Методическая статья

Дикого типа Блокирование ПЦР в сочетании с прямым секвенированием как высоко чувствительный метод обнаружения низкочастотных соматические мутации

DOI:

10.3791/55130

⸱

29 марта 2017 г.

 ,  , 
1NeoGenomics Laboratories

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Блокирующая ПЦР дикого типа с последующим прямым секвенированием предлагает высокочувствительный метод обнаружения низкочастотных соматических мутаций в различных типах образцов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Точное обнаружение и идентификация мутаций низких частот может быть проблематичным при оценке остаточной болезни после терапии, скрининг для новых мутаций устойчивости во время терапии, или когда пациенты имеют несколько циркулирующих опухолевых клеток. Дикого типа блокирования ПЦР с последующим анализом секвенирования обеспечивает высокую чувствительность, гибкость и простоту в качестве методики для обнаружения этих низкочастотных мутаций. При добавлении специально созданных заперт олигонуклеотид нуклеиновой кислоты к новому или ранее установленные обычному анализу секвенирования на основе ПЦРА, чувствительность приблизительно 1 мутантной аллели в фоне 1000 WT аллелей может быть достигнута (1: 1000). Секвенирование артефакты, связанные с дезаминирования событий обычно находятся в фиксированных формалином парафином тканей могут быть частично устранены за счет использования урацила ДНК-гликозилазы во время стадии экстракции. Оптимизированный протокол здесь специфичен для обнаружения мутации MyD88, но может служить в качестве шаблона для разработки любогоWTB-ПЦР-анализ. Преимущества анализа WTB-PCR по сравнению с другими, обычно используемыми анализами для обнаружения низких мутаций частот, включая аллели специфического ПЦР в реальное время количественный ПЦР включают в себя меньшее количестве вхождений ложных срабатываний, большую гибкость и простоту реализации, а также способность обнаруживать как известные и неизвестные мутации.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sanger секвенирования традиционно является золотым стандартом тестирования как известных, так и неизвестных соматических мутаций. Одним из ограничений Sanger секвенирования является его пределом обнаружения (~ 10 - 20% мутантная аллель в фоне WT) 1. Этот уровень чувствительности не подходит для выявления соматических мутаций низкого уровня, которые могут присутствовать в образцах из тканей предраковых или пациентов с небольшим количеством циркулирующих опухолевых клеток, или, когда костный мозг (ВМ) является неоднородным. Это также делает оценки остаточной болезни после терапии или обнаружение новых мутаций устойчивости во время терапии затруднена только 2 обычной последовательностью. Путем замены обычной ПЦР с запертой нуклеиновой кислоты (LNA) -опосредованной дикого типа блокирующий ПЦР (WTB-ПЦР) в Sanger секвенирования, чувствительность до 0,1% мутантного аллеля в фоне WT может быть достигнуто 2, 3, 4. ВWTB-ПЦР, обогащение мутантных аллелей достигается с помощью добавления короткого (~ 10 - 14 NT) блокирующего (МШУ) олигонуклеотид, который связывается преимущественно с БТ ДНК, тем самым предотвращая амплификации ДНК WT. Мутант, обогащенный продукт WTB-ПЦР может быть затем секвенировали. Блокируя WT ДНК, а не для выбора специфических мутаций WTB-ПЦР позволяет для обогащения известных и неизвестных мутаций, присутствующих в мельчайших фракциях клеток.

Различные методы в настоящее время используются для обнаружения мутаций в клетках небольших фракций. Это включает в себя аллель-специфической ПЦР-амплификации рефрактерной системы мутации (ARMS), денатурирующих высокоэффективной жидкостной хроматографии (DHPLC), шариков, эмульсий, усиления и магнетизмом (сияя), выпуск электрического поля индуцированный и измерения (EFIRM), высокое разрешение температура плавления и другие. Тем не менее, большинство из этих методов ограничены ложноположительных и способность обнаруживать только одну мутацию , что анализ был разработан для 4 . WTB-PCR, однако, позволяет пользователю визуализировать секвенирование следов, позволяет обнаружение нескольких типов мутаций и может помочь в управлении ложных срабатываний из-за артефакты или дезаминирование событий. Секвенирование следующего поколения (NGS) может предложить подходящую альтернативу традиционным секвенирования, однако, значительно большие затраты, сложность и более длительное время для анализа делают его ненужную вариант для многих типов заболеваний с небольшим количеством различных молекулярными маркерами или для мониторинга пациентов на терапии для новых мутации устойчивости. Кроме того, высокие ложные срабатывания при обнаружении варианты с мутантными аллелями частотами менее 5% может вызвать проблемы для ампликона на основе NGS 5, 6.

Здесь показано увеличение чувствительности достигается за счет WTB-ПЦР в скрининга мутаций в миелоидной дифференцировки фактор 88 гена , как описано Albitar и соавт. 3 MyD88 mutatioнс являются важными диагностическими и прогностическими факторами в макроглобулинемии Вальденстремы (WM), IgM моноклональной гаммапатии неизвестного значение (IgM-MGUS), селезеночная лимфомы маргинальной зоны (SMZL) и диффузный крупноклеточные В-клеточная лимфому (ДВККЛО). MyD88 мутации встречаются практически во всех случаях WM и приблизительно 50% пациентов с иммуноглобулином М (IgM) -secreting MGUS. И наоборот, MyD88 мутации встречаются только в 0-6% пациентов с SMZL и отсутствуют в множественной миеломой 7, 8. Из - за перекрывающие морфологические, иммунофенотипический, цитогенетические и клинические характеристики между WM и SMZL или IgM-множественной миеломой часто может осложнить дифференциальные диагнозы, наличие мутации MyD88 может служить полезным идентифицирующим фактором 9. MyD88 мутация также была связана с большим бременем болезни у пациентов с ДВККЛОМ и плохой общей выживаемостью после лечения 7, 10. Кроме того, поскольку MyD88 мутация чаще обнаруживается в активированных В-клетках, как (ABC) ДВККЛО чем зародышевый центр В-клеточный тип (БКИ) ДККВЛ или первичную лимфому медиастинальных В-клетки (ПМБЛ), статус мутации MyD88 могут служить суррогатный маркер для подтипа ABC 11, 12.

Подробный протокол, представленный здесь служит в качестве матрицы, с которой новые анализы могут быть разработаны или большинство существующего секвенирования анализов могут быть легко адаптированы для точного обнаружения низкочастотных мутаций в разных типах образцов. Подход также может быть использован для контроля и обнаружения устойчивых мутаций, которые могут возникнуть в опухолях или даже бактерий, которые могут возникнуть в то время как пациенты проходят лечение с целевой терапией или антибиотиками. Кроме того, в нем рассматривается и средства правовой защиты, многие из проблем, связанных с обогащением мутаций, особенно в формалине фиксированного парафина (FFPE) ткани.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Заявление по этике: Все испытания образцов человека было проведено после получения наблюдательного совета Institutional (IRB) одобрения.

1. экстракции ДНК из FFPE ткани, периферической крови и костного мозга Аспирируйте

  1. Для костного мозга FFPE ткани с использованием набора для экстракции ДНК FFPE
    1. Начнем с FFPE ткани из неокрашенных слайдов (5 - 10 секции на 5 - толщина мкм 10).
      Примечание: Если начало стружки ткани, использует 3 - 6 секций по 5 - 10 мкм толщины и перейти к этапу 1.1.6.
    2. Поместите слайды в слайд корзины и подготовить четыре промывки резервуаров (два для ксилола и два на 100% алкоголя). Добавить минимальный объем 600 мл раствора в каждую корзину.
    3. Deparaffinize слайдов, делая 5 мин мыть ксилол в первом лотке. Передача слайдов на второй промывной резервуар ксилола в течение еще 5 мин.
    4. После депарафинизации, мыть слайды с 100% -ным спиртом в течение 5 мин. Передача слайдов в секундуспирта резервуар для стирки в течение еще 5 мин.
    5. Разрешить слайды высохнуть полностью под капотом, прежде чем выскабливание их с лезвием бритвы в микроцентрифужной трубку.
      Примечание: Если слайд-Н & Е с областью опухоли показал, доступно, выровнять слайды и скрести только область опухоли.
    6. Действуйте с инструкциями производителя раздаточный включены в комплект.
  2. Для BM аспираты и периферической крови
    1. Извлечение согласно инструкции раздаточного изготовителя с этими характеристиками.
      Примечание: Существует многочисленные коммерчески доступные наборы и способы для выделения ДНК из тканей и клеток FFPE. Практически все они могут быть использованы. Используйте метод, который устанавливается в лаборатории.
      1. Используйте 200 мкл периферической крови (PB) или 100 мкл ВМ + 100 мкл PBS.
      2. С помощью 4 мкл РНКазы А исходного раствора.
      3. Элюции с 100 мкл буфера для элюции.
  3. Количественная ДНК
    1. Измерение концентрации ДНК с помощью спектрофотометра обеспечения / 280 нм соотношение 260 нм приблизительно 1,8 (для чистой ДНК). Если отношение заметно ниже, это может указывать на наличие белка, фенола, или других загрязняющих веществ, которые могут мешать вниз по течению приложений.
    2. Регулировка концентрации ДНК примерно 50 - 100 нг / мкл с соответствующим буфером для элюции.

2. дикого типа Блокирование ПЦР

  1. Грунтовка Design
    1. Конструкция и праймеры для получения интересующих генов в соответствии с ранее описанными общие принципы проектирования праймеров ПЦР - 13. Включить М13-прямого и обратного праймеров универсальные секвенирования в ПЦР-праймеров.
      Примечание: Анализ MyD88 был разработан для амплификации экзона 5 из MyD88 (G259 - N291) и 110 нуклеотидов расположены в 5'-интронной области, чтобы покрыть сайт сплайсинга и часть интрона 4. прямые и обратные праймеры были разработаны с 5' -M13 последовательность (М13 вперед: TGT AAA ACG ACG GCC AGT; М13-обратное: CAG GAA ACA ATG GCT соотв) , чтобы обеспечить для отжига комплементарных праймеров секвенировани (см Материалы таблицу).
  2. Закрытый нуклеиновые кислоты олигонуклеотид Design
    1. Конструкция блокирующего олигонуклеотида, чтобы быть приблизительно 10 - 15 оснований в длину и в дополнение к шаблону WT, где требуется мутант обогащение.
      Примечание: Более короткий олиго улучшит рассогласования дискриминации. Для достижения высокой целевой специфичностью, важно не использовать слишком много блокирующих нуклеотиды, так как это может привести к очень «липким» олигонуклеотида. Содержание и длина и блокирование нуклеотид должны быть оптимизировать в зависимости от конкретного нуклеотида, которые должны быть заблокированы. Важно, чтобы достичь высокой специфичности связывания без ущерба для вторичной структуры и рисковать самое-комплементарность.
    2. Конструкция блокирующего олиго иметь T M 10 - 15 ° C выше удлинительной TEMPERATЮр во время термоциклирования. Регулировка T м путем добавления или удаления блокирующих оснований или путем замены оснований для блокирования ДНК, избегая при этом длинные отрезки (3 - 4 оснований) блокирования G или C оснований.
      1. Перейдите на веб - сайт олиго инструментов (см таблицу материалов) и выберите «блокирующий Oligo Tm Предсказание» инструмент.
      2. Вставить последовательность матрицы WT, что желательно, чтобы быть заблокирован в поле «Oligo Sequence». Добавить «+» перед основаниями для обозначения блокатор оснований.
      3. Нажмите кнопку «Рассчитать» , чтобы определить приблизительное T м гибрида ДНК-блокатор.
    3. Конструкция блокирующего олий, чтобы избежать образования вторичной структуры или сами-димеры.
      1. Перейдите на веб - сайт олиго инструментов (см таблицу материалов) и выберите «блокирующий Oligo Оптимизатор» инструмент.
      2. Вставить последовательность матрицы WT, что желательно, чтобы быть заблокирован в поле, Добавить «+» перед основаниями для обозначения блокировки оснований.
      3. Выберите две коробки для «вторичной структуры» и «только на себя». Нажмите кнопку Analyze для обзора ольих для потенциально проблемных вторичных структур или самих-димеров.
        Примечание: Оценки представляют собой очень грубые оценки Т м «s вторичных структур и сами-димеров. Более низкие оценки являются оптимальными и может быть достигнуто за счет ограничения блокатор-блокатор спаривание. Блокирующий олигонуклеотид для MyD88 [MYD88blocker (TCAGA + Ag + С + С + А + С + Т + С + А + Т + CC / invdT /)] был разработан, чтобы покрыть аминокислоты Q262-I266 и особенности 3'-перевернутой дТ ингибировать как расширение с помощью ДНК-полимеразы и деградации с помощью 3'-экзонуклеазы. Это специфическое блокирование олиго является 17mer с 10 блокирующих оснований, которые обозначены как «+ N». Остальные 7 оснований являются обычными нуклеотидами ДНК.
  3. Установка WTB-ПЦР и термоциклирование
    1. Подготовьте WTB-PCR мастер-мих (ММХ) с использованием 2,5 мкл ПЦР - реакции буфера 10х Вт / 20 мМ MgCl 2, 250 мкМ дНТФ, 0,2 мкМ прямого и обратного праймера, 1,2 мкМ MYD88blocker и ДНКазы, РНКазы, сверхчистой H 2 O , чтобы создать окончательный объем раствора 21,75 мкл на реакцию.
      Примечание: Рабочие концентрации для конечного объема реакционной смеси 25 мкл (после добавления ДНК-матрицы и полимеразы). Обычный ПЦР ММХИ получают, просто опустив добавление блокатора. Все шаги протокола остаются одинаковыми для обоих WTB и обычной ПЦР. Это может быть использовано в валидации и определение обогащения достигается добавлением блокатора.
      1. При расчете количества MMX подготовить убедитесь, чтобы учесть 3 дополнительных реакций (положительных и отрицательных контролей и управления нешаблонного для проверки загрязнения) и по меньшей мере одна дополнительная реакция на ошибку пипетирования.
    2. Vortex MMX тщательно. ММХ можно хранить при температуре -80 ° С в течение до аууха.
    3. Добавить 0,25 мкл Taq ДНК-полимеразы на реакцию на MMX и инвертировать перемешать. После того, как полимеразная добавлен к MMX, держать его на льду.
    4. Поместите новый 96-луночный ПЦР планшет на холодную пластину и пипеткой 22 мкл MMX с полимеразой для каждой реакции хорошо.
    5. Добавьте 3 мкл геномной ДНК (50 - 100 нг / мкл в каждую из лунок, содержащих MMX с полимеразой.
    6. Уплотнение пластины и центрифуги кратко, чтобы обеспечить раствор достигнет нижней части каждой лунки.
    7. Загрузка пластины ПЦРА на амплификаторе.
      1. Установите условия термоциклирования для реакции WTB-ПЦР следующим образом: начальная денатурация при 95 ° С в течение 6 мин; 40 циклов денатурации при 95 ° С в течение 30 с, отжиг праймеров при 56 ° С в течение 30 секунд и удлинение при 72 ° С в течение 1 мин 20 с; Окончательное удлинение при 72 ° С в течение 10 мин.
        Примечание: Лучшая практика включает в себя завершении оставшейся части протокола в физически отдельной области, чтобы избежать загрязнения ампликона яп будущих расстановок.
  4. Выполнение гель - электрофореза в соответствии с ранее описанными протоколами 14 для того , чтобы определить , является ли WTB-ПЦР была успешной и подтвердить отсутствие амплификации в контроле без шаблона.
  5. Очистка ПЦР продукта с помощью магнитных шариков
    1. Удалить магнитные шарики от 4 ° С и довести до комнатной температуры.
    2. Передача 10 мкл ПЦР-продукта на новую пластину ПЦР.
    3. Vortex магнитных шариков энергично, чтобы полностью ресуспендировании магнитных частиц.
    4. Добавить 18 мкл магнитных гранул в каждую лунку на новой пластинкой. Пипетка смешать 10 раз.
    5. Инкубирую при комнатной температуре в течение 5 мин.
    6. Поместите пластину ПЦР на боковой пластине огибала магнита в течение 2 мин до отдельных шариков из раствора.
    7. Аспирата супернатант с помощью многоканальной пипетки, избегая шарик гранул.
    8. 150 мкл 70% этанола в каждую лунку и инкубируют при комнатной температуре Foг, по меньшей мере 30 с. Аспирируйте этанол с помощью многоканальной пипетки и отбросить советы. Повторите эту процедуру промывания еще раз.
    9. Использование 20 мкл многоканальной пипетки аспирата оставшегося этанола из каждой лунки и отбросить советы.
    10. После того, как скважины сухие (~ 10 мин), снять с магнитной пластины и добавить 40 мкл нуклеазы свободной воды в каждую лунку, и смесь пипеткой в ​​15 раз или вихрь мягко.
    11. Инкубирую при комнатной температуре в течение 2 мин.
    12. Поместите пластину ПЦР на магнитной пластине в течение 1 мин до отдельных шариков из раствора.
    13. Передача 35 мкл очищенного продукта на новую пластину ПЦР. Это очищенный продукт ПЦР теперь готов приступить к двунаправленной последовательности или могут храниться при температуре -20 ° С до тех пор, пока это необходимо.
      Примечание: При разработке нового анализа, может потребоваться определение количества очищенного продукта ПЦР. 1 - 3 нг / мкл ДНК-ампликон является оптимальным для двунаправленного секвенирования. Если концентрация стабильно низкая, увеличить продукт ПЦР и магнитные шарики proportionally (1: 1,8). Если концентрация стабильно высокая, элюирование с большим объемом воды.

3. Секвенирование WTB-PCR продукта

  1. Bi-Directional Секвенирование
    Примечание: Следующий протокол представляет собой модифицированную форму инструкции изготовителя, которые были оптимизированы для использования меньшего количества реагентов.
    1. Приготовьте вперед и обратная реакция секвенирования смешивается с 0,25 мкл Ready реакционной смеси, 1,88 мклы Sequencing буфера, 1,78 мкМ М13-F или М13-R секвенирование праймеров и добавлять и ДНКазы, РНКазы, сверхчистая H 2 O для создания окончательного решения объем 9 мкл на реакцию. Это секвенирование реакционная смесь можно хранить при температуре -20 ° С в течение до одного года.
    2. Пипетка 9 мкл реакционной смеси секвенирование вперед в каждую лунку 96-луночного новой ПЦР пластины для реакции секвенирования вперед. Повторите на отдельной пластине для обратной реакции секвенирования.
    3. Добавить 1 мкл очищенного WTB-PCR продукта Tо каждой лунке на оба прямых и обратные пластины.
    4. Уплотнение пластины и центрифуги кратко, чтобы обеспечить раствор достигнет нижней части каждой лунки.
    5. Загрузка пластины ПЦРА на амплификаторе.
      1. Установите условие термоциклирования для реакции секвенирования следующим образом: 96 ° С в течение 1 мин; 30 циклов 96 ° С в течение 10 сек, 50 ° C в течение 5 сек, 60 ° C в течение 4 мин; удерживать при 4 ° С до готовности для очистки.
  2. Очищают секвенирования продуктов
    1. Подготовьте свежий 1:25 раствор 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и 100% -ным этанолом.
    2. Подготовьте свежий 70% -ный раствор этанола.
    3. Добавьте 30 мкл ацетата натрия / 100% -ный раствор этанола в каждую лунку обоих прямого и обратного секвенирования пластин и пипеткой смеси 5 раз.
    4. Reseal пластины и инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 20 мин.
    5. Центрифуга планшет при 2250 х г в течение 15 мин.
    6. Снимите пластину герметик и инвертировать над тратойконтейнер.
      Примечание: Обратить только один раз или гранулы могут ослабнуть из скважины грунтов.
    7. Поместите перевернутую тарелку на чистое бумажное полотенце и центрифуге при 150 мкг в течение 1 мин.
    8. Добавить 150 мкл 70% этанола в каждую лунку.
    9. Reseal пластины и вращение при 2,250 мкг в течение 5 мин.
    10. Повторите шаги 3.2.6 и 3.2.7.
    11. Если скважины не являются полностью сухими, позволяют им высохнуть на воздухе при комнатной температуре. Убедитесь в том, что образцы были защищены от света во время сушки.
    12. Добавляют 10 мкл формамида в каждую лунку и пипетку смесь 10 раз. Reseal пластины.
    13. Денатурации на амплификаторе при 95 ° С в течение 3 мин с последующей 4 ° С в течение 5 мин.
    14. После денатурации, заменить пластину герметик с перегородками и последовательностью на секвенирование платформы в соответствии с инструкциями изготовителя 15.

4. Анализ результатов секвенирования

  1. Визуализируйте секвенирование следы использования секвенирования DATпрограммное обеспечение анализа в соответствии с инструкциями изготовителя 16 и выравнивают с соответствующими опорными последовательностями. Совместите MyD88 к NCBI эталонной последовательности «NM_002468».

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Концептуальный обзор WTB-PCR во время расширения представлена на рисунке 1. Поскольку один нуклеотид несоответствие в гибридном блокаторе-ДНК значительно снижает его температуру плавления (t м = 20 - 30 ° C), усиление аллель WT блокируется , а мутант матричной ДНК является свободной , чтобы завершить расширение 17. Таким образом, мутант ДНК усиливается в геометрической прогрессии, а БТ ДНК усиливается по линейному закону.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ WTB-ПЦР , описанный здесь используется общий набор праймеров с блокирующим олигонуклеотидом , предназначенным для блокирования амплификации ДНК WT при растяжении (рисунок 1). Продукт WTB-ПЦР секвенировали для мутационного анализа. Полезность WTB-PCR / Sanger заключается в его простоте, высокой чувствительности и высокой пропускной способностью. Используя принципы, описанные здесь, большинство существующих на основе Sanger анализов могут быть просто модифицированы путем добавления блокирующего оли...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет благодарностей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 или 2 мл микроцентрифужные пробирки Safe-LockEppendorf05-402-25
100% спиртVWR89370-084Гистологическая степень; 91,5% этанол, 5% изопропиловый спирт, 4,5% метиловый спирт
3730XL секвенсорABIили эквивалент
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881Для магнитных шариков ПЦР-очистка
Алюминий Герметизация фольгиGeneMateT-2451-1Для ПЦР и холодильного хранения
BigDye Terminator v3.1 Набор для секвенирования цикловLife Technologies4337455Для двунаправленного секвенирования. С 5x секвенированием Буферная
центрифуга 5804 серииEppendorfA-2-DWP (для ПЦР-планшета)
Холодная пластина для 96-луночных планшетовEppendorfZ606634
ДНКаза, РНКаза, сверхчистая вода
dNTP (100 мМ)Invitrogen10297-117
DynaMag-96 Магнит с боковой юбкойThermo Fisher Scientific12027Для использования в ПЦР-очистке.
Абсолют этанола SigmaE7023200 proof, для молекулярной биологии
Exiqon веб-сайт Oligo Toolswww.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µ L)Roche12032937001с 10x концентрированным буфером для ПЦР-реакции, с 20 мМ MgCl2
Gel аппарат2% агарозный гель
GeneRead DNA FFPE Extraction Kit Qiagen180134Содержит урацил ДНК гликозилазу, необходимую для уменьшения артефактов секвенирования
Hi-Di FormamideABI4311320Для секвенирования.
Олигонуклеотид ЛШУExiqon5001005'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+CC/invdT/ (+N = основания LNA)
M13-F Праймер для секвенированияABI5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R Праймер для секвенированияABI5'-cag gaa aca gct atg
acc Mastercycler Pro S ThermocyclerEppendorfE950030020
Микроцентрифуга Модель 5430Ротор EppendorfFA-45-30-11 (для микроцентрифужных пробирок объемом 1,5/2 мл)
Спектрофотометр NanoDrop 2000 ThermoFisher Scientific
PCR прямой праймерIDT5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR обратный праймерIDT5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR планшетыGeneMateТ-3107-1
Пипетки20, 200, 1 000 и микро; L
Plate septa, 96 лунокABI4315933
QIAamp DNA Mini KitQiagen51304Для аспирата КМ и периферической крови
SeqScape Sortware v3.0ABI4474978Для анализа секвенирования
Корзина
Ацетат натрия (3 М, pH 5,2)SigmaS7899
Стерильные фильтрованные наконечники20, 200, 1 000 и микро;
L Термомиксер C Eppendorf5382000023
Vortex genieScientific IndustriesSI-0236
Промывочный резервуар1,000 мл
ксилолаVWR89370-088Гистологическая степень
без фазы для электрофореза слайдов для пипеток ~

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  2. Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
  3. Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid. Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).
  4. Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).
  5. Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection. Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).
  6. Smith, E. N., et al. Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments. Genome Biol. 15 (8), 420(2014).
  7. Varettoni, M., et al. Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström's macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms. Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).
  8. Xu, L., et al. MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction. Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).
  9. Gertz, M. A. Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management. Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).
  10. Salar, A., et al. MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL). Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).
  11. Ngo, V. N., et al. Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).
  12. Pasqualucci, L., et al. Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma. Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).
  13. Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923(2012).
  15. Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).
  16. Applied Biosystems. User Guide for SeqScape Software 3. , (2012).
  17. Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).
  18. Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR. BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).
  19. Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens. Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).
  20. Solassol, J., et al. KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues. Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).
  21. Yost, S. E., et al. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).
  22. Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).
  23. Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA. J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).
  24. Mancini, M., et al. Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).
  25. Parsons, B. L., Heflich, R. H. Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations. Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).
  26. Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification. BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).
  27. Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA. Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).
  28. Albitar, A., et al. High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients. Blood. 126 (23), 716(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MYD88

Похожие статьи