Методическая статья

Простой Одношаговый Вскрытие Протокол целом монтажа подготовки взрослых Drosophila Мозги

DOI:

10.3791/55128

⸱

1 декабря 2016 г.

 ,  ,  , 
1Center for Metabolic and Degenerative Diseases, The Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, Programs in Human and Molecular Genetics and Neuroscience, The Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2Department of Natural Sciences, University of Houston - Downtown, 3Department of Neurobiology and Anatomy, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Взрослых Drosophila мозг является ценным система для изучения нейронной цепи, высшие функции мозга, и сложные расстройства. Эффективный метод рассекать всю мозговую ткань от маленькой головы летучей будет способствовать мозга на основе исследования. Здесь мы опишем простой, один шаг рассечение протокол мозга взрослого человека с хорошо сохранившейся морфологии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует растущий интерес к использованию дрозофилы для моделирования мозга дегенеративных заболеваний человека, карта нейронные схемотехника в взрослом мозге, и изучение молекулярной и клеточной основы высших функций мозга. Препарат целого монтирование мозга взрослого человека с хорошо сохранившейся морфологии имеет решающее значение для таких всего головного мозга на основе исследований, но может быть технически сложным и занимает много времени. Этот протокол описывает простой в освоении, один шаг рассечение подход головки взрослых мух менее чем за 10 секунд, сохраняя при этом неповрежденный мозг, прикрепленный к остальной части тела, чтобы облегчить последующие этапы обработки. Процедура помогает удалить большую часть глаза и трахеи тканей, обычно связанные с мозгом, который может повлиять на более позднем этапе формирования изображения, а также места, меньший спрос на качество рассекает щипцов. Кроме того, мы опишем простой метод, который позволяет удобно листать смонтированных образцов мозга на покровное, что очень важно для работы с изображениями с обеих сторон бдожди с аналогичной интенсивности и качества сигнала. В качестве примера протокола, мы представим анализ дофаминергических (DA) нейронов в головном мозге взрослых WT (вес 1118) мух. Высокая эффективность метода рассечение делает его особенно полезным для крупномасштабных исследований мозга взрослых на основе у дрозофилы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модель организма дрозофилы, широко известный как дрозофилы, уже давно ценится за его изящными генетических инструментов, короткие репродуктивные времена, и высоко консервативны молекулярных и клеточных путей. Плодовая муха была успешно использована для рассекают основных сигнальных путей, структурирование механизмы многоклеточных организмов, а также механизмы , лежащие в основе развития нейронов, функции и заболевания 1,2. С учетом последних достижений в области маркировки клеток и визуализации технологий, плодовая мушка мозг стал особенно мощным в тонкой отображения нейронной цепи и в рассекает молекулярной и клеточной основы высших мозговых функций, таких как обучение и память, и циркадный ритм 1,3, 4,5,6,7,8.

Одним особым преимуществом системы Drosophila является его относительно небольшой размер, что позволяет целом монтажа подготовку и обследование головного мозга с помощью обычного соединения или конфокальной микроскопии. Тхиs функция позволяет подробные анатомические и функциональный анализ нейронной цепи, или даже один нейрон, на клеточном и субклеточном уровнях, в контексте всей ткани мозга, таким образом, обеспечивая как целостный взгляд на исследуемый объект и его точную геометрию в целом головной мозг. Однако, учитывая довольно миниатюрные размеры мозга, он также представляет собой сложную техническую задачу в эффективно рассекает неповрежденный ткани мозга из защитного экзоскелет головки случае во взрослой мухи. Различные эффективные и относительно простые методы рассечение были описаны подробно, которые обычно включают тщательное и ступенчатые удаление корпуса головки и связанные с ним ткани и глаза, трахеи, и жир из мозга надлежащего 9, 10. Эти микрохирургические методы рассечение часто устанавливают достаточно жесткие требования к качеству диссекции пинцетом, опираясь на щипцов с прекрасными хорошо выровненных советов, которые могут быть легко повреждены. Более того, как рассеченные мозг часто separatред от остальной части тела, мозг может быть легко потеряны во время последующих окрашивания и моечных процессов из-за их малых размеров и их прозрачности в буфере обработки. Здесь мы описываем относительно простой и легкий в освоении, один шаг протокол рассечение для мозга взрослого человека, который держит расчлененный мозги, прикрепленные к туловищу. Процесс рассечение часто легко убирает большую часть мозга ассоциированных тканей, таких как глаз и трахеи и снижает спрос на хорошее качество рассечение щипцов.

Кроме того, при визуализации мозга под флуоресцентным микроскопом или составного конфокальный микроскоп, сторона мозга, который находится вдали от флуоресцентного источника света часто дает более слабый сигнал и менее четкие изображения из-за толщины мозга целом монтажа. Здесь мы также опишем простой способ установки, позволяющий легко листать образцов мозга, что позволяет удобно визуализации обеих сторон мозга с аналогичным сигналом Intensiти и качества.

В качестве доказательства правильности концепции для применения этого метода для изучения мозга взрослого человека, мы исследовали далее присутствие DA нейронов в мозге W 1118 мух; генотип , который часто используется в качестве родительской линии для получения трансгенных мух и контроль дикого типа во многих исследованиях Drosophila.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Решения, используемые для мозга Вскрытие и иммунофлуоресцентного окрашивания

  1. Рассеките взрослого летать мозги в искусственной спинномозговой жидкости (ACSF): 119 мМ NaCl, 26,2 мМ NaHCO 3, 2,5 мМ KCl, 1 мМ NaH 2 PO 4, 1,3 мМ MgCl 2 и 10 мМ глюкозы. Перед использованием Газ ACSF с 5% CO 2/95% O 2 в течение 10 - 15 мин и шип с 2,5 мМ CaCl 2. Стерилизацию раствора ACSF путем фильтрации через мембрану 0,22 мкм фильтр.
    Примечание: Храните ACSF при температуре 4 ° С , чтобы предотвратить бактериальное заражение. Муха мозг также может быть расчленена в растворе фосфатно-солевом буфере (PBS), хотя детальное сравнение эффектов двух рассечение решений на конечное качество формирования изображения рассеченных мозга не была выполнена.
  2. С помощью 4% параформальдегида (PFA), полученного в 1х PBS в качестве закрепляющего раствора, который, как правило, на аликвоты и хранили при -20 ° С.
    обеспечения уплатып: PFA является токсичным и коррозионными и должны быть обработаны с осторожностью.
  3. Используйте 1X PBS, чтобы промыть PFA из головного мозга и после последней стадии промывки, во время иммунофлуоресцентного окрашивания рассеченных мозга. Подготовьте 1x PBS с 10 - кратным PBS раствора (1,37 М NaCl, 27 мМ KCl, 100 мМ Na 2 HPO 4 и 18 мМ KH 2 PO 4).
  4. С помощью 0,3% Tween-20 в PBS (1x 1x PBT) для всех последующих стадий промывки во время иммунофлуоресцентного окрашивания рассеченных мозга.

2. микрохирургические Препарирование взрослых Fly Heads

Примечание: Процедура рассечение показана на рисунке 1.

  1. Обезболить взрослых мух CO 2. Использование щипцов, поднимите муху и кратко депарафинизации его кутикулу путем погружения его в 70% этаноле в течение 3 - 5 с. Это гарантирует, что никакие пузырьки не прилипают к лету кутикулы при погружении в ACSF или раствор рассечение 1X PBS.
  2. Подрассекает микроскоп с источником света под углом, который не будет заблокирован вручную, установите объектив для достижения четкое представление о лету (1.2x увеличением). Используйте пинцет с недоминирующем рукой , чтобы обездвижить животное и погружать муху в холодный раствор с рассечение брюшко вверх, как показано на рисунке 1А.
  3. Хранить щипцов при 160 - 170 ° углом по отношению к рассечение пластины, в то время как прилагая небольшое усилие на живот мухи (показано стрелками на рисунке 1a). Этот шаг будет иммобилизации летать и заставить его двигаться головы назад на 15 - 25 ° при расширении хобот вверх. В процессе, мягкой и полупрозрачной область кутикулы, под хоботка, должны стать очевидными. Увеличьте масштаб и отрегулируйте фокальную плоскость на эту область.
    Примечание: Не держите пинцет слишком плотно, а просто достаточно прочны , чтобы стабилизироватьмуха. Слишком большое усилие вызывает внутренние органы к разрыву в раствор.
  4. Используйте доминирующую руку, чтобы нажать рассекает пинцетом так, чтобы его советы закрыты, что будет генерировать мягкий силу сопротивления на кончики пинцета, так что пинцет будет весной открытым, когда давление со стороны раздаточной стороны освобождается. Расположите щипцов перпендикулярно к щипцов держащих муха, как показано на рисунке 1В.
    1. Пирс закрытые концы рассечение щипцов через мягкую и полупрозрачной области кутикулы под хоботка, как показано красной стрелкой на рисунке 1В. Важно, чтобы не проникнуть в щипцов слишком глубоко, что она затрагивает мозг. Мозг собственно должен стать видимым. Поддержание стабильного понимание лету с недоминирующем рукой.
  5. Быстро, но устойчиво, выпустите кончики рассечение щипцов своей собственной силой и опираться на импульс от этого выпуска, чтобы оторвать тон экзоскелет окружающих голову мухи. Нетронутым мозг собственно должен стать видимым (белая ткань непосредственно над кончик нижнего силы р на фиг.1C) Выполните воображаемую линию , чтобы направлять импульс высвобождаемых Forcep наконечниками (проиллюстрированных как внешнее красных стрелок , показанных на рисунке 1C). Это будет мягко удалить экзоскелет и большая часть мозга ассоциированных с глазом и трахеи из головного мозга. Правильный выбор времени и усилие, прилагаемое для открытия экзоскелет будет зависеть от опыта исследователя.
    Примечание: Это самый важный шаг во время вскрытия. Важно, чтобы полагаться на естественной силы, генерируемой импульса открытия щипцов для удаления экзоскелет, оставляя обнаженный мозг остается прикрепленной к остальной части тела.
  6. Используйте пинцет в доминирующую руку, чтобы тщательно удалить остаточные ткани аксессуары, такие как трахеи, которая появляется в виде белых волокнистых структур remainiнг прилагается к мозгу. Будьте осторожны, чтобы не тянуть или повредить мозг правильной.

3. Иммунофлуоресцентного Окрашивание Мозги

  1. Закрепить расчлененный образцы мозга и связанные с ними торс приблизительно 1 мл 4% PFA в течение 40 - 60 мин.
    Примечание: Для этого и последующих шагов, держите пробирки или пластины с образцами на nutator правильно смешивать образцы в растворе.
  2. Промыть 1 мл 1x PBS с помощью пипетки раствор вверх и вниз 3 раза. Будьте осторожны, чтобы не аспирата мозги прочь.
  3. Промыть 5 раз с помощью 1x PBT в течение 5 мин каждый. Держите образцы на nutator во время инкубации.
  4. Инкубируйте с первичными антителами, при правильном разбавления O / N при температуре 4 ° С.
  5. На следующий день, удалить первичные антитела, и мыть образцов 5 раз 1x PBT. Оставьте образцы в течение 5 - 10 мин в растворе 1x PBT между каждым мытьем. Держите образцы на nutator во время инкубации.
  6. Выдержите промытыйОбразцы в соответствующих вторичных антител с предложенным разбавлении и времени инкубации.
  7. Вымойте образцов в шесть раз с 1x PBT с 10-минутной инкубации между каждой стирки.
    Этот шаг имеет решающее значение для удаления неспецифически связанных вторичных антител из образца.
  8. Выдержите в 1: 10000 разбавлении 1 мг / мл 4 ', 6'-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в растворе 1х PBT в течение 30 мин. DAPI, представляет собой ДНК-краситель, который связывается с регионами АТ ДНК и могут быть использованы для выявления общей морфологии мозга.
  9. Промыть три раза 1x PBS.
  10. Образцы Переложить в рассечение блюдо, так и отдельные мозги от тела в рассечение блюдо с помощью щипцов.
  11. После окрашивания и стадий промывки, смонтировать мозги между двумя покровные и поместить покровные поверх монтажной ползуна. Таким образом, образцы мозга можно легко перевернуть так, чтобы обе стороны мозга могут быть отображены с аналогичной интенсивности сигнала.
    Примечание: Установка мозга на покровное вместо непосредственно на монтажной слайде позволяет листать ориентации образца свободно. Процесс монтажа поясняется более подробно ниже.
    1. Поместите 18 х 18 мм покровным поверх монтажной ползуна. Расширьте отверстие наконечника пипетки с лезвием и использовать его для передачи мозги в 1х растворе PBS на 18 х 18 мм покровным.
    2. Поместите мозги на середину покровного стекла, удалить жидкость вокруг мозга с тонкой наконечником пипетки, а затем добавить еще 20 - 40 мкл анти-выцветанию монтажной среды (0,2% (вес / объем) н-пропилгаллат в 99,5 % ACS класса глицерина) по сравнению с мозгом.
      Примечание: Количество гистологическая среда добавлен зависит от количества мозгов обследованных.
    3. Аккуратно распределите мозги при перемещении вязкой монтажной среды наружу. Поместите второй 18 х 18 мм покровным на верхней части мозга, сначала опуская слайд с одной стороны, пока он не войдет в контакт споверхность монтажной скольжением, а затем медленно опуская другую сторону, чтобы свести к минимуму контакт мозга с воздушными пузырьками.
      Примечание: Там нет необходимости использовать распорку между двумя покровные, как объем монтажной среды и мозг должен обеспечить достаточное пространство для разделения двух покровные.
    4. Разрешить слайды осесть. Удалить лишнюю жидкость, которые выходят из сторон клиньев с лабораторной ткани.
    5. Для предотвращения покровные с установленными мозги от падения монтажной слайд во время транспортировки, используйте небольшой кусочек ленты, чтобы прикрепить покровные к монтажному слайде.
      Примечание: Мозги монтируется между суппорты могут быть отображены немедленно или хранили при 4 ° С в течение до одной недели без существенной потери флуоресцентного сигнала, без необходимости использования каких - либо герметик для уплотнения слайды. Для длительного сохранения окрашенных мозга, стороны двух промахов могут быть запечатаны шIth лак для ногтей и хранить в -20 ° C морозильнике, хотя запятнанные мозг может потерять свои сигналы в течение долгого времени. Это не рекомендуется.
  12. Используйте соответствующее соединение флуоресцентного микроскопа или конфокальной микроскопии для изображения мозги.
    1. Во-первых, в него изображение со стороны головного мозга ближе к цели, а затем осторожно перевернуть покровные, чтобы иметь образцы зажатой в середине. Этот шаг способствует приобретению изображение другой стороны того же мозга.
    2. Используйте вертикальное соединение флуоресцентного микроскопа и 20X объектив к изображению весь мозг (примеры на рисунке 2) и объектив 40X к изображению меньших областей мозга, таких как DA нейронов в области кластера Парный Передней медиальной (РАМ) (примеры на рисунке 3).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 показаны основные процедуры для взрослых рассечение мозга, как описано выше , 2 и 3 представляют собой репрезентативные образы 3-дневного возраста WT. (Генотип: W 1118) для взрослых летать мозги, которые были costained с антителом против Тирозингидроксилаза (TH , окрашенные в красный цвет на рисунке 2 и белый на рисунке 3), маркер обычно используется для обозначения DA не...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С ростом интереса с помощью взрослых дрозофилы мозга для изучения заболеваний головного мозга человека, нейронной цепи, и высшие функции мозга, необходимо разработать простые и быстрые методы , чтобы получить неповрежденные летать мозги для всего-монтировки анализы, что особенно важно для крупно- масштабирование мозга на основе экранов. Наш метод обеспечивает простой и легкий в освоении подход рассекать из муху головой (часто менее чем за 10 секунд с опытом работы) с хорошо сохранившейся морфологии, которые в з...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы признаем, г-н EnEs Mehmet, г-жа Kiara Андраде, г-жа Пилар Родригес, Крис Квок, и г-жу Danna сура гафир за их огромную поддержку проекта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
w*;   парк<сап> и дельта; 21/TM3,  P{GAL4-Kr.C}DC2,  P{UAS-GFP. С65Т}DC10,  Sb1Bloomington Drosophila Stock Center51652Balancer был переключен на TM6B
PBac{WH}parkf01950Exelixis at Harvard Medical Schoolf01950Balancer был переключен на TM6C
NaClFisher ScientificS640-500
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher Scientific02-003-990
Хлорид калия (KCl)Fisher ScientificBP366-500
Фосфат натрия, моноосновной моногидрат (NaHCO3)Fisher Scientific02-004-198
Хлорид магния (MgCl2)Fisher Scientific02-003-265
D-сорбитSigma-AldrichS1876-500Gзаменяет
глюкозу Дигидрат хлорида кальция (CaCl2)Sigma-AldrichC5670-500G
EMD Millipore  Мембранные фильтры Durapore PVDF: гидрофильные: 0,22 и микро; m Размер порFisher ScientificGVWP14250
раствор формалина, 10% (гистологический)Fisher ScientificSF98-20
Фосфат калия, двухосновный, порошок, сверхчистый биореагентFisherScientific 02-003-823
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
Excelta Прецизионный пинцет с очень тонкими точкамиFisher Scientific17-456-055Протокол не требует очень тонких моментов.
Антитела к тирозингидроксилазеPel-Freez BiologicalsP40101
Rat-elav-7E8A10 анти-элавИсследования развития Гибридома Банк Клон7E8A10
Козий антикрысиный IgG (H+L) вторичное антитело, конъюгат Alexa Fluor 647ThermoFisher ScientificA-21247
Козий антикролик IgG (H+L) вторичное антитело, конъюгат Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA-11037
DAPI раствор (1 мг/мл)ThermoFisher Scientific62248
Порошок пропилгаллатаSigma-AldrichP3130-100G
Глицерин ACS реагент, ≥ 99,5%Sigma-AldrichG7893-500ML
Zeiss Axioimager Z1ZeissЦитата
Zeiss Apotome.2ZeissЦитата
Zen lite программное обеспечениеЦитата

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genetics. 199, 639-653 (2015).
  2. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163, 12-14 (2015).
  3. Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577(2014).
  4. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11, 1114-1125 (2001).
  5. Yamagata, N., et al. Distinct dopamine neurons mediate reward signals for short- and long-term memories. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 578-583 (2015).
  6. Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 2967-2976 (2015).
  7. Waddell, S. Neural Plasticity: Dopamine Tunes the Mushroom Body Output Network. Curr Biol. 26, 109-112 (2016).
  8. Wolff, T., Iyer, N. A., Rubin, G. M. Neuroarchitecture and neuroanatomy of the Drosophila central complex: A GAL4-based dissection of protocerebral bridge neurons and circuits. J Comp Neurol. 523, 997-1037 (2015).
  9. Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 1472-1474 (2011).
  10. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
  11. Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5(2009).
  12. White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205(2010).
  13. Yang, Y., et al. Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10793-10798 (2006).
  14. Greene, J. C., et al. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4078-4083 (2003).
  15. Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8024-8029 (2005).
  16. Pesah, Y., et al. Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress. Development. 131, 2183-2194 (2004).
  17. Trinh, K., et al. Decaffeinated coffee and nicotine-free tobacco provide neuroprotection in Drosophila models of Parkinson's disease through an NRF2-dependent mechanism. J Neurosci. 30, 5525-5532 (2010).
  18. Kim, K., Kim, S. H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease. J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Drosophila Brain DissectionWhole Mount PreparationAdult Fly BrainDissection ProtocolBrain Morphology PreservationImmunohistochemistry StainingDopaminergic Neuron AnalysisConfocal Microscopy ImagingParaformaldehyde FixationAnti fade Mounting Medium

Похожие статьи