Метод визуализации и анализа Мембранные белков, взаимодействующих с помощью просвечивающей электронной микроскопии

Summary

Многие белки выполняют свою функцию, когда прикрепляются к мембранным поверхностям. Связывание внешних белков на мембранах нанодисков может быть косвенно визуализировано с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Показано, что характерное укладывание нанодисков, вызванное отрицательным окрашиванием фосфовольфраматом натрия, предотвращается связыванием внешнего белка.

Abstract

Монотопные белки выполняют свою функцию, когда прикрепляются к поверхности мембраны, и такие взаимодействия зависят от конкретного липидного состава и от наличия достаточной площади для выполнения функции. Нанодиски используются для создания мембранной поверхности с контролируемым размером и содержанием липидов. В отсутствие связанных внешних белков нанодиски, окрашенные фосфовольфраматом натрия, выглядят как стопки монет при взгляде сбоку с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Таким образом, этот протокол разработан для намеренного продвижения стекирования; Следовательно, предотвращение накопления может быть интерпретировано как связывание мембрансвязывающего белка с нанодиском. На следующем этапе ПЭМ-изображения комплексов белок-нанодиски могут быть обработаны с помощью стандартных методов с использованием одиночных частиц для получения структур с низким разрешением в качестве основы для работы с криоЭМ с более высоким разрешением. Кроме того, нанодиски содержат образцы, пригодные как для ПЭМ, так и для электрофореза без денатурирующего геля. Для иллюстрации метода представлено^Ca2+-индуцированное связывание 5-липоксигеназы на нанодисках.

Introduction

В медицинских исследованиях большое внимание уделяется мембранным белкам, как внутренним, так и внешним, участвующим в различных липидных взаимодействиях. Работа с белками, взаимодействующими с липидами, включает в себя либо выбор заменителя липидов, например, моющие средства, amphipols¹, или небольшие белки², либо поиск заменителя мембраны, который сохраняет белок растворимым и активным. Заменители липоевых мембран включают липосомы и нанодиски (ND)^3,4.

Нанодиски - это почти нативные мембранные платформы, разработанные путем инженер....

Protocol

1. Подготовка нанодисков

1. Экспрессия и очистка мембранного каркасного белка^8,35
   1. Экспрессируйте меченый His-меченный MSP1E3D1 в штамме E. coli BL21 (DE3) T1R pRARE2 в колбах. Приготовьте 50 мл ночной закваски с LB-средой с добавлением 50 мкг/мл канамицина при 37 °C. Разведите ночную закваску в 2 л потрясающей бульонной среды с добавлением 50 мкг/мл канамицина.
   2. Выращивайте клетки при 37 °C до тех пор, пока оптическая плотность на длине волны 600 нм (наружный диаметр₆₀₀) не достигнет примерно 3. Индуцировать экспрессию белка 0,5 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопи....

Results

Метод, который мы предлагаем, зависит от подготовки нанодисков для обеспечения мембранной поверхности для монотопного связывания мембраны и белка. Поскольку в липидный бислой нанодиска не встроен трансмембранный белок, нанодиски здесь обозначаются как «пустые нанодиски» (рис. 2A). Они имеют расчетную молекулярную массу 256 кДа для композиции из двух белков MSP1E3D1 скаффолдинга и около 260 молекул класса POPC⁸. Используя это соотношение белок:липиды для восстан.......

Discussion

Метод можно разделить на три части: восстановление пустых нанодисков, получение комплексов белок-нанодиск и отрицательное окрашивание на ПЭМ этих комплексов. Каждая часть будет рассмотрена отдельно в отношении ограничений метода, критических шагов и полезных модификаций.

Восстановление пустых нанодисков. Критические шаги и ограничения в производстве и использовании нанодисков.

Для получения пустых нанодисков важно оптимизировать соотношение MSP и липидов. Для наиболее .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Просвечивающий электронный микроскоп: JEOL2100F	JEOL
CCD камера	Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Германия
Разрядник накаливания	Baltec
TEM сетка: 400 меш	TAAB	GM016/C
Эксклюзионная хроматография: Agilent SEC-5	Agilent Technologies	5190-2526
Superdex 200 HR 10/300	GE Здравоохранение Медико-биологические науки	17-5172-01
Плазмида: MSP1E3D1	Addgene	20066
Бактерии: BL21DE3	NEB	C2527H
Бактерии: BL21 (DE3) T1R pRARE2	Protein Science Facility, KI, Solna
Матрица очистки: ATP agarose	Sigma Aldrich	A2767
Матрица очистки: HisTrap HP-5 мл	GE Здравоохранение Медико-биологические науки	17-5247-01
Липиды: POPC	Avanti полярные липиды	850457C	25 мг/мл в хлороформе
Гидрофобные гранулы: Bio-Beads, SM-2 Смола	Bio-Rad	1523920
13 мм шприц фильтр: 0,2 μ m	Pall life sciences	PN 4554T
Краситель: Фосфовольфрамат натрия трехосновной гидрат	Sigma Aldrich	31648
2-меркаптоэтанол	Sigma Aldrich	M3148-250ML
Додецилсульфат натрия (SDS)	Bio-Rad	161-0301
Коктейль ингибиторов протеазы	Sigma Aldrich	4693132001
TCEP	Sigma Aldrich	646547
Моющее средство: Гидрат холата натрия	Sigma Aldrich	C6445-10G
Холат			500 мМ Холат натрия. Повторно суспендируйте в воде miliQ и храните при температуре -20 °C.
Липидный запас			50 мМ POPC, 100 мМ холат натрия, 20 мМ Tris-HCl pH 7,5, 100 мМ NaCl. Хранить при 4 ° C на неделю; или<бр/> Магазин -80 ° С в течение месяца, предварительно продув раствор азотом.
Стандартный буфер			20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 mM EDTA. Хранить при 4°C.
Анодный буфер для неденатурирующего электрофореза	Thermo Fisher Scientific	BN2001	50 мМ бис-трис, 50 мМ трицин, pH 6,8
Неденатурирующий катодный буфер для электрофореза	Thermo Fisher Scientific	BN2002	50 мМ бис-трис, 50 мМ трицин, pH 6,8, 0,002% Coomassie G-250
Неденатурирующий электрофорез 4x Буфер для загрузки образцов	Thermo Fisher Scientific	BN2003	50 мМ Bis-Tris, pH 7,2, 6 Н HCl, 50 мМ NaCl, 10% (масс./об.) глицерина, 0.001% Ponceau S
Денатурирующий электрофорез Беговой буфер			Собственный рецепт: 25 мМ Tris-HCl, pH 6,8, 200 мМ глицин, 0,1% (w/v)
SDS Денатурирующий электрофорез 5x Буфер			Собственный рецепт: 0,05% (w/v) бромфенолсин, 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% (v/v) глицерин, 10% (w/v) SDS, 10 мМ 2-меркаптоэтанол
Потрясающий бульон			Триптон - 12,0 г, Экстракт дрожжей - 24,0 г, 100 мл 0,17 М KH<суб>2PO<суб>4 и 0,72 М K<суб>2HPO<суб>4, Глицерин - 4 мл. Триптон, дрожжевой экстракт и глицерин получали до 900 мл и автоклавировали отдельно. KH2PO4 и K2HPO4 были приготовлены и автоклавированы отдельно. И то, и другое было смешано перед использованием среды.