / ч.
  6. После перфузии, удалить иглу и собирать тканей интерес (например , мозга 11 и скелетных мышц). Для скелетных мышц, рассекают латеральной широкой. Если коротко, то тянуть кожу ноги назад , чтобы выставить мышцы, локализовать четырехглавой мышцы бедра 12, и рассекать из латеральной широкой, что является внешняя мышца прикрепляется к верхней части бедренной кости.
  7. Для получения дополнительной фиксации и обезвоживания, поместить в ткани GFP-LC3 мышей в 4% PFA в течение 24 ч при температуре 4 ° С, а затем передавать их на 15%сахароза-PBS, при 4 ° С в течение ночи или до тех пор, пока ткани осели, а затем до 30% сахарозы PBS при 4 ° С в течение ночи или в течение более длительного хранения. Хранить образцы в темноте, как можно больше, как они могут быть чувствительны к сильным светом.
  8. Для Вестерн-блоттинга оснастке замораживать ткани от мышей C57BL / 6 непосредственно в жидком азоте и хранить их при температуре -80 ° C.

5. Анализ изображений GFP-LC3 Puncta

  1. процесс ткани
    1. Предварительная обработка тканей (ранее зафиксированные в PFA и хранятся в 30% сахарозы) в вложение среды, такие как "Оптимальная температуры резания соединения" (ОКТ) в течение нескольких минут в меченым небольшую чашку Петри.
    2. Передача ткани в маркированный cryomold, содержащей достаточное количество свежей ОКТ, чтобы покрыть ткань. Сориентируйте секционирования поверхности к нижней части cryomold (сечение латеральной широкой мышцы и сагиттальный раздел для полугидрата головного мозга). Избегайте образования пузырьков.
    3. FreЭз образцы путем размещения cryomold в течение нескольких минут в закрытой пены охладитель, заполненный сухим льдом, пока не Октябре побелеет. Оберните отдельных образцов в маркированных фольги, запечатать их в полиэтиленовый пакет и хранить их при температуре -80 ° С в течение ночи или дольше.
    4. Используйте криостат вырезать образцы секций при толщине 10 мкм, и смонтировать разделы на слайдах. Храните слайды при температуре -20 ° С, и всегда держать слайды в защищенном от света, когда это возможно.
  2. подготовка слайдов
    1. Удалить слайды из морозилки и разморозить их при комнатной температуре. Накройте участок ткани с каплей монтажа сред с DAPI. Поместите покровное соответствующего размера на вершине и избежать образования пузырьков.
    2. Используйте лак для ногтей, чтобы запечатать края покровного стекла, позволяют лак для ногтей, чтобы высохнуть в темноте при комнатной температуре, а затем хранить слайды в светонепроницаемой таре при температуре 4 ° С, или продолжить захвата изображений из GFP-LC3 Puncta.
  3. <сильный> Количественное GFP - LC3 Puncta с помощью флуоресцентной микроскопии
    1. Выполните эпифлуоресцентной микроскопии, захватывая снимки в том же состоянии (экспозиции и настроек) для всех образцов. Для GFP, использовать длину волны излучения 525 нм; для DAPI, используют 490 нм. Приобретать по меньшей мере десять изображений в образце с использованием объектива 60X для латеральной широкой мышце бедра и область лобной коры головного мозга.
    2. Количественно количество GFP-LC3 Puncta в области тканевого 2500 мкм 2 в каждом изображении для статистического анализа, ослепленный для экспериментальных групп. Вычислить среднее число из 10 изображений каждого образца, используя функцию автоматического измерения "Объекта Count". Установки для латеральной широкой мышцы являются: Порог L = 10, H = 200; 2X гладкие; 1X чистые и настройки для мозга лобной коры являются: Порог L = 11, H = 200; 2X гладкие; 1X чистый.

6. Вестерн-блот-анализ на маркеры Аутофагия

  1. <сильный> Процесс ткани
    1. Готовят лизирующий буфер: 50 мМ Трис-HCl; 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА; 1% Тритон Х-100; ингибитор протеазы и ингибитор фосфатазы (свеже добавлен).
    2. Снимите ткань мышей C57BL / 6 от -80 ° C хранения. Обрежьте мышечной ткани на мелкие кусочки с лезвием бритвы до начала следующего процесса. Добавьте 800 мкл (для гемицеллюлозы мозга) или 500 мкл (для латеральной широкой мышце бедра) холодного буфера для лизиса к образцу. Однородный образца при температуре 4 ° С с помощью гомогенизатора при средней скорости.
    3. Полностью лизировать гомогенизированной смеси в течение еще 30 мин до 1 ч при 4 ° С с вращением.
    4. Спин вниз гомогената при 12000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С, отбросить осадок, и собирают супернатант в новую пробирку.
  2. анализ Аутофагия
    1. Определить концентрацию белка лизатов ткани с использованием набора для анализа BCA Protein в соответствии с техническими требованиями изготовителя. Нормализовать каждый образецв той же концентрации.
    2. Смешайте образца с буфером для образца 2x Лэммли в соотношении 1: 1, варить при температуре 95 ° С в течение 5 - 10 мин, и продолжить Вестерн - блот - анализа на аутофагией маркеры 13, 14, такие как p62 (анти-p62 антителом, 1: 500 разбавление) и LC3 (анти-LC3 антитела, 1: 500 разбавление). Кипение образцы сразу после добавления буфера выборок, как более инкубирования на льду, может генерировать несколько деградированных полос LC3.
    3. Количественно P62 и LC3 полос анализа денситометрии с использованием ImageJ, и нормализовать значение соответствующего актина полосе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол описывает два различных метода для индукции аутофагии в тканях мыши с помощью аэробных упражнений: в общей сложности 90 мин принудительного упражнений на многополосной беговой дорожке в протекала на два дня акклиматизации; или две недели добровольного упражнения на беговой колесе используется однослойных размещались мышей. В каждом протоколе упражнений, мы можем измерить поток аутофагии с помощью флуоресцентной микроскопии и Вестерн-блот-анализа в различных органах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Аутофагия является катаболический процесс, который дает энергию и уменьшает цитотоксичность лизосомной деградации компонентов цитоплазмы или поврежденных органелл. Изучение аутофагию важно понимать регулирование клеточного гомеостаза и механизмов ответа на стресс. Новые модели и методологии , возникающие в области исследований 15, чтобы изучить , как нарушенная аутофагия способствует многочисленных патологических процессов 16, 17.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим Лабораторию гистологии и фенотипирования мышей Северо-Западного университета за техническую поддержку и помощь, а также Нобору Мидзусима (Университет Токио) за предоставление трансгенных мышей GFP-LC3. А. Р. и К. Х. были поддержаны стартовыми фондами Северо-Западного университета и грантом Национальных институтов здравоохранения (DK094980).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Беговая дорожкаColumbus Instruments150-RM Exer 3/6
Беговое колесо мышиSuper Pet100079365диаметр 11,4 см
ОдометрКолокольчикDASHBOARD 100
Шприцевой насосKD ScientificKDS100
Флуоресцентный микроскопNikonМодель: инвертированный микроскоп ECLIPSE
КриостатLeicaCM 1850UV
ГомогенизаторIKA003737001 / Модель: T10 Basic S1
ChloroquineCAYMAN CHEMICAL COMPANY14194
ParafolmaldehyeSIGMA-ALDRICHP6148Требуются средства индивидуальной защиты. Этот продукт может выделять газ формальдегид, химическое вещество, которое, как известно, вызывает рак.
Монтажная средаVector LaboratoriesH-1200
p62 антителоBD Biosciences610833
LC3 антителоNovus BiologicalsNB100-2220
2x Laemmli SampleBuffer Bio-Rad Laboratories161-0737
ImageJNIH

Ссылки

  1. Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).
  2. Tracy, K., et al. BNIP3 is an RB/E2F target gene required for hypoxia-induced autophagy. Molecular and cellular biology. 27, 6229-6242 (2007).
  3. Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
  4. Nikoletopoulou, V., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Autophagy in the physiology and pathology of the central nervous system. Cell Death Differ. 22, 398-407 (2015).
  5. Rocchi, A., He, C. Emerging roles of autophagy in metabolism and metabolic disorders. Frontiers in biology. 10, 154-164 (2015).
  6. Mathew, R., Karantza-Wadsworth, V., White, E. Role of autophagy in cancer. Nature reviews. Cancer. 7, 961-967 (2007).
  7. He, C., et al. Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis. Nature. 481, 511-515 (2012).
  8. He, C., Sumpter, R. J., Levine, B. Exercise induces autophagy in peripheral tissues and in the brain. Autophagy. 8, 4(2012).
  9. Kuramoto, K., et al. Autophagy activation by novel inducers prevents BECN2-mediated drug tolerance to cannabinoids. Autophagy. 12, 1460-1471 (2016).
  10. Dougherty, J. P., Springer, D. A., Gershengorn, M. C. The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse. JoVE. , (2016).
  11. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nature protocols. 8, 1680-1693 (2013).
  12. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature protocols. 10, 1612-1624 (2015).
  13. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
  14. Bjørkøy, G., et al. Chapter 12 Monitoring Autophagic Degradation of p62/SQSTM1. Methods Enzymol. 452, 181-197 (2009).
  15. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12, 1-222 (2016).
  16. Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the Pathogenesis of Disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
  17. Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
  18. Fang, Y., et al. Duration of rapamycin treatment has differential effects on metabolism in mice. Cell Metab. 17, 456-462 (2013).
  19. Thomson, A. W., Turnquist, H. R., Raimondi, G. Immunoregulatory functions of mTOR inhibition. Nature reviews. Immunology. 9, 324-337 (2009).
  20. Miller, R. A., et al. Rapamycin-mediated lifespan increase in mice is dose and sex dependent and metabolically distinct from dietary restriction. Aging Cell. 13, 10(2014).
  21. Grumati, P., et al. Physical exercise stimulates autophagy in normal skeletal muscles but is detrimental for collagen VI-deficient muscles. Autophagy. 7, 1415-1423 (2011).
  22. Lira, V. A., et al. Autophagy is required for exercise training-induced skeletal muscle adaptation and improvement of physical performance. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 27, 4184-4193 (2013).
  23. Lo Verso, F., Carnio, S., Vainshtein, A., Sandri, M. Autophagy is not required to sustain exercise and PRKAA1/AMPK activity but is important to prevent mitochondrial damage during physical activity. Autophagy. 10, 1883-1894 (2014).
  24. Kregel, K. C., et al. Resource book for the design of animal exercise protocols. American Physiological Society. , 152(2006).
  25. Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debated, K. S., Kleeberg, S. R. Interstrain variation in murine aerobic capacity. Med Sci Sports Exerc. 33, 5(2001).
  26. Rezende, E. L., Chappell, M. A., Gomes, F. R., Malisch, J. L., Garland, T. Maximal metabolic rates during voluntary exercise, forced exercise, and cold exposure in house mice selectively bred for high wheel-running. The Journal of experimental biology. 208, 2447-2458 (2005).
  27. Kayatekin, B. M., Gonenc, S., Acikgoz, O., Uysal, N., Dayi, A. Effects of sprint exercise on oxidative stress in skeletal muscle and liver. European journal of applied physiology. 87, 141-144 (2002).
  28. Kawanaka, K., Tabata, I., Tanaka, A., Higuchi, M. Effects of high-intensity intermittent swimming on glucose transport in rat epitrochlearis muscle. J Appl Physiol. 84, 4(1998).
  29. Fernando, P., Bonen, A., Hoffman-Goetz, L. Predicting submaximal oxygen consumption during treadmill running in mice. Can J Physiol Pharmacol. 71, 4(1993).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

GFP LC3LC3 IIp62
Активация аутофагии аэробикой у мышей
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.