Method Article

Характеристика кальцификации событий с использованием живого оптической и электронной микроскопии методы в морской Tubeworm

DOI:

10.3791/55164

⸱

February 28th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Clemson University, 2Department of Marine Biodiversity Research (BioDive), Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 3Advanced Material Research Laboratory (AMRL), Clemson University, 4Swire Institute of Marine Sciences and School of Biological Sciences, The University of Hong Kong

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы демонстрируем использование различных методов микроскопии, которые полезны для наблюдения за кальцификацией трубчатого червя, Hydroides elegans, а также для определения местоположения и характеристики первого кальцинированного материала. Живая микроскопия и электронная микроскопия используются вместе для получения функциональной и материальной информации, которая важна для изучения биоминерализации.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Характеристика первого события биологического производства карбоната кальция требует комбинации подходов микроскопии. Во-первых, внутриклеточное распределение pH и ионы кальция можно наблюдать с помощью живой микроскопии с течением времени. Это позволяет идентифицировать стадию жизни и ткань с интересующей ее особенностью для дальнейших исследований методом электронной микроскопии. Стадия жизни и ткани, представляющие интерес, обычно имеют более высокие сигналы pH и Ca.

Здесь, используя H. elegans, мы представляем протокол для характеристики присутствия структур карбоната кальция в биологическом образце на сканирующем электронном микроскопе (SEM), используя энергодисперсионную рентгеновскую спектроскопию (EDS) для визуализации элементного состава, используя дифракцию обратного рассеяния электронов (EBSD) для определения наличия кристаллических структур и используя просвечивающую электронную микроскопию (TEM) для анализа состава и структуры материала. В этом протоколе сфокусированный ионный пучок (FIB) используется для выделения образцов с размерами, подходящими для анализа ПЭМ. Поскольку FIB является методом, специфичным для конкретного места, мы демонстрируем, как информация, полученная из предыдущих методов, может быть использована для определения интересующей области, где сигналы Ca наиболее высоки.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биоминерализация представляет собой сложный ряд событий, который соединяет набор клеточных процессов , приводящих к производству изысканно упорядоченных минералов 1. Задача состоит в том, чтобы охарактеризовать как динамический процесс клеточного и сложных минеральных структур с использованием комбинации оптических и электронных методов микроскопии. Повышение внутриклеточного рН способствует образованию кристаллов CaCO 3, следовательно, идентифицирующий этап жизни , который имеет повышенный рН показывает время , когда кальциноз, вероятно, происходит 2, 3.

В кольчатых червей из семейства серпулиды являются общими calcifiers в океане 4. Он также является популярной моделью беспозвоночное для морских исследований, особенно в биообрастания 5, 6. В этом исследовании, процесс кальцификации минерализующих отсеков Дуринаблюдается нг биоминерализация. Быстрый процесс метаморфоза включает появление карбоната кальция структур 7, 8.

Мы показываем, как внутренний рН измерения могут быть выполнены на tubeworm, и как жизненные этапы и ткани, имеющие отношение к кальцификации могут быть подвергнуты скринингу. После того, как этап жизненного интереса идентифицируется, ткань отвечает за кальцификации может характеризоваться более высоким разрешением с помощью электронной микроскопии. С помощью флуоресцентной микроскопии, мы определяем время, необходимое для карбоната кальция, чтобы появиться после метаморфического индукции. Подобный этап жизни был впоследствии визуализировали с помощью SEM-EDS для элементного распределения состава, и осажденный минерал анализировали с использованием двух различных методов электронной микроскопии, в частности, SEM-EBSD и FIB-ПЭМ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Скрининг сценической жизни и тканей интересов с живых изображений

  1. Культура морской личинки компетенции в соответствии с ранее описанными методами 6, 7, 9. Выдержите личинки tubeworm при 5 личинок на плотность мл с фильтрованной морской водой с 10 мкМ Snarf-1 AM в течение ночи. Накройте контейнер с алюминиевой фольгой для защиты флуоресцентного зонда от фото-отбеливание.
  2. Обратите внимание на личинок с помощью микроскопа рассечение. Личинки Грамотная tubeworm готов к метаморфоз будет плавать в прямом направлении, а не кругового движения.
  3. Передача компетентную личинок сито 60 мкм. Нажмите сетку против чашку Петри, обеспечивая хорошее уплотнение, чтобы удерживать жидкость. Быстро освободить уплотнение, чтобы освободить и выбросьте морскую воду, содержащую флуоресцентный краситель, сохраняя при этом личинки.
  4. Промыть личинок с фильтрованной искусственной морской воде (FASW) дважды, принимаяосторожность, чтобы не иссякнуть личинок в процессе.
  5. Поместите 10 до 20 личинок в тонких со стеклянным дном посуды 5 мл FASW , содержащей 10 -4 М изобутилметилксантина (IBMX) для наблюдения процесса метаморфоза.
  6. Вставьте кубы фильтра для обнаружения Snarf-1 сигнал (Канал 1: Ex 510/25 580/30 Em; Канал 2: Ex 510/25 Em 640/35) и DIC образ личинок.
  7. Расположите личинки изменяясь под цели 20Х, а затем, оптимизировать время выдержки (100-300 мс) достаточно быстро, чтобы гарантировать, что четкое изображение живых животных захватывается.
  8. Установить расстояние 1 мкм, чтобы захватить Z-стек всех трех каналов, при визуализации живого животного, визуализации каждого слоя для всех трех каналов, прежде чем перейти к следующему слою направлении г позволит лучше корреляцию между каналами.
  9. Экспорт масштабировать изображения серые для всех каналов и слоев, как TIF файлов с программным обеспечением микроскопа: File | Экспорт | Тип файла TIF | Начало.
  10. Использование ImageJ, импорт последовательность изображений для каждого канала: Файл | Импорт | Последовательность изображений.
    1. Для импорта канала 1 λ 1 их, ввести начальное изображение 3 и приращение: 4.
    2. Для импорта канала 2 λ 2 их, ввести начальное изображение 4 и приращение: 4.
  11. Генерация составного изображения путем деления Х 2 ет на λ 1 EM для каждого слоя пиксель за пикселем (Process | Image Calculator ... | Графический файл 640 нм "разрыв" файла изображения 580 нм), т.е. 640/580 нм отношение.
  12. Выберите изображение | Таблицы поиска | 16 цветов.
  13. Выберите Анализ | Инструменты | Калибровка бар.
  14. Проверьте различные слои, идентифицирующий слой, содержащий большую разнородность. Это обеспечивает наиболее полезную информацию о внутреннем распределении рН.
  15. Используя связь между отношением 640/580 нм и рН, построить профиль участок визуализировать распределение внутреннего рН.

2. Калибровка внутреннего рН

  1. После ночного окрашивания около 20 личинок с 10 мкМ Snarf-1 AM, добавить на складе решений нигерицина и KCl, чтобы компенсировать 50 мкМ нигерицина и 150 мМ KCl для калибровки.
  2. Доводят рН калибровки AFSW разбавленной NaOH или HCl, пока рН около 5,9 не будет достигнута. Обратите внимание, точное значение рН. Мера рН с помощью рН - метра со стеклянным электродом , который был откалиброван по морской воды на основе 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиола (Трис) и 2-аминопиридин 9.
  3. Передача одного окрашенную личинок tubeworm вместе с жидкостью с известным рН для сухой и чистой тарелки для измерения интенсивности сигналов при 640 нм и 580 нм.
  4. Повторите шаги 2.2 и 2.3 для более четырех точек рН в диапазоне от 5,9 до 9,9. Они представляют собой ряд физиологически соответствующих значений.
  5. Убедитесь, что сигналы появляются гомогенным по всему телу животного. Это указывает на то, что внутриклеточная рН было еquilibrated с окружающей морской воды.
  6. Изображение личинки tubeworm в пяти различных средах морской воды рН, записывают интенсивности , показанные в "серых" значений при 640 нм и при 580 нм, т.е. λ 2 отл и Х 1 отл.

3. Анализ Логометрический визуализации данных

  1. Введите значения серого, измеренная от пяти случайных местах или из зоны интереса на листе распространения.
  2. Проверьте калибровку пять точек показали линейную зависимость , чтобы указать внутриклеточный рН (например, уравнение , как у = 0.30x - 1,47; у = серого значения; х = рН; r² = 0,934).
  3. Вычислить внутриклеточные значения рН из уравнения, используя 640/580 отношение измеренного нм интенсивности на этапе 1.13.

4. Сохранение проб, Обезвоживание и монтаж для электронной микроскопии

  1. Сохранение стадии жизни интересов с 4% параформальдегидом. в этом исследовании, Зафиксировать кольчатых червей 2-4 дня после прикрепления, не держать животных в фиксаторе до анализа.
  2. Работая в вытяжном шкафу, после фиксации образца с 1% осмия водного раствора четырехокиси в течение 30 мин, чтобы свести к минимуму усадку тканей в процессе дегидратации.
  3. Высушить образца с серии градуированных этанола: 50% этанол в течение 5 мин, 70% этанола в течение 5 мин, 85% этанола в течение 5 мин, 95% этанола в течение 5 мин, и, наконец, абсолютный этанол в течение 5 мин дважды.
  4. Работая в вытяжном шкафу, добавьте 1: раствор 1 этанола и гексаметилдисилазана (HMDS) к образцу, что позволяет жидкости испаряться полностью.
  5. В вытяжном шкафу, добавьте 100% HMDS в образце, что позволяет жидкости испаряться полностью.
  6. Используя алмазный нож, ввести несколько сокращений культуры блюдо, окружающих несколько кольчатых червей. С крышкой, держать блюдо дно с алюминиевой заглушкой, чтобы сломать блюдо.
  7. Под микроскопом рассечение, найти сломанную часть, содержащую интактный tubeworm,
  8. Нанесите краску на серебряной алюминиевой заглушки и закрепить фрагмент Заглушке тщательно. Краска по краям пластикового фрагмента, чтобы уменьшить время зарядки.

5. Обнаружение кальция Рич региона с помощью SEM-EDS

  1. Закрепите образец заглушки на держатель образца.
  2. Измерьте высоту всего узла с датчика, снабженного микроскопом, регулируя высоту, ослабив стопорную шайбу и вращая штангу, пока образец не находится на стандартной высоте, или ввести высоту, как записано.
  3. Признайтесь воздуха в теплообменной камере микроскопа и поверните дверцу камеры открытой. Вставьте держатель образца на конце обмена стержня. Затем закройте и вакуумировать камеру.
  4. Откройте задвижку и выдвиньте шток обмена в направлении микроскопа камеры. Вставьте обменно стержень весь путь, чтобы полностью вместить держатель образца в столик микроскопа. Снимите шток обмена и закройте задвижку.
  5. Ввод тон образец размеры и отправить на сцену в исходное положение, чтобы поместить образец под столбцом электронов.
  6. Установите уровень вакуумной камере до 20-30 Па в режиме VP-SEM. Установите электронный ускоряющее напряжение до 20 кВ и включить высокое напряжение на.
  7. Поднимите сцену на образец рабочей дистанции 10 мм. Приобретать живой корм и найдите образец. Оптимизация изображения Регулировка астигматизма и фокус по мере необходимости.
  8. Откройте программу SEM-EDS и выберите опцию режима EDS-SEM. Выберите пункт меню для запуска карты EDS.
  9. Изменение конденсатора объектива и диафрагмы для достижения мертвое время ~ 30%, в то время процесса 3, как отслеживается через измеритель скорости в программе SEM-EDS. Запуск процедуры луча и выравнивания диафрагмы после внесения каких-либо изменений в настройки луча.
  10. Выберите масштаб таким образом, что единый организм заполняет все поле зрения. Включите опцию коррекции дрейфа и захвата изображения в программе SEM-EDS.
  11. Приобретать мар данные с заполнением организм до всего поля зрения, используя время выдержки 50-100 мс. Выполнить карту, пока данные не показывает четкую локализацию Са в организме (приблизительно 15 мин).
  12. Для получения данных от точки количественного определения, изменения времени процесса до 6 и отрегулировать электронный зонд приобрести мертвое время ~ 30%. Выполнить шаги выравнивания и оптимизации изображения по мере необходимости.
  13. Выберите точку и опцию ID в программе SEM-EDS и приобрести другое изображение. С помощью одного инструмента точки, нажмите на тех областях, которые появились Ca богатый на карте СЭД, а также Са-дефицитных областей для сравнения. Сканирование каждую точку в течение живого времени 30 с.

6. Определение кристаллографической информации кальция богатых регионов с помощью сканирующего электронного микроскопа-ЭИ

  1. Удалите пластиковые фрагмент, содержащий образец интереса со стороны плоского образца заглушкой и прикрепить к скошенной поверхности 45 ° предварительно наклонена заглушкой с использованием серебра проводящего клея.
  2. Винт заглушки на образец чстарше и положение наклонной грани на заглушке (с образцом), по направлению к передней части держателя образца. Вставьте держатель образца в камеру микроскопа с помощью обменной камеры.
  3. Установите вакуумной камере до 30 Па и электрон ускоряющее напряжение до 20 кВ. Отправить образец под столбцом электронов и наклон 25 ° этап поместить поверхности образца приблизительно 70 ° от нормали к электронным пучком. Включите высокое напряжение на.
  4. Поднять сцену в рабочее расстояние ~ 18 мм. Используйте трекбол, чтобы переместить сцену и найти образец. Увеличение коэффициента увеличения кадра специфические особенности, представляющие интерес. Совместите луч и оптимизировать изображение по мере необходимости.
  5. Откройте программу SEM-EDS в режиме EBSD. Выберите кальцит и арагонит как фазы, представляющие интерес. Вставьте камеру ЭИ на расстоянии 154 мм. Установить условия камеры 1 х 1 биннинга и времени кадра 100 мс. Используя быстрый растр луча, приобретают фон.
    Примечание: Различные частоты кадровможет потребоваться в зависимости от электронного зонда; отрегулировать частоту кадров или зонда камеры для достижения сигнала примерно на 90%.
  6. Захват изображения в программе SEM-EDS. С помощью инструмента анализа пятна и нажмите где-нибудь на изображение, чтобы сканировать луч на этой точке. Обратите внимание на окно камеры, чтобы увидеть, если какие-либо модели Кикучи обнаружены.
  7. Нажмите на разных участках изображения для сканирования потенциальных участков кальцификации, наблюдая окно камеры в каждой точке, чтобы увидеть, если Кикучи полосы присутствуют. Если модели присутствуют и соответствует ни одному из выбранных фаз в базе данных, они будут автоматически проиндексированы.

7. TEM Приготовление образца С помощью FIB-SEM

  1. Sputter пальто подготовленные образца SEM с платиной или подобным материалом для создания проводящего слоя.
    1. Поместите ранее фиксированные, обезвоженные и смонтированные образцы в корпус распыл для нанесения покрытий и включите питание, чтобы начать прокачку камеру вниз.
    2. После того, как вакуумная камера считывает 40 мТорр или менее, повернуть переключатель газа на и увеличить поток газа аргона для достижения давления в камере 200 мТорр. Отрегулируйте подачу газа для достижения конечного давления в камере 80 мТорр.
    3. Поверните переключатель напряжения на и увеличить напряжение, чтобы достигнуть ток 15 мА. Установите таймер и пальто в течение длительного времени (~ 10 мин), чтобы создать толстый слой (~ 60 нм), который защищает поверхность образца от повреждения ионного облучения. Регулировать напряжение для поддержания стабильного 15 мА тока.
    4. После завершения, выключения питания устройства для нанесения покрытий, чтобы освободить вакуум и удалить образец.
  2. Винт основание Приготовленную, разбрызгивание образец, нанесенный на винтовой пост M4 держателя инструмента образца. Затянуть до руки туго, ослабьте стопорную гайку, а затем поверните держатель образца пост, чтобы изменить высоту сборки. Используйте датчик высоты лазерной и регулировать высоту, чтобы быть в пределах 1 мм (= 0,04 дюйма, как показано на видео) стандартного коммерцd с прибором.
  3. Закройте все клапаны пистолета в FIB-SEM, а затем признать воздуха в eucentric ступени воздушного шлюза. После того, как давление выравниваются с окружающей средой, скользят блокировки открыт воздух и прикрепить держатель образца на штырьков обменного стержня. Поверните ручку на конце обменного стержня в положение "LOCK". Закройте воздушный замок и эвакуировать шлюзовую камеру воздуха.
  4. После того, как замок eucentric эстрада был эвакуирован, а давление совпадает с камеры FIB-SEM, открыть задвижку и вставьте образец, нажав на биржевом стержня. Вставьте обменно стержень всю дорогу, чтобы сесть держатель образца на стадии прибора eucentric, а затем поверните обменный стержень в положение "разблокировать". Вставьте стержень обмена обратно и закрыть задвижку.
  5. Переместить сцену, чтобы поместить образец в колонке ионного пучка. Откройте запорные клапаны и приобретают живой ион-индуцированное вторичное электронное изображение FIB. Используйте низкий увеличением ибыстро растрового сканирования, чтобы свести к минимуму повреждения ионов. Сбросить фокус нормального луча наблюдения и поднять высоту Z сцены, пока образец не находится в фокусе. В этот момент образец находится в положении крестовой, где оба иона и электронные пучки ориентированы в том же месте.
  6. Использование вторичного электронного изображения из SEM, найти интересующую область в образце, используя трекбол для перемещения образца вокруг. Сферы интересов являются Са богатые районы, ранее определенные отображения СЭД. Поверните сцену по мере необходимости, чтобы получить интересующие вас объекты в соответствии с рамой окна.
  7. На интерфейсе FIB окна, захватить быстрый снимок образца при увеличении 1,000X с дополнительным цифровым зумом 2X и сделать шаблон для осаждения на ~ 8 мкм × 2 мкм над областью интереса. Размер увеличения коробки осаждения может быть скорректировано с учетом особенностей различных размеров. Установите условия для ионно-плазменным напылением нагара с использованием 40 кВ, 0,09 нА луч, используя время выдержки 0,5 мкс в течение 5 мин.
  8. После осаждения углерода, изменение условий осаждения для осаждения вольфрама с использованием 40 кВ, 0,7 нА пучка и депозит в течение 5 мин, чтобы генерировать вольфрамовую мкм колпачок с ~ 2-3.
  9. Захват FIB снимок с помощью луча наблюдения и использовать инструмент микрообразцов распылением нарисовать узор из четырех коробок вокруг крышки вольфрама. Установите верхние и нижние коробки, чтобы быть приблизительно 15 мкм х 8 мкм; правая коробка 10 мкм х 5 мкм, а левое окно 6 мкм х 5 мкм, или достаточно большой, чтобы окружить область интереса.
    1. Изменить условия изготовления сократить с использованием 40 кВ, 19 нА пучка, и время задержки 50 мкс, и 3-4 кадров сканирования для каждой из коробки. Затем изготовить шаблон. После изготовления, интересующей области, с защитными C и W слоев, будет напоминать остров, со всеми смежными удаляемого материала на верхней, нижней и правой сторон.
  10. Наклоните этап 58 °, чтобы поставить SAMPле нормали к поверхности колонны электронов и под острым углом по отношению к ионообменной колонке. Найдите заднюю часть образца "остров" с помощью FIB и захвата снимка при увеличении 1,000X и 2-4x цифровым зумом.
  11. Нарисуйте ~ 15 мкм × 2 мкм рисунок распылением над нижней части задней стороны образца "острова" в самом конце, где она видна. Изготовить коробку, используя балку 4 нА в течение 3 мин, или до тех пор пока луч не прорезать дно образца "острова".
  12. Наклоните eucentric Stage -58 ° от текущей позиции (обратно к нулю). Вставьте вольфрамовой микрообразцов зонд, нажав кнопку "Probe In" в интерфейсе FIB. Выберите "MS" на панели управления стадии и использовать трекбол для перемещения зонда над верхней части образца.
  13. Приобретать в прямом эфире с ФВБ при увеличении 1 кх и расположить датчик таким образом, что наконечник находится прямо над правой стороны вольфрама колпачка микрообразца. Наблюдая живойSE изображения из SEM, используйте ручку управления Z панели ступени, чтобы опустить зонд, пока он контактирует с вольфрамовой крышкой. Зуммер будет звучать, как только контакт был сделан.
  14. Захват снимок с помощью FIB с использованием 40 кВ, 0,01 нА пучка, при увеличении 1,000X и 2-кратным цифровым зумом. С помощью инструмента осаждения нарисовать окно х 2 мкм 2 мкм через наконечник зонда, где он контактирует с вольфрамовой колпачок микрообразца.
    1. Установите условия для осаждения вольфрама с использованием 40 кВ, 0,09 нА пучка, в течение 2 мин и время выдержки 0,5 мкс. Затем изготовить шаблон.
  15. Нарисуйте ~ 2 мкм х 5 мкм рисунок распылени над левым концом микрообразца "рука" (где он все еще подключен к объему образца). Изготовить шаблон с помощью 40 кВ, 0,7 нА пучка, в течение 2 мин, или до тех пор пока сигнал не указывает на то, что микрообразца был отделен от объемного образца.
  16. С помощью ручки управления Z, чтобы поднять зонд с прикрепленным микрообразца доона очищает объемный образец, а затем отведите зонд. Отправить этап eucentric либо на дому или положение Exchange.
  17. Поместите медный половину сетки в держатель бокового входа и загрузите держатель в боковой вход этап продувки камеры. Откачать камеру и вставьте держатель бокового входа. Установите держатель в положение FIB.
  18. Нажмите сбоку на панели управления стадии и использовать трекбол, чтобы принести половину сетки в поле зрения на мониторе FIB. Переместить, чтобы очистить площадь половины сетки и с помощью ручки Z, чтобы довести поверхность в фокусе.
  19. Пресс-зонд в систему, чтобы вставить зонд, нажмите MS на панели управления стадии, и используйте ручку трекбола и Z в положение микрообразца через половину сетки. Опустите зонд до микрообразца контактов сетки.
  20. Захват изображения на FIB при 1,000X увеличении (2X зум). С помощью инструмента осаждения и нарисуйте узор на ~ 10 мкм х 3 мкм по нижней стороне микрообразца. Депозит вольфрама с 40 кВ, 0,7 нА пучка, используя обитать тIME 0,5 мкс в течение 3 мин.
  21. С помощью инструмента и распылением нарисуйте небольшой 1 мкм рисунок х 3 мкм над кончиком зонда. Изготовить шаблон с использованием 40 кВ, 0,7 нА пучка при времени выдержки 3 мс, чтобы сократить зонд от микрообразца. Отвести зонд один раз бесплатно.
  22. Захват FIB изображение при увеличении 5,000X и нарисуйте два шаблона ионно-плазменным напылением 7 мкм х 4 мкм в верхней и нижней части микрообразца, оставляя зазор в мкм ~ 1 между ящиками. Сосредоточьте узоры таким образом, чтобы не отрезать левую и правую стороны микрообразца. Изготовить оба шаблона с использованием 40 кВ, 4-нА заряда пучка и время выдержки 3 мкс, в течение 2 мин, определение направления растра по направлению к центру микрообразца.
  23. Захват другое изображение с помощью луча наблюдения FIB на 5,000X. Изменение размера предыдущие коробки брызгать слюной до ~ 6,5 мкм х 1 мкм, сближаются, чтобы оставить зазор ~ 0,5 мкм, и изготовить с использованием 40 кВ, 0,7 нА пучка.
  24. Наклоните этапе ввода боковую 0,5 ° и колпачокTURE другой FIB изображение. Изменение размера распыл коробки шириной до 6 мкм. Поместите верхний рисунок над верхней стороной микрообразца и изготовить с использованием 40 кВ, 0,7 нА пучка. Наклон -0.5 ° и повторить с нижним рисунком, распыл и нижней стороне микрообразца.
  25. Дальнейшее уменьшение ширины шаблона на ~ 0,5 мкм. Наклон 0,5 ° и бормотать верхнюю сторону микрообразца с использованием 40 кВ, 0,09 нА пучка. Повторите с нижней стороной при -0.5 ° наклона.
  26. Наклоните этап 2,2 ° и приобрести FIB изображение на 10,000X. Изменение размеров моделей с ионно-плазменным напылением шириной 5 мкм и изменить условия луча до 5 кВ, 0,03 нА. Поместите верхний рисунок над верхней стороной микрообразца, вплоть до верхнего края, и изготовить. Наклон -2.2 ° и повторить с нижней стороной и нижней шаблон.
  27. Повторите 5 шагов фрезерных кВ до микрообразца не станет прозрачной электронной (~ 100 нм толщиной). После того, как закончите, закройте gunvalves и снимите держатель бокового входа.

8. Obtaining Выделенная область дифракционный рисунок на ПЭМ

  1. Для того, чтобы подготовить инструмент для анализа, как заполнить Дьюара колб с жидким азотом и установить ускоряющее напряжение до 300 кВ.
  2. После подготовки образца с помощью FIB, снимите держатель входа сбоку от FIB-SEM и отрегулируйте положение штифта таким образом, чтобы длина держателя, что соответствует кВ ТЭМ 300. Поверните наконечник держателя в правильное положение наблюдения, в очередной раз, сравнивая его со стандартным держателем TEM для обеспечения правильной ориентации образца.
    1. В качестве альтернативы, удалите половину сетки с прикрепленными пластинками из держателя FIB-SEM и место в стандартном держателе ПЭМ.
  3. Загрузите держатель образца в обменном камеру ПЭМ и вакуумировать камеру. Убедитесь в том, что пистолет клапан инструмент закрывается, когда воздух поступает в камеру обмена. После того, как замена камера подкачала вниз, звуковой сигнал будет звучать. Поверните держатель образца по часовой стрелке и позволяют Vācuгм, чтобы вытащить держатель образца, чтобы на первой позиции остановки.
  4. Разрешить вакуумный инструмент для восстановления, а затем открыть клапан пистолета. Сброс фокуса и масштабирования до увеличения приблизительно 10,000X.
  5. С помощью ручки выравнивания для смещения луча к центру экрана люминофором. Контракт и расширение луча и обеспечить, чтобы все движения луча концентрическими. Отрегулируйте для конденсатора честолюбия по мере необходимости.
  6. Поворот держателя образца против часовой стрелки и позволяют вакуум, чтобы вытащить держатель полностью в колонну. С помощью перемещения ручки этапа для навигации и обнаружения образца.
  7. Увеличение увеличение на образце и отрегулировать Z-высоту, пока образец не находится в фокусе. Используйте оптические окуляры по мере необходимости.
  8. Вставьте камеру и удалить люминесцентный экран. Разверните луч по мере необходимости, чтобы избежать oversaturating камеры. Настройка фокуса и камеры параметров, а затем начать сбор для захвата изображения.
  9. Чтобы получить дифракционную картину, первый центр вособенностью интереса. Снимите апертуры объектива и вставьте дифракционную диафрагму.
  10. Изменение в режиме дифракционной линзы, нажав на кнопку DIFF на панели управления и использовать ручку управления DIFF, чтобы уменьшить луч.
  11. Вставьте подавитель по мере необходимости, чтобы предотвратить центр дифракционной картины от выгорания экрана камеры или люминофора. Начало приобретения камеры для захвата изображения шаблона.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ниже приведены некоторые наблюдения процесса кальцинации во время метаморфоза tubeworm. На рисунке 1 показано , что значения рН вблизи области воротниковой выше , чем в других тканях после метаморфоза. Рисунок 2г показывает tubeworm с однородным распределением Са, предполагая никаких серьезных кальцификации событий не началось; Рисунок 2П показывает tubeworm , который кальцинированная в течение более длительного периода, что предполагает...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Живая оптическая томография является полезным методом для наблюдения клеточных событий в многоклеточного организма. Здесь, внутренние показатели рН и ионов кальция, были использованы для измерения потока ионов на минерализация участках. В этих регионах, активный ион накачки требуется , чтобы поднять рН и концентрацию Ca 2+ , чтобы включить кальцификации 2, 3. При нанесении флуоресцентных молекул для изучения организм, чрезвычайно важно, чтобы гарантир...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы выразить большую благодарность компании Clemson Broadcast Productions, аудиозапись Дж. Брайта, повествование А. Д. Маккуистона, аудио подслащивание, К. Мерфи, видеографию Г. Спейка, графику Т. Мессерви, видеомонтаж Т. Мессерви и Э. Роджерса. Техническая помощь и научные консультации были вдохновлены советами С. Кавады, С. Кубо, Д. Хадсона, Т. Дарруди, Д. Малви, Х. Цяня, И. В. Лама, М. Б. Джонстона, К. Кампанати, А. К. Лейна и Р. Динешрама. Данное исследование финансировалось за счет трех грантов GRF от HKSAR-RGC (номера грантов: 705511P, 705112P и 17304914).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Гексаметилдисилазан Электронная микроскопиянаук 16700(EM)
Тетраоксид осмия 2% водный растворЭлектронная микроскопияНауки 19192
IBMX 3-изобутил-1-метилксантинThermoFisher ScientificPHZ1124
нигерицин, свободная кислотаThermoFisher ScientificN7143-5MG
диаметр чашки 35 мм, размер отверстия 27 мм, стекло No0, без покрытияThermoFisher ScientificD110400
5-(и-6)-карбокси SNARF-1, ацетоксиметиловый эфир, ацетатThermoFisher ScientificC-1271
BDH хлорид калия, ACS GradeVWRBDH0258-500G
Параформальдегид
реагент марки, кристаллический		SigmaP6148
1 M Соляная кислота для объемного анализаWako Pure Chemical Industries, Ltd083-01095
0,05 M Раствор гидроксида натрия для объемного анализаWako Pure Chemical Industries, Ltd199-02185
КальцеинSigmaC0875
FASWIwaki Co. Ltd.Мембраны из
; диаметр 47 мм, 0,45 и микро; mADVANTECA045A047A
этанолWako Pure Chemical Industries, Ltd051-00476
Искусственная морская вода для буферовSOP06 DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf
Sodium ChlorideWako Pure Chemical Industries, Ltd191-01665
Хлорид калияWako Pure Chemical Industries, Ltd163-03545
Гексагидрат хлорида магнияWako Pure Chemical Industries, Ltd135-00165
Хлорид кальцияWako Pure Chemical Industries, Ltd039-00475
Сульфат натрияWako Pure Chemical Industries, Ltd197-03345
Соляная кислотаWako Pure Chemical Industries, Ltd089-08415
2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол (трис)Wako Pure Chemical Industries, Ltd207-06275
2-аминопиридинWako Pure Chemical Industries, Ltd011-02775
Orion 5-star Plus pH-метрThermo Scientific
PrpHecT ROSS Микрокомбинированный pH-электрод 8220BNWPThermo Scientific
Axiovision, версия 4.6, Axio Observer Z1Zeiss
ImageJNIH, Бетесда, Мэриленд, США
HRTEM H500Hitachi
SU6600 VPSEMHitachi
NB5000 Система сфокусированных ионов и электронных пучков (FIB-SEM)Hitachi 
смешанного эфира целлюлозы Rei-sea

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aizenberg, J., et al. Skeleton of Euplectella sp.: structural hierarchy from the nanoscale to the macroscale. Science. 309 (5732), 275-278 (2005).
  2. de Nooijer, L. J., Toyofuku, T., Oguri, K., Nomaki, H., Kitazato, H. Intracellular pH distribution in foraminifera determined by the fluorescent probe HPTS. Limnol Oceanogr Methods. 6 (11), 610-618 (2008).
  3. de Nooijer, L. J., Langer, G., Nehrke, G., Bijma, J. Physiological controls on seawater uptake and calcification in the benthic foraminifer Ammonia tepida. Biogeosciences. 6 (11), 2669-2675 (2009).
  4. Smith, A. M., Riedi, M. A., Winter, D. J. Temperate reefs in a changing ocean: skeletal carbonate mineralogy of serpulids. Mar Biol. 160 (9), 1-14 (2013).
  5. Carpizo-Ituarte, E., Hadfield, M. Stimulation of metamorphosis in the polychaete Hydroides elegans Haswell (Serpulidae). Biol. Bull. 194 (1), 14(1998).
  6. Bryan, P. J., Kreider, J. L., Qian, P. Y. Settlement of the serpulid polychaete Hydroides elegans (Haswell) on the arborescent bryozoan Bugula neritina (L.): evidence of a chemically mediated relationship. J Exp Mar Biol Ecol. 220, 171-190 (1998).
  7. Chan, V. B. S., et al. Evidence of compositional and ultrastructural shifts during the development of calcareous tubes in the biofouling tubeworm, Hydroides elegans. J. Struct. Biol. 189 (3), 230-237 (2015).
  8. DOE. Handbook of methods for the analysis of the various parameters of the carbon dioxide system in sea water. Version 2. Dickson, A. G., Goyet, C. , ORNL/CDIAC-74 (1994).
  9. Chan, V. B. S., et al. Direct deposition of crystalline aragonite in the controlled biomineralization of the calcareous tubeworm. Front Mar Sci. 2, 97(2015).
  10. Bond, J., Varley, J. Use of flow cytometry and SNARF to calibrate and measure intracellular pH in NS0 cells. Cytometry A. 64, 43-50 (2005).
  11. Lloyd, G. E. Atomic number and crystallographic contrast images with the SEM: a review of backscattered electron techniques. Mineral Mag. 51, 3-19 (1987).
  12. Perez-Huerta, A., Dauphin, Y., Cuif, J. P., Cusack, M. High resolution electron backscatter diffraction (EBSD) data from calcite biominerals in recent gastropod shells. Micron. 42 (3), 246-251 (2011).
  13. Bandli, B. R., Gunter, M. E. Electron backscatter diffraction from unpolished particulate specimens: examples of particle identification and application to inhalable mineral particulate identification. Am. Mineral. 97, 1269-1273 (2012).
  14. Hayat, M. A. Principles and techniques of electron microscopy: biological applications. , Cambridge University Press. (2000).
  15. Wirth, R. Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale. Chem Geo. 261, 217-229 (2009).
  16. Volkert, C. A., Minor, A. M. Focused ion beam microscopy and micromachining. MRS Bull. 32, 389-399 (2007).
  17. Kudo, M., et al. Microtexture of larval shell of oyster, Crassostrea nippona: A FIB-TEM study. J. Struct. Biol. 169 (1), 1-5 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Calcium Carbonate CalcificationLive Optical MicroscopyElectron Microscopy TechniquesIntracellular pH ImagingScanning Electron MicroscopyEnergy Dispersive Xray SpectroscopyElectron Backscatter DiffractionTransmission Electron MicroscopyFocused Ion BeamMarine Tubeworm Larvae

Related Articles