Method Article

Метод визуализации и анализа Мембранные белков, взаимодействующих с помощью просвечивающей электронной микроскопии

DOI:

10.3791/55148

⸱

March 5th, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biosciences and Nutrition, Karolinska Institutet, 2School of Technology and Health, KTH Royal Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многие белки выполняют свою функцию, когда прикрепляются к мембранным поверхностям. Связывание внешних белков на мембранах нанодисков может быть косвенно визуализировано с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Показано, что характерное укладывание нанодисков, вызванное отрицательным окрашиванием фосфовольфраматом натрия, предотвращается связыванием внешнего белка.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Монотопные белки выполняют свою функцию, когда прикрепляются к поверхности мембраны, и такие взаимодействия зависят от конкретного липидного состава и от наличия достаточной площади для выполнения функции. Нанодиски используются для создания мембранной поверхности с контролируемым размером и содержанием липидов. В отсутствие связанных внешних белков нанодиски, окрашенные фосфовольфраматом натрия, выглядят как стопки монет при взгляде сбоку с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Таким образом, этот протокол разработан для намеренного продвижения стекирования; Следовательно, предотвращение накопления может быть интерпретировано как связывание мембрансвязывающего белка с нанодиском. На следующем этапе ПЭМ-изображения комплексов белок-нанодиски могут быть обработаны с помощью стандартных методов с использованием одиночных частиц для получения структур с низким разрешением в качестве основы для работы с криоЭМ с более высоким разрешением. Кроме того, нанодиски содержат образцы, пригодные как для ПЭМ, так и для электрофореза без денатурирующего геля. Для иллюстрации метода представленоCa2+-индуцированное связывание 5-липоксигеназы на нанодисках.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В медицинских исследованиях большое внимание уделяется мембранным белкам, как внутренним, так и внешним, участвующим в различных липидных взаимодействиях. Работа с белками, взаимодействующими с липидами, включает в себя либо выбор заменителя липидов, например, моющие средства, amphipols1, или небольшие белки2, либо поиск заменителя мембраны, который сохраняет белок растворимым и активным. Заменители липоевых мембран включают липосомы и нанодиски (ND)3,4.

Нанодиски - это почти нативные мембранные платформы, разработанные путем инженерии белковой части, ApoA-1, липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), встречающихся в крови естественным образом. ApoA-1 представляет собой цепь коротких амфипатических α-спиралей длиной 243 остатка и имеет нерастворимую конформацию без липидов. In vitro, когда в присутствии липидов две копии белка ApoA-1 спонтанно перестраиваются, чтобы окружить гидрофобную ацильную цепь липидного бислойного патча5. Сконструированные версии ApoA-1 обычно называются мембранными каркасными белками (MSP), и все большее их количество коммерчески доступно в виде плазмид или очищенных белков. Повторения или удаления α-спиралей в ApoA-1 приводят к образованию белков мембранного каркаса longer6 или shorter7. Это, в свою очередь, позволяет формировать диски диаметром от 6 нм7 до 17 нм8. Существуют различные типы применения нанодисков3,9. Наиболее часто используемым применением является обеспечение почти нативной мембранной среды для стабилизации интегрального мембранного белка8, рассмотренный ранее3,9. Менее изученное использование - это создание наноразмерной мембранной поверхности для изучения белков периферических мембран10,11,12,13,14,15,16,17. В разделе 1 приведенного ниже протокола визуализирована процедура создания нанодисков, состоящих из фосфолипидов и мембранного каркасного белка.

Подготовка образцов является узким местом в большинстве методов. Выборки, специфичные для конкретного метода, могут добавить определенную информацию, но они также затрудняют сравнение результатов. Поэтому проще, когда образцы являются мультимодальными и могут использоваться непосредственно в нескольких различных методах. Одним из преимуществ использования нанодисков является небольшой размер нанодиска по сравнению с липосомами (например, образцы могут быть непосредственно использованы как для ПЭМ, так и для неденатурирующего гелевого электрофореза, как в настоящем протоколе).

Везикулы и липосомы уже давно используются для понимания функции белков, взаимодействующих с мембранами. Для структурных исследований и визуализации доступен пример структурной детерминации трансмембранного белка в липосомах18. Однако, насколько нам известно, 3D-структура монотопного мембранного белка с высоким разрешением, встроенного в мембрану липосомы, до сих пор не опубликована. Наночастицы золота или антитела могут быть использованы для визуализации связывания белков с липосомами или везикулами с помощью TEM19. Несмотря на то, что эти зонды очень специфичны, они могут взаимодействовать с мембрансвязывающими белками, завуалируя сайт связывания мембраны или маскируя области интереса гибкими частями. Белки, меченные золотом, или комплексы антител, вероятно, можно было бы проанализировать на геле, но это увеличило бы стоимость эксперимента.

Хотя липосомы являются отличной платформой, нельзя быть уверенным, что популяция имеет определенное соотношение белка на липосому, особенность, которую можно исследовать с помощью нанодисков20. В липосоме кофакторы и субстраты могут быть захвачены в растворимой внутренней части. Вещества, которые являются мембранорастворимыми, разделят одну и ту же судьбу для обоих типов мембранных миметиков. Тем не менее, поскольку площадь бислоя в нанодисках меньше, для насыщения мембран нанодисков требуется меньшее количество вещества.

Понимание функции белка через определение атомной структуры было важно для многих областей исследований. Методы определения структуры белка включают X-ray21; ядерный магнитный резонанс (ЯМР)22,23; и просвечивающая электронная микроскопия (TEM)24 при криогенных температурах, cryoEM. Разрешение cryoEM в последнее время значительно улучшилось, в основном благодаря использованию детекторов прямых электронов25,26. Макромолекулы изображены в тонком стекловидном виде ice27 в состоянии, близком к нативному. Однако из-за низкой контрастности биологических молекул их становится трудно обнаружить в диапазоне размеров 100 - 200 кДа. Для образцов подходящего размера можно провести сбор данных и применить метод реконструкции одной частицы для получения structure28.

Однако определение структуры белка с помощью TEM является многоступенчатым процессом. Обычно это начинается с оценки монодисперсности образца с помощью отрицательного окрашивания TEM29 с использованием солей тяжелых металлов, таких как фосфовольфрам (PT)30 или uranium31. Обычно выполняется реконструкция модели отрицательно окрашенной макромолекулы с низким разрешением, которая может дать важную информацию о молекулярной структуре29. Параллельно может начаться сбор данных с помощью cryoEM. Следует проявлять осторожность при оценке данных ПЭМ с отрицательным окрашиванием, чтобы избежать неправильной интерпретации образования артефактов. Одним из конкретных артефактов является воздействие пятна PT на фосфолипиды и липосомы32, что приводит к образованию длинных стержней, напоминающих стопки монет, если смотреть сбоку33. Такие "rouleau" или "stacks" (далее обозначаемые как "stacks") наблюдались на раннем этапе для HDL34, а позже также для nanodiscs35.

Укладка и изменение формы мембран может происходить по многим причинам. Например, он может быть индуцирован кофакторами, такими как медь, как показано с помощью ПЭМ-визуализации в красилке на основе молибдата аммония36. Часть мембранных липидов в липосомах содержала головную группу иминодиуксусной кислоты, имитирующую комплексообразование металлов по ЭДТА, таким образом складывая липосомы после добавления ионов меди36. Укладка также может быть вызвана белок-белковым взаимодействием белка в липидных бислоях или на них (используемое окрашивание не упоминается)37. Образование стека фосфолипидов с помощью ПТ наблюдалось на ранней стадии; Тем не менее, более поздняя работа была сосредоточена на удалении или отмене этого артефакта Formation38.

Здесь мы предлагаем метод, позволяющий использовать преимущества NaPT-индуцированного стекирования нанодисков для изучения мембран-связывающих белков с помощью TEM. Короче говоря, связывание белков на нанодисках предотвратило бы их накопление. Хотя причины наложения не ясны, было предложено39, что существует электростатическое взаимодействие между фосфолипидами и фосфорильной группой PT, заставляющее диски прилипать друг к другу (Рисунок 1A). Гипотеза, лежащая в основе нашего протокола, заключается в том, что когда белок связывается с нанодиском, большая часть поверхности фосфолипидов недоступна для взаимодействия с PT из-за стерического препятствия со стороны белка. Это предотвратит образование стека (Рисунок 1B). Можно сделать два вывода. Во-первых, предотвращение накопления означает, что интересующий белок связался с мембраной. Во-вторых, комплекс белок-ND может быть обработан стандартными методами обработки одиночных частиц24,40, чтобы получить приблизительную морфологию комплекса. Кроме того, можно проводить анализ с помощью таких методов, как электрофорез с неденатурирующим гелем или динамическое рассеяние света.

Чтобы продемонстрировать эту гипотезу, мы использовали мембрансвязывающий белок 5-липоксигеназа (5LO), который участвует во многих воспалительных заболеваниях41,42. Этот белок с молекулярной массой 78 кДа требует ионов кальция для связывания с его мембраной43. Несмотря на то, что эта мембранная ассоциация была тщательно изучена с использованием липосом44,45,46 и мембранных фракций47, они не могут быть использованы для анализа ПЭМ и определения структуры.

Подготовка нанодисков начинается с смешивания MSP с липидами, ресуспендированными в моющем средстве холат натрия. После инкубации на льду в течение 1 ч моющее средство медленно удаляют из восстановительной смеси с помощью адсорбирующей смолы. Этот вид материала часто изготавливается из полистирола в форме небольших бусин. Они относительно гидрофобны и имеют сильное предпочтение связывающего моющего средства по сравнению с lipids48. После удаления гидрофобных шариков и проведения осветления с помощью центрифугирования нанодиски очищают с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC). Очищенные нанодиски смешивают с монотопным мембранным белком (и возможными кофакторами) в эквимолярном соотношении (или нескольких соотношениях для титрования) и оставляют реагировать (15 мин). Анализ методом ПЭМ проводится путем нанесения μL-количества образца на тлеющие сетки с углеродным покрытием и последующим выполнением отрицательного окрашивания NaPT. Один и тот же образец, полученный при нанесении аликвот на сетки ПЭМ, может быть использован для анализа методом неденатурирующего или гель-электрофорезом SDS PAGE, а также с помощью различных видов измерений активности, без существенных изменений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка нанодисков

  1. Экспрессия и очистка мембранного каркасного белка8,35
    1. Экспрессируйте меченый His-меченный MSP1E3D1 в штамме E. coli BL21 (DE3) T1R pRARE2 в колбах. Приготовьте 50 мл ночной закваски с LB-средой с добавлением 50 мкг/мл канамицина при 37 °C. Разведите ночную закваску в 2 л потрясающей бульонной среды с добавлением 50 мкг/мл канамицина.
    2. Выращивайте клетки при 37 °C до тех пор, пока оптическая плотность на длине волны 600 нм (наружный диаметр600) не достигнет примерно 3. Индуцировать экспрессию белка 0,5 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранизида (ИПТГ) в течение 3 ч при 18 °С.
    3. Приготовьте буфер для лизиса (100 мМ Tris-HCl, pH 8,0; 100 мМ NaCl; и 10% глицерина). Добавьте 1 мМ TCEP непосредственно перед использованием.
    4. После 3 ч индукции при 18 °C соберите клетки центрифугированием в течение 10 мин при 4500 x g и 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, взвесьте собранные клетки и повторно суспендируйте их в буфере для лизиса в соотношении 2 мл буфера для лизиса на г клеток.
    5. Лизируйте клетки с помощью импульсной ультразвука (частота повторения: 4 с ВКЛ, 4 с ВЫКЛ) в течение 3 мин с амплитудой 80%.
    6. Центрифугируйте лизаты в течение 20 минут при 49 000 x g и 4 °C. Выбросьте гранулу из этого центрифугирования.
    7. Вводите надосадочную жидкость в хелатирующую колонку Ni+ объемом 5 мл, подключенную к автоматизированной системе жидкостной хроматографии, предпочтительно при температуре 4 °C.
    8. Перед этапом элюирования (шаг 1.1.9) промойте колонку с буферами 1 - 3 ниже, чтобы удалить все белки, кроме MSP, помеченного His. Следите за содержанием белка при 280 нм, чтобы следить за процессом очистки; запись УФ-излучения на длине волны 280 нм должна возвращаться к исходному уровню после каждой промывки.
      1. Промывка с промывочным буфером 1: 40 мМ Tris-HCl, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола и 1% Triton, pH 8,0.
      2. Промывка с промывочным буфером 2: 40 мМ Tris-HCl, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазола и 50 мМ холата натрия, pH 8,0.
      3. Промывка с промывочным буфером 3: 40 мМ Tris-HCl, 300 мМ NaCl и 50 мМ имидазол, pH 8,0.
    9. Разбавьте MSP 40 мМ Tris-HCl, 300 мМ NaCl и 500 мМ имидазола, pH 8,0.
    10. Замените буфер на стандартный буфер MSP (20 мМ Tris-HCl, pH 7,5; 100 мМ NaCl; и 0,5 мМ ЭДТА) с помощью гель-фильтрации8,35; выход на партию должен составлять около 7 мг л-1.
  2. Приготовление фосфолипидного стокового раствора
    1. Добавьте 305 мкл 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (POPC), растворенного в хлороформе в концентрации 25 мг/мл, в стеклянный стакан и выпарите хлороформ, продув его слабой струей азота. Высушите липид в течение ночи в вакуумном эксикаторе. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется для удаления растворителя из липида, который оставляет тонкую пленку липидов на дне стеклянного стакана.
    2. Ресуспендируйте липидный пирог в 200 мкл стандартного буфера MSP, содержащего 100 мМ холата натрия, путем вортексирования трубки до тех пор, пока раствор не станет прозрачным; это даст раствор с концентрацией POPC 50 мМ.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, молярное соотношение липидов и моющих средств на этом этапе должно быть 1:2 (липид:моющее средство)8. Эта липидно-моющая смесь может храниться при температуре -80 °C почти 2 месяца.
  3. Приготовление гидрофобных шариков для удаления моющего средства
    1. Поместите 5 г шариков (сухого веса) в пробирку объемом 50 мл.
    2. Промойте шарики 30 мл 100% метанола, а затем 40 мл сверхчистой воды.
    3. Промойте шарики 10 мл стандартного буфера MSP. Наконец, храните шарики с 15 мл стандартного буфера MSP при температуре 4 °C.
  4. Восстановление нанодисков
    1. Диспонируйте 190 мкл MSP1E3D1 (0,124 мМ) в микрофуге-пробирку и добавьте 61,5 мкл фосфолипидного стокового раствора (50 мМ POPC) в ту же пробирку. Инкубируйте смесь для восстановления на влажном льду в течение 1 ч. ПРИМЕЧАНИЕ: Это соответствует молярному соотношению 1:130 (MSP1E3D1: POPC).
    2. Добавьте гидрофобные шарики в концентрации 0,5 г гранул на мл смеси для восстановления, чтобы запустить процесс самосборки. Инкубировать в ротационном инкубаторе в течение 16 ч при температуре 4 °C.
    3. После инкубации центрифугируйте в течение 10 минут при 13 000 x g и 4 °C для удаления осадков и заполнителей. Выбросьте гранулу и сохраните надосадочную жидкость.
    4. Уравновесьте колонку эксклюзионной хроматографии (установленную на автоматизированной системе жидкостной хроматографии) со стандартным буфером MSP до тех пор, пока абсорбция на длине волны 280 нм не станет стабильной. Введите надосадочную жидкость в колонку и соберите пиковые фракции.
    5. Измерьте концентрации нанодисков в пиковых фракциях при длине волны 280 нм. Для расчета концентрации нанодиска используйте молярный коэффициент экстинкции MSP1E3D1 (ε = 29,910 см-1 М-1). ПРИМЕЧАНИЕ: Количество липидов на нанодиске может быть измерено с помощью комбинации радиоактивно меченых липидов и фосфатного анализа4 или только с помощью фосфатного анализа.

2. Получение монотопного белка 5-липоксигеназы35

  1. Подготовьте закваску на ночь. Добавьте 50 мл среды LB со 100 мкг/мл ампициллина. Инокулируйте среду E. coli BL21 (DE3), содержащей плазмиду гена 5-липоксигеназы (ALOX5). Развести закваску на ночь в среде для экспрессии, содержащей 42 мМ Na2HPO4, 24 мМ KH2PO4, 9 мМ NaCl, 19 мМ NH4Cl, 1 мМ MgSO4, 0,1 мМ CaCl2, 0,2% D-глюкозы, 0,1%, 5 мкМ FeSO4 и 100 мкг/мл ампициллина. Выращивайте клетки до тех пор, пока OD600 не составит ~ 0,5 при 25 °C. Индуцируйте экспрессию белка с помощью 0,2 мМ IPTG в течение 16 часов при 20 °C35.
  2. Соберите урожай центрифугированием в течение 10 минут при 7 000 x g и 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Взвесьте гранулы, найденные на дне пробирки, содержащей собранные клетки, и повторно суспендируйте собранные клетки в буфере для лизиса (100 мМ Tris-HCl, pH 8,0; 100 мМ NaCl; 10% глицерина; и 1 мМ TCEP), содержащем ингибитор протеазы и 0,5 мг/мл35 лизоцима в соотношении 2 мл буфера для лизиса на г клеток.
  3. Лизируйте клетки с помощью ультразвука в течение 5 x 15 с с амплитудой 80%. Удалите клеточный мусор центрифугированием в течение 10 минут при температуре 7 000 x g и 4 °C. Выполните осаждение сульфата аммония до 30 - 60% насыщения, чтобы осаждать белки в растворе класса 35. Центрифуга в течение 15 минут при 16 000 x g и 4 °C. ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы 5LO можно быстро заморозить и хранить при температуре -80 °C до 6 месяцев.
  4. Повторно суспендируйте гранулу с 20 мл лизисного буфера и центрифугой в течение 15 минут при 40 000 x g и 4 °C.
  5. Инкубировать надосадочную жидкость на агарозной колонке АТФ при температуре 4 °С в течение 30 мин. Однократно промыть колонку одним объемом колонки буфером для лизиса, содержащим 0,5 М NaCl. Разбавьте 5LO 20 мМ АТФ в буфере для лизиса, содержащем 10 мкМ FeSO4 и 20 мкг/мл каталазы. Проведите гель-фильтрационную хроматографию для удаления класса ATP35.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 5LO нестабилен и его следует использовать сразу после очистки. В противном случае рекомендуется остановиться на этапе выпадения сульфата аммония (см. примечание после шага 2.1.3).

3. Приготовление нанодиска-белкового комплекса

  1. Приготовьте общий объем 100 мкл комплекса. Смешайте 0,8 мкМ ND и 0,8 μM 5LO с 1 мМ Ca2+, присутствующим в стандартном буфере MSP (20 мМ Tris-HCl, pH 7,5; 100 мМ NaCl; 0,5 мМ ЭДТА; и 1,5 мМ CaCl2) и инкубируйте в течение 10 минут на льду. ПРИМЕЧАНИЕ: Образец может храниться до одного месяца при 4 °C35.

4. Анализ образцов

  1. Гель-электрофорез
    1. Неденатурирующий электрофорез
      1. Смешайте 15 мкл образца с 5 мкл загрузочного буфера (50 мМ BisTris, 6 N HCl, 50 мМ NaCl, 10% (w/v) глицерина и 0,001% Ponceau S, pH 7,2)49 и загрузите его в 4–16% гель Bis-Tris для проведения электрофореза.
      2. Наполните бак катода легким катодным буфером (50 мМ Bis Tris; 50 мМ трицин, pH 6,8; и 0,002% Coomassie G-250) и анодный бак с рабочим буфером (50 мМ Bis Tris и 50 мМ трицин, pH 6,8). Начните разделение с помощью постоянного напряжения на 150 В.
      3. Остановите электрофоретическое разделение, когда фронт Кумасси достигнет конца геля.
      4. Окрашивайте гель стандартным протоколом Coomassie blue.
    2. Денатурирующий электрофорез
      1. Смешайте 40 мкл образца с 10 мкл загрузочного буфера, содержащего SDS (0,05% (w/v) бромфенолового синего; 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8; 20% (v/v) глицерина; 10% (w/v) SDS; и 10 mM 2-меркаптоэтанола) и загрузите его в 4-20% гель Tris glycine для проведения электрофореза.
      2. Заполните баки катода и анода проточным буфером (25 мМ Tris-HCl, pH 6,8; 200 mM глицина; и 0,1% (w/v) SDS). Начните разделение с помощью постоянного напряжения на 150 В.
      3. Остановите электрофоретическое разделение, когда фронт загрузки красителя достигнет конца геля.
      4. Окрашивайте гель стандартным протоколом Coomassie blue.
  2. Приготовление раствора NaPT
    1. Растворите 1 г натриевой соли фосфовольфраграта в 50 мл воды, перемешивая при комнатной температуре, до получения 2% кислотного раствора.
    2. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью 1 М NaOH. Удалите частицы с помощью шприцевого фильтра толщиной 0,22 мкм. Хранить раствор при комнатной температуре или при температуре 4 °C.
  3. Подготовка образца для анализа ПЭМ
    1. Медные сетки с углеродным покрытием и тлеющими разрядами (400 меш) в течение 20 с при 30 мА для придания сетке гидрофильности перед адсорбцией образца. Поместите 3,5 мкл образца (0,8 мкМ по отношению к нанодискам) на сетку и инкубируйте в течение 30 с. ПРИМЕЧАНИЕ: Объем может варьироваться от 2,5 до 5 мкл, в зависимости от концентрации образца. Подходящий диапазон концентраций для нанодисков составляет 0,5 - 1 мкМ.
    2. Промокните излишки раствора с помощью фильтровальной бумаги.
    3. Немедленно испачкайте сетку каплей 2% NaPT в течение 30 с. Промокните излишки раствора и оставьте сетку сохнуть на воздухе.
    4. Оценка сеток по ПЭМ. Для оценки степени суммирования достаточно микроскопа с ускоряющим напряжением 120-200 кэВ. Примечание: Для настоящего протокола использовался калиброванный просвечивающий электронный микроскоп, оснащенный полевой эмиссионной пушкой с энергией 200 кэВ.
    5. Запишите изображения ПЭМ. Для изображений, показывающих длинные стопки, не обрабатывайте дальше; Изображения показывают комплекс нанодисков с внешним белком, который может содержать несколько коротких стеков, но большинство частиц находятся в комплексе. Запишите несколько изображений и обработайте их в соответствии со стандартными методами, чтобы получить средние по классам и трехмерную модель комплекса с низким разрешением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора данных об отрицательных пятнах сетки были сделаны по крайней мере в три разных дня. Для каждого дня проводилась инкубация свежих образцов (как в шаге 3.1) перед нанесением отрицательного окрашивания.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод, который мы предлагаем, зависит от подготовки нанодисков для обеспечения мембранной поверхности для монотопного связывания мембраны и белка. Поскольку в липидный бислой нанодиска не встроен трансмембранный белок, нанодиски здесь обозначаются как «пустые нанодиски» (рис. 2A). Они имеют расчетную молекулярную массу 256 кДа для композиции из двух белков MSP1E3D1 скаффолдинга и около 260 молекул класса POPC8. Используя это соотношение белок:липиды для восстан...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод можно разделить на три части: восстановление пустых нанодисков, получение комплексов белок-нанодиск и отрицательное окрашивание на ПЭМ этих комплексов. Каждая часть будет рассмотрена отдельно в отношении ограничений метода, критических шагов и полезных модификаций.

Восстановление пустых нанодисков. Критические шаги и ограничения в производстве и использовании нанодисков.

Для получения пустых нанодисков важно оптимизировать соотношение MSP и липидов. Для наиболее ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Шведский исследовательский совет, Стокгольмский окружной совет и фонды KI за их поддержку. Экспрессия и очистка MSP проводилась в Каролинском институте/SciLifeLab Protein Science Core Facility (http://PSF.ki.se). Авторы также хотели бы поблагодарить д-ра Паси Пурхонена и д-ра Матильду Шёберг за обмен техническим опытом и своевременную помощь.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Просвечивающий электронный микроскоп: JEOL2100FJEOL
CCD камераTiez Video and Imaging Processing System GmbH, Германия
Разрядник накаливанияBaltec
TEM сетка: 400 мешTAABGM016/C
Эксклюзионная хроматография: Agilent SEC-5Agilent Technologies5190-2526
Superdex 200 HR 10/300GE Здравоохранение Медико-биологические науки17-5172-01
Плазмида: MSP1E3D1Addgene20066
Бактерии: BL21DE3NEBC2527H
Бактерии: BL21 (DE3) T1R pRARE2Protein Science Facility, KI, Solna
Матрица очистки: ATP agaroseSigma AldrichA2767
Матрица очистки: HisTrap HP-5 млGE Здравоохранение Медико-биологические науки17-5247-01
Липиды: POPCAvanti полярные липиды850457C25 мг/мл в хлороформе
Гидрофобные гранулы: Bio-Beads, SM-2 СмолаBio-Rad1523920
13 мм шприц фильтр: 0,2 μ mPall life sciencesPN 4554T
Краситель: Фосфовольфрамат натрия трехосновной гидратSigma Aldrich31648
2-меркаптоэтанолSigma AldrichM3148-250ML
Додецилсульфат натрия (SDS)Bio-Rad161-0301
Коктейль ингибиторов протеазыSigma Aldrich4693132001
TCEPSigma Aldrich646547
Моющее средство: Гидрат холата натрияSigma AldrichC6445-10G
Холат500 мМ Холат натрия. Повторно суспендируйте в воде miliQ и храните при температуре -20 °C.
Липидный запас50 мМ POPC, 100 мМ холат натрия, 20 мМ Tris-HCl pH 7,5, 100 мМ NaCl. Хранить при 4 ° C на неделю; или<бр/> Магазин -80 ° С в течение месяца, предварительно продув раствор азотом.
Стандартный буфер20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 mM EDTA.
Хранить при 4°C.
Анодный буфер для неденатурирующего электрофорезаThermo Fisher ScientificBN200150 мМ бис-трис, 50 мМ трицин, pH 6,8
Неденатурирующий катодный буфер для электрофорезаThermo Fisher ScientificBN200250 мМ бис-трис, 50 мМ трицин, pH 6,8, 0,002% Coomassie G-250
Неденатурирующий электрофорез 4x Буфер для загрузки образцовThermo Fisher ScientificBN200350 мМ Bis-Tris, pH 7,2, 6 Н HCl, 50 мМ NaCl, 10% (масс./об.) глицерина, 0.001% Ponceau S
Денатурирующий электрофорез Беговой буферСобственный рецепт: 25 мМ Tris-HCl, pH 6,8, 200 мМ глицин, 0,1% (w/v)
SDS Денатурирующий электрофорез 5x БуферСобственный рецепт: 0,05% (w/v) бромфенолсин, 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% (v/v) глицерин, 10% (w/v) SDS, 10 мМ 2-меркаптоэтанол
Потрясающий бульонТриптон - 12,0 г, Экстракт дрожжей - 24,0 г, 100 мл 0,17 М KH<суб>2PO<суб>4 и 0,72 М K<суб>2HPO<суб>4, Глицерин - 4 мл.
Триптон, дрожжевой экстракт и глицерин получали до 900 мл и автоклавировали отдельно. KH2PO4 и K2HPO4 были приготовлены и автоклавированы отдельно. И то, и другое было смешано перед использованием среды.
натрия MSP для загрузки образца

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kleinschmidt, J. H., Popot, J. L. Folding and stability of integral membrane proteins in amphipols. Arch Biochem Biophys. 564, 327-343 (2014).
  2. Frauenfeld, J., et al. A saposin-lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nat Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  3. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat Struct Mol Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  4. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-Assembly of Discoidal Phospholipid Bilayer Nanoparticles with Membrane Scaffold Proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  5. Jonas, A., Steinmetz, A., Churgay, L. The number of amphipathic alpha-helical segments of apolipoproteins A-I, E, and A-IV determines the size and functional properties of their reconstituted lipoprotein particles. J Biol Chem. 268 (3), 1596-1602 (1993).
  6. Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Eng Des Sel. 23 (11), 843-848 (2010).
  7. Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. Optimized phospholipid bilayer nanodiscs facilitate high-resolution structure determination of membrane proteins. J Am Chem Soc. 135 (5), 1919-1925 (2013).
  8. Ritchie, T. K., et al. Methods in Enzymology. Duzgunes, N. ejat 464, Academic Press. 211-231 (2009).
  9. Schuler, M. A., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs as a new tool to examine lipid-protein interactions. Methods Mol Biol. 974, 415-433 (2013).
  10. Nasr, M. L., et al. Membrane phospholipid bilayer as a determinant of monoacylglycerol lipase kinetic profile and conformational repertoire. Protein Sci. 22 (6), 774-787 (2013).
  11. Yokogawa, M., et al. NMR analyses of the interaction between the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) and phosphoinositide embedded in a lipid bilayer. J Biol Chem. 287 (42), 34936-34945 (2012).
  12. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186, 61-67 (2015).
  13. Zhang, P., et al. An Isoform-Specific Myristylation Switch Targets Type II PKA Holoenzymes to Membranes. Structure. 23 (9), 1563-1572 (2015).
  14. Grushin, K., Miller, J., Dalm, D., Stoilova-McPhie, S. Factor VIII organisation on nanodiscs with different lipid composition. Thromb Haemost. 113 (4), 741-749 (2015).
  15. Baylon, J. L., Lenov, I. L., Sligar, S. G., Tajkhorshid, E. Characterizing the membrane-bound state of cytochrome P450 3A4: structure, depth of insertion, and orientation. J Am Chem Soc. 135 (23), 8542-8551 (2013).
  16. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Oncogenic and RASopathy-associated K-RAS mutations relieve membrane-dependent occlusion of the effector-binding site. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6625-6630 (2015).
  17. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Membrane-dependent modulation of the mTOR activator Rheb: NMR observations of a GTPase tethered to a lipid-bilayer nanodisc. J Am Chem Soc. 135 (9), 3367-3370 (2013).
  18. Wang, L., Sigworth, F. J. Structure of the BK potassium channel in a lipid membrane from electron cryomicroscopy. Nature. 461 (7261), 292-295 (2009).
  19. Ackerson, C. J., Powell, R. D., Hainfeld, J. F. Site-specific biomolecule labeling with gold clusters. Methods Enzymol. 481, 195-230 (2010).
  20. Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (31), 11509-11514 (2006).
  21. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. Membrane protein structure determination - the next generation. Biochim Biophys Acta. 1838 (1 Pt A), 78-87 (2014).
  22. Dias, D. M., Ciulli, A. NMR approaches in structure-based lead discovery: recent developments and new frontiers for targeting multi-protein complexes. Prog Biophys Mol Biol. 116 (2-3), 101-112 (2014).
  23. Viegas, A., Viennet, T., Etzkorn, M. The power, pitfalls and potential of the nanodisc system for NMR-based studies. Biol Chem. , (2016).
  24. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  25. Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy (Oxf). 65 (1), 35-41 (2016).
  26. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  27. De Carlo, S., Adrian, M., Kalin, P., Mayer, J. M., Dubochet, J. Unexpected property of trehalose as observed by cryo-electron microscopy. J Microsc. 196 (1), 40-45 (1999).
  28. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nat Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  29. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
  30. Forte, T. M., Nordhausen, R. W. Electron microscopy of negatively stained lipoproteins. Methods Enzymol. 128, 442-457 (1986).
  31. Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
  32. Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. J Lipid Res. 52 (1), 175-184 (2011).
  33. Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
  34. Matz, C. E., Jonas, A. Micellar complexes of human apolipoprotein A-I with phosphatidylcholines and cholesterol prepared from cholate-lipid dispersions. J Biol Chem. 257 (8), 4535-4540 (1982).
  35. Kumar, R. B., et al. Structural and Functional Analysis of Calcium Ion Mediated Binding of 5-Lipoxygenase to Nanodiscs. PLoS One. 11 (3), e0152116(2016).
  36. Waggoner, T. A., Last, J. A., Kotula, P. G., Sasaki, D. Y. Self-assembled columns of stacked lipid bilayers mediated by metal ion recognition. J Am Chem Soc. 123 (3), 496-497 (2001).
  37. Kovacs, E., et al. Analysis of the Role of the C-Terminal Tail in the Regulation of the Epidermal Growth Factor Receptor. Mol Cell Biol. 35 (17), 3083-3102 (2015).
  38. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy. J Vis Exp. (90), e51087(2014).
  39. Zhang, L., Tong, H., Garewal, M., Ren, G. Optimized negative-staining electron microscopy for lipoprotein studies. Biochim Biophys Acta. 1830 (1), 2150-2159 (2013).
  40. Cong, Y., Ludtke, S. J. Single particle analysis at high resolution. Methods Enzymol. 482, 211-235 (2010).
  41. Radmark, O., Werz, O., Steinhilber, D., Samuelsson, B. 5-Lipoxygenase, a key enzyme for leukotriene biosynthesis in health and disease. Biochim Biophys Acta. 1851 (4), 331-339 (2015).
  42. Anwar, Y., Sabir, J. S., Qureshi, M. I., Saini, K. S. 5-lipoxygenase: a promising drug target against inflammatory diseases-biochemical and pharmacological regulation. Curr Drug Targets. 15 (4), 410-422 (2014).
  43. Radmark, O., Samuelsson, B. Regulation of the activity of 5-lipoxygenase, a key enzyme in leukotriene biosynthesis. Biochem Biophys Res Commun. 396 (1), 105-110 (2010).
  44. Noguchi, M., Miyano, M., Matsumoto, T., Noma, M. Human 5-lipoxygenase associates with phosphatidylcholine liposomes and modulates LTA4 synthetase activity. Biochim Biophys Acta. 1215 (3), 300-306 (1994).
  45. Pande, A. H., Qin, S., Tatulian, S. A. Membrane fluidity is a key modulator of membrane binding, insertion, and activity of 5-lipoxygenase. Biophys J. 88 (6), 4084-4094 (2005).
  46. Pande, A. H., et al. Modulation of human 5-lipoxygenase activity by membrane lipids. Biochemistry. 43 (46), 14653-14666 (2004).
  47. Wong, A., Hwang, S. M., Cook, M. N., Hogaboom, G. K., Crooke, S. T. Interactions of 5-lipoxygenase with membranes: studies on the association of soluble enzyme with membranes and alterations in enzyme activity. Biochemistry. 27 (18), 6763-6769 (1988).
  48. Rigaud, J. L., Levy, D., Mosser, G., Lambert, O. Detergent removal by non-polar polystyrene beads. European Biophysics Journal. 27 (4), 305-319 (1998).
  49. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  50. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. J Vis Exp. (90), e51087(2014).
  51. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).
  52. Hornschemeyer, P., Liss, V., Heermann, R., Jung, K., Hunke, S. Interaction Analysis of a Two-Component System Using Nanodiscs. PLoS One. 11 (2), 0149187(2016).
  53. Degrip, W. J., Vanoostrum, J., Bovee-Geurts, P. H. Selective detergent-extraction from mixed detergent/lipid/protein micelles, using cyclodextrin inclusion compounds: a novel generic approach for the preparation of proteoliposomes. Biochem J. 330 (Pt 2), 667-674 (1998).
  54. Martin, D. D., Budamagunta, M. S., Ryan, R. O., Voss, J. C., Oda, M. N. Apolipoprotein A-I assumes a "looped belt" conformation on reconstituted high density lipoprotein. J Biol Chem. 281 (29), 20418-20426 (2006).
  55. Cerione, R. A., Ross, E. M. Reconstitution of receptors and G proteins in phospholipid vesicles. Methods Enzymol. 195, 329-342 (1991).
  56. Shaw, A. W., McLean, M. A., Sligar, S. G. Phospholipid phase transitions in homogeneous nanometer scale bilayer discs. FEBS Lett. 556 (1-3), 260-264 (2004).
  57. Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
  58. Civjan, N. R., Bayburt, T. H., Schuler, M. A., Sligar, S. G. Direct solubilization of heterologously expressed membrane proteins by incorporation into nanoscale lipid bilayers. Biotechniques. 35 (3), 553-562 (2003).
  59. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A step-by-step method for the reconstitution of an ABC transporter into nanodisc lipid particles. J Vis Exp. (66), e3910(2012).
  60. Brooks, S. P., Storey, K. B. Bound and determined: a computer program for making buffers of defined ion concentrations. Anal Biochem. 201 (1), 119-126 (1992).
  61. Gilbert, N. C., et al. The structure of human 5-lipoxygenase. Science. 331 (6014), 217-219 (2011).
  62. Radmark, O. 5-lipoxygenase-derived leukotrienes: mediators also of atherosclerotic inflammation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (7), 1140-1142 (2003).
  63. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. 534 (7607), 347-351 (2016).
  64. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transmission Electron MicroscopyNanodisc PreparationMembrane Protein BindingNegative Stain TEMSize Exclusion ChromatographyNon denaturing Gel ElectrophoresisPhosphotungstate StainingMonotopic Protein AnalysisNanodisc StackingProtein Nanodisc Complex

Related Articles