Простой Одношаговый Вскрытие Протокол целом монтажа подготовки взрослых Drosophila Мозги

Модель организма дрозофилы, широко известный как дрозофилы, уже давно ценится за его изящными генетических инструментов, короткие репродуктивные времена, и высоко консервативны молекулярных и клеточных путей. Плодовая муха была успешно использована для рассекают основных сигнальных путей, структурирование механизмы многоклеточных организмов, а также механизмы , лежащие в основе развития нейронов, функции и заболевания ^1,2. С учетом последних достижений в области маркировки клеток и визуализации технологий, плодовая мушка мозг стал особенно мощным в тонкой отображения нейронной цепи и в рассекает молекулярной и клеточной основы высших мозговых функций, таких как обучение и память, и циркадный ритм ^{1,3, 4,5,6,7,8.}

Одним особым преимуществом системы Drosophila является его относительно небольшой размер, что позволяет целом монтажа подготовку и обследование головного мозга с помощью обычного соединения или конфокальной микроскопии. Тхиs функция позволяет подробные анатомические и функциональный анализ нейронной цепи, или даже один нейрон, на клеточном и субклеточном уровнях, в контексте всей ткани мозга, таким образом, обеспечивая как целостный взгляд на исследуемый объект и его точную геометрию в целом головной мозг. Однако, учитывая довольно миниатюрные размеры мозга, он также представляет собой сложную техническую задачу в эффективно рассекает неповрежденный ткани мозга из защитного экзоскелет головки случае во взрослой мухи. Различные эффективные и относительно простые методы рассечение были описаны подробно, которые обычно включают тщательное и ступенчатые удаление корпуса головки и связанные с ним ткани и глаза, трахеи, и жир из мозга надлежащего ^{9, 10.} Эти микрохирургические методы рассечение часто устанавливают достаточно жесткие требования к качеству диссекции пинцетом, опираясь на щипцов с прекрасными хорошо выровненных советов, которые могут быть легко повреждены. Более того, как рассеченные мозг часто separatред от остальной части тела, мозг может быть легко потеряны во время последующих окрашивания и моечных процессов из-за их малых размеров и их прозрачности в буфере обработки. Здесь мы описываем относительно простой и легкий в освоении, один шаг протокол рассечение для мозга взрослого человека, который держит расчлененный мозги, прикрепленные к туловищу. Процесс рассечение часто легко убирает большую часть мозга ассоциированных тканей, таких как глаз и трахеи и снижает спрос на хорошее качество рассечение щипцов.

Кроме того, при визуализации мозга под флуоресцентным микроскопом или составного конфокальный микроскоп, сторона мозга, который находится вдали от флуоресцентного источника света часто дает более слабый сигнал и менее четкие изображения из-за толщины мозга целом монтажа. Здесь мы также опишем простой способ установки, позволяющий легко листать образцов мозга, что позволяет удобно визуализации обеих сторон мозга с аналогичным сигналом Intensiти и качества.

В качестве доказательства правильности концепции для применения этого метода для изучения мозга взрослого человека, мы исследовали далее присутствие DA нейронов в мозге W ¹¹¹⁸ мух; генотип , который часто используется в качестве родительской линии для получения трансгенных мух и контроль дикого типа во многих исследованиях Drosophila.

1. Решения, используемые для мозга Вскрытие и иммунофлуоресцентного окрашивания

1. Рассеките взрослого летать мозги в искусственной спинномозговой жидкости (ACSF): 119 мМ NaCl, 26,2 мМ NaHCO _3, 2,5 мМ KCl, 1 мМ NaH ₂ PO _4, 1,3 мМ MgCl ₂ и 10 мМ глюкозы. Перед использованием Газ ACSF с 5% CO _2/95% O ₂ в течение 10 - 15 мин и шип с 2,5 мМ CaCl _2. Стерилизацию раствора ACSF путем фильтрации через мембрану 0,22 мкм фильтр.
   Примечание: Храните ACSF при температуре 4 ° С , чтобы предотвратить бактериальное заражение. Муха мозг также может быть расчленена в растворе фосфатно-солевом буфере (PBS), хотя детальное сравнение эффектов двух рассечение решений на конечное качество формирования изображения рассеченных мозга не была выполнена.
2. С помощью 4% параформальдегида (PFA), полученного в 1х PBS в качестве закрепляющего раствора, который, как правило, на аликвоты и хранили при -20 ° С.
   обеспечения уплатып: PFA является токсичным и коррозионными и должны быть обработаны с осторожностью.
3. Используйте 1X PBS, чтобы промыть PFA из головного мозга и после последней стадии промывки, во время иммунофлуоресцентного окрашивания рассеченных мозга. Подготовьте 1x PBS с 10 - кратным PBS раствора (1,37 М NaCl, 27 мМ KCl, 100 мМ Na ₂ HPO ₄ и 18 мМ KH ₂ PO _4).
4. С помощью 0,3% Tween-20 в PBS (1x 1x PBT) для всех последующих стадий промывки во время иммунофлуоресцентного окрашивания рассеченных мозга.

2. микрохирургические Препарирование взрослых Fly Heads

Примечание: Процедура рассечение показана на рисунке 1.

1. Обезболить взрослых мух CO _2. Использование щипцов, поднимите муху и кратко депарафинизации его кутикулу путем погружения его в 70% этаноле в течение 3 - 5 с. Это гарантирует, что никакие пузырьки не прилипают к лету кутикулы при погружении в ACSF или раствор рассечение 1X PBS.
2. Подрассекает микроскоп с источником света под углом, который не будет заблокирован вручную, установите объектив для достижения четкое представление о лету (1.2x увеличением). Используйте пинцет с недоминирующем рукой , чтобы обездвижить животное и погружать муху в холодный раствор с рассечение брюшко вверх, как показано на рисунке 1А.
3. Хранить щипцов при 160 - 170 ° углом по отношению к рассечение пластины, в то время как прилагая небольшое усилие на живот мухи (показано стрелками на рисунке 1a). Этот шаг будет иммобилизации летать и заставить его двигаться головы назад на 15 - 25 ° при расширении хобот вверх. В процессе, мягкой и полупрозрачной область кутикулы, под хоботка, должны стать очевидными. Увеличьте масштаб и отрегулируйте фокальную плоскость на эту область.
   Примечание: Не держите пинцет слишком плотно, а просто достаточно прочны , чтобы стабилизироватьмуха. Слишком большое усилие вызывает внутренние органы к разрыву в раствор.
4. Используйте доминирующую руку, чтобы нажать рассекает пинцетом так, чтобы его советы закрыты, что будет генерировать мягкий силу сопротивления на кончики пинцета, так что пинцет будет весной открытым, когда давление со стороны раздаточной стороны освобождается. Расположите щипцов перпендикулярно к щипцов держащих муха, как показано на рисунке 1В.
   1. Пирс закрытые концы рассечение щипцов через мягкую и полупрозрачной области кутикулы под хоботка, как показано красной стрелкой на рисунке 1В. Важно, чтобы не проникнуть в щипцов слишком глубоко, что она затрагивает мозг. Мозг собственно должен стать видимым. Поддержание стабильного понимание лету с недоминирующем рукой.
5. Быстро, но устойчиво, выпустите кончики рассечение щипцов своей собственной силой и опираться на импульс от этого выпуска, чтобы оторвать тон экзоскелет окружающих голову мухи. Нетронутым мозг собственно должен стать видимым (белая ткань непосредственно над кончик нижнего силы р на фиг.1C) Выполните воображаемую линию , чтобы направлять импульс высвобождаемых Forcep наконечниками (проиллюстрированных как внешнее красных стрелок , показанных на рисунке 1C). Это будет мягко удалить экзоскелет и большая часть мозга ассоциированных с глазом и трахеи из головного мозга. Правильный выбор времени и усилие, прилагаемое для открытия экзоскелет будет зависеть от опыта исследователя.
   Примечание: Это самый важный шаг во время вскрытия. Важно, чтобы полагаться на естественной силы, генерируемой импульса открытия щипцов для удаления экзоскелет, оставляя обнаженный мозг остается прикрепленной к остальной части тела.
6. Используйте пинцет в доминирующую руку, чтобы тщательно удалить остаточные ткани аксессуары, такие как трахеи, которая появляется в виде белых волокнистых структур remainiнг прилагается к мозгу. Будьте осторожны, чтобы не тянуть или повредить мозг правильной.

3. Иммунофлуоресцентного Окрашивание Мозги

1. Закрепить расчлененный образцы мозга и связанные с ними торс приблизительно 1 мл 4% PFA в течение 40 - 60 мин.
   Примечание: Для этого и последующих шагов, держите пробирки или пластины с образцами на nutator правильно смешивать образцы в растворе.
2. Промыть 1 мл 1x PBS с помощью пипетки раствор вверх и вниз 3 раза. Будьте осторожны, чтобы не аспирата мозги прочь.
3. Промыть 5 раз с помощью 1x PBT в течение 5 мин каждый. Держите образцы на nutator во время инкубации.
4. Инкубируйте с первичными антителами, при правильном разбавления O / N при температуре 4 ° С.
5. На следующий день, удалить первичные антитела, и мыть образцов 5 раз 1x PBT. Оставьте образцы в течение 5 - 10 мин в растворе 1x PBT между каждым мытьем. Держите образцы на nutator во время инкубации.
6. Выдержите промытыйОбразцы в соответствующих вторичных антител с предложенным разбавлении и времени инкубации.
7. Вымойте образцов в шесть раз с 1x PBT с 10-минутной инкубации между каждой стирки.
   Этот шаг имеет решающее значение для удаления неспецифически связанных вторичных антител из образца.
8. Выдержите в 1: 10000 разбавлении 1 мг / мл 4 ', 6'-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в растворе 1х PBT в течение 30 мин. DAPI, представляет собой ДНК-краситель, который связывается с регионами АТ ДНК и могут быть использованы для выявления общей морфологии мозга.
9. Промыть три раза 1x PBS.
10. Образцы Переложить в рассечение блюдо, так и отдельные мозги от тела в рассечение блюдо с помощью щипцов.
11. После окрашивания и стадий промывки, смонтировать мозги между двумя покровные и поместить покровные поверх монтажной ползуна. Таким образом, образцы мозга можно легко перевернуть так, чтобы обе стороны мозга могут быть отображены с аналогичной интенсивности сигнала.
    
12. Поместите 18 х 18 мм покровным поверх монтажной ползуна. Расширьте отверстие наконечника пипетки с лезвием и использовать его для передачи мозги в 1х растворе PBS на 18 х 18 мм покровным.
13. Поместите мозги на середину покровного стекла, удалить жидкость вокруг мозга с тонкой наконечником пипетки, а затем добавить еще 20 - 40 мкл анти-выцветанию монтажной среды (0,2% (вес / объем) н-пропилгаллат в 99,5 % ACS класса глицерина) по сравнению с мозгом.
    Примечание: Количество гистологическая среда добавлен зависит от количества мозгов обследованных.
14. Аккуратно распределите мозги при перемещении вязкой монтажной среды наружу. Поместите второй 18 х 18 мм покровным на верхней части мозга, сначала опуская слайд с одной стороны, пока он не войдет в контакт споверхность монтажной скольжением, а затем медленно опуская другую сторону, чтобы свести к минимуму контакт мозга с воздушными пузырьками.
    Примечание: Там нет необходимости использовать распорку между двумя покровные, как объем монтажной среды и мозг должен обеспечить достаточное пространство для разделения двух покровные.
15. Разрешить слайды осесть. Удалить лишнюю жидкость, которые выходят из сторон клиньев с лабораторной ткани.
16. Для предотвращения покровные с установленными мозги от падения монтажной слайд во время транспортировки, используйте небольшой кусочек ленты, чтобы прикрепить покровные к монтажному слайде.
    Примечание: Мозги монтируется между суппорты могут быть отображены немедленно или хранили при 4 ° С в течение до одной недели без существенной потери флуоресцентного сигнала, без необходимости использования каких - либо герметик для уплотнения слайды. Для длительного сохранения окрашенных мозга, стороны двух промахов могут быть запечатаны шIth лак для ногтей и хранить в -20 ° C морозильнике, хотя запятнанные мозг может потерять свои сигналы в течение долгого времени. Это не рекомендуется.

На рисунке 1 показаны основные процедуры для взрослых рассечение мозга, как описано выше , 2 и 3 представляют собой репрезентативные образы 3-дневного возраста WT. (Генотип: W 1118) для взрослых летать мозги, которые были costained с антителом против Тирозингидроксилаза (TH , окрашенные в красный цвет на рисунке 2 и белый на рисунке 3), маркер обычно используется для обозначения DA нейронов 11, в дополнение к ДНК красителя DAPI маркировать все клеточные ядра и антитела против белка Elav, маркер для всех дифференцированных нейронов в лету (окрашен в зеленый цвет), которые вместе показали общую структуру мозга.

Для получения первичных антител на рисунках 2 и 3, мы использовали кроличье анти-TH антитела при разведении 1: 200 и крысиного анти-Elav антителом при разведении 1: 100, бееч готовили в 1x PBT с 5% нормальной козьей сыворотки, чтобы блокировать неспецифическое связывание. Для получения вторичных антител, мы использовали Alexa Fluor 488-конъюгированного антитела козы против крысиных и AlexaFluor596-конъюгированный козий анти-кроличий антитела в разведении 1: 500 в 1х PBT.

Чтобы создать образ, мозги, мы использовали вертикальное соединение флуоресцентный микроскоп, снабженный функцией apotome приобрести Z-Stack изображений срезов мозга, которые охватывают всю глубину области интереса в головном мозге. Например, чтобы получить четкую визуализацию общего распределения DA нейронов в целом мозге, мы использовали 20X объектив отдельно изображение передняя и задняя стороны одного и того же мозга (рисунок 2). Глубина каждой стороне мозга, который может изображается охватить все нейроны DA составляет около 20 - 25 мкм в общей сложности. Для того, чтобы надежно визуализировать и количественно DA нейроны в области РАМ кластера, которые имеют меньшие размеры ячеек и слабее TH сиgnals (смотри ниже), мы использовали 40X объектив. Кроме того, в функции сбора Z-серии от коммерческого программного обеспечения, мы выбрали раздел толщиной 0,5 - 1 мкм между каждым изображаемого среза, что обеспечивало оптимальное качество изображения в 3D - реконструкции региона РАМ кластера (рис 3в). Толщина АИМ кластера в мозге, который охватывает все нейроны DA составляет около 8 - 10 мкм в общей сложности. По нашему опыту, функция apotome может значительно снизить шумовой сигнал в визуализации толстых образцов с высоким фоном, таких как весь мозг или региона РАМ кластера.

Фигуры 2А-Е показывают переднюю вид головного мозга, тогда как фигуры 2F-J показывают вид задней одного и того же мозга после того, как листать покровные , которые держат образцы мозга, которые отображают подобный уровень интенсивности сигнала между двумя сторонами мозга для все три изображаемого канала. DA NeurДополнения были сгруппированы в различные кластеры после раннего обозначения 11, хотя здесь мы используем имя Paired Задней медиальной (PPM) , чтобы включить PPM1, PPM2 и PPM3 кластеров на передней стороне мозга, а также имя Paired POSTERIOR боковой (PPL ) , чтобы покрыть кластеры PPL1 и PPL2 от задней части мозга, как показано на рисунках 2Е и 2J. рис 2Е и 2J в белом шоу передней и задней взглядов одного и того же мозга в высоком увеличении, показывая различные кластеры DA нейроны с обеих сторон мозга. Белый пунктирные линии подчеркивают выдающуюся Пэм и спаренная Передней Боковой (PAL) кластеры в передней части мозга (рис 2E), а также Закона о госзакупках и РРМ кластеров в задней части мозга (рис 2J).

Фигуры 3А и 3В повторное резюме результатов количественной оценки для некоторых из кластеров DA в 1118 ш мух. Мы насчитали DA нейроны Кусочек за кусочком, а также от 3D реконструированы изображения, которые должны сводить к минимуму неточное подсчета. По нашим оценкам, 3-дневные ж 1118 мухи имеют в среднем 27 DA нейронов в целом в кластере PPM в мозг, 16 DA нейронов в кластере PPL на полушарии, 5 DA нейронов в PAL кластера на полусфере (рис 3А), и 97 DA нейронов в каждом из РАМ кластеров (рис 3B). Рисунок 3C является представителем 3D реконструкция DA нейронов в PAL и РАМ кластеров, проецируемых из кусочков большого увеличения изображений , охватывающих все нейроны DA в этом регионе. Очевидно, что по сравнению с другими кластерами, такими как PAL, DA нейроны в РАМ кластере имеют относительно меньшие размеры ячеек и более слабые сигналы, TH окрашиванию.

"SRC =" / файлы / ftp_upload / 55128 / 55128fig1.jpg "/>
Рисунок 1:. Графическое изображение рассечения протокола для взрослых дрозофилы мозга (А) Мухи расположены с вентральной стороны вверх, и удерживается в грудной клетке с использованием не доминантной рукой. Силы осторожно наносят (красные стрелки) с щипцами, чтобы вызвать обратную наклон головы летучей и небольшим внешним расширением хоботка, обнажая белую прозрачную область ниже. (B) Щипцы из доминантной руки вставлены в прозрачной области под хоботка, создавая неглубокий надрез (красная стрелка). Обратите внимание, что щипцы, которые мы используем, не имеют очень тонкие концы наконечника. (С) Щипцы могут отделиться через свою собственную силу, как указано красными стрелками. Импульс, открыв щипцов удаляет глаза и экзоскелет, подвергая относительно чистую дрозофилы мозга. Большая часть трахеи удалены в процессе. ( Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис . 2: Д. А. Нейроны раскрыты с анти-Тирозингидроксилаза (TH) антител в взрослых мужчин Drosophila B дождя (приобретенная с Цель 20Х) Эта цифра включает репрезентативные образы расчлененных мозга взрослого человека , реконструируют с использованием Z стеками изображения области мозга проценты, полученные с соединением флуоресцентного микроскопа. (AE) Передней и (FJ) Posterior виды одного и того же мозга взрослого человека; (A & F) клеточных ядер были обследованы с помощью DAPI окрашивания (белый) и нейронов (C & H) WERE метили пан-нейронный маркер анти-Elav антител (зеленый цвет); (B & G) DA нейроны выявлены анти-TH антител (красный). (D & I) Наложение изображений для DAPI, TH и лечения Elav. (Е & J) Увеличенный вид областей головного мозга с DA нейронами показаны белым. Пунктирные линии подчеркивают PAL и Пэм кластеров в передней части мозга и PPL и ПМП кластеров в задней части мозга. Шкалы составляет 50 мкм во всех панелях. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Количественная DA нейронами в головном мозге взрослого мужчины ш 1118 мух (Приобретенные с 40X Цель). (A & B) Количественная DA пeurons дня 3 самца W 1118 мух, выявленные анти-TH окрашивания. Данные представлены усов коробчатых участков с указанием минимальных и максимальных значений, что и выбросов; а также первый (Q1), второй (Q2) и третьего (Q3) квартили. Второй квартиль представлена ​​как среднее значение. (A) PPM {(п = 28) Минимум: 21, 1: 24, Средний балл: 27, 2: 30, Макс: 32}, PPL {(п = 26) Минимум: 10, 1: 12, Средний балл: 16, Q2: 18, Макс: 25} и {PAL (п = 24), Min: 2, 1: 4, Средний балл: 5, 2: 5, Макс: 10} кластеры; (B) РАМ кластер {(п = 20) Минимум: 86, 1: 94, Средний балл: 97, 2: 97, Макс: 99}. (C) представитель проекции изображение , показывающее DA нейроны в РАМ и PAL кластеров самца ш 1118 мух на 3 суток. Шкала бар составляет 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Авторам нечего раскрывать.