Мы разработали горизонтальный срез препарата сетчатки у млекопитающих взрослого с плоскостью секционирования параллельно поверхности сетчатки. Дендритные поля нерадиально ориентированных нейронов сетчатки не были усечены, что позволяет изучение обработки сигналов с накладными-смыкания и визуализации методов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подготовка горизонтальных слоев взрослых мышей Retina для электрофизиологических исследований
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Вертикальные препараты срезов хорошо разработаны для изучения схемы и передачи сигнала в сетчатке млекопитающих взрослого. Плоскость секционирования в этих препаратах, перпендикулярно к поверхности сетчатки, что делает его идеальным для изучения радиально ориентированных нейронов, таких как фоторецепторов и биполярных клеток. Тем не менее, крупные дендритные беседок горизонтальных клеток, клеток амакринных широкоугольных и ганглиозных клеток в основном усеченный, в результате чего заметно пониженную синаптической активности в этих клетках. В то время как ганглиозные клетки и перемещенные амакринные клетки могут быть изучены в целом монтажа подготовки сетчатки, горизонтальные клетки и амакринные клетки, расположенные во внутреннем ядерном слое лишь слабо доступны для электродов в цельной ткани сетчатки глаза.
Для достижения максимальной доступности и синаптическую целостности, мы разработали горизонтальную подготовку срезов сетчатки мыши, а также изучал передачу сигнала в синапсах между фоторецепторов и горизонтальнымклетки. Горизонтальное секционирование позволяет (1) простой и однозначный визуальной идентификации горизонтальных клеточных тел для электрода адресности и (2) сохранение расширенной горизонтальной ячейки дендритных полей, в качестве предпосылки для неповрежденного и функционального конуса синаптической вход горизонтальных дендритов клеток.
Горизонтальные клетки из горизонтальных слоев выставлены тонизирующее синаптической активности в темноте, и они ответили на короткие световые вспышки с уменьшением внутреннего тока и пониженной синаптической активности. Иммуноцитохимическая данные свидетельствуют о том, что почти все конусы в пределах дендритной области горизонтальной ячейки установить синапсы с его периферийными дендритов. Горизонтальный срез подготовка поэтому хорошо подходит для изучения физиологических свойств горизонтально протяженных нейронов сетчатки, а также сенсорную передачу сигнала и интеграции между выбранными синапсов.
Введение
Визуальная информация кодируется как динамический пространственно-временной паттерн активации фоторецепторов, и лента синапс между фоторецепторов и нейронов второго порядка определяет передачу вниз по течению визуальной информации. Вертикальная подготовка срез сетчатки млекопитающего является весьма ценным инструментом для изучения обработки сигналов в вертикальных путей, то есть между фоторецепторов и биполярных клеток, а также между биполярными клетками и некоторыми типами амакринных ячейки 1, 2, 3, 4.
Тем не менее, вертикальные секционирования всегда вызывает сильную усечение дендритных полей многих нейронов сетчатки, что приводит к значительной потере синаптических контактов. Особенно во внешней сетчатки, горизонтальные клетки страдают из - за их в боковом направлении распространяются расширенных дендритных полей и аксона систем 5. В вертикальномПодготовка ломтик, синаптической вход сотен колбочек терминалов к дендритов горизонтальной ячейки, таким образом, сводится к нескольким разреженных контактов. Это может быть достаточно, чтобы изучить свойства отдельных синапсов, но это ни в коей мере не представляют возможности обработки сигналов, лежащих в основе синхронизированного активацию фоторецепторов ленты синапсов.
Поэтому мы разработали горизонтальный срез препарат, который оставляет почти все фоторецепторов конуса синаптическую вход для горизонтальных дендритов клеток нетронутыми и функциональным. Самолет секционирования проходит параллельно поверхности сетчатки, идеально прорезая внутреннего ядерного слоя между горизонтальными клетками и клетками амакринных. Таким образом, горизонтальные срезы внешней сетчатки создаются, содержащие, на пресинаптической месте, фоторецепторов с внутренними и внешними сегментами, а также синаптических окончаний, а также горизонтальные клетки и биполярные клетки на постсинаптической месте. Этот препарат хорошо подходит тO исследовать скоординированные синаптические входы в горизонтальные дендриты клеток всеми колбочек фоторецепторов в пределах своей дендритных поля. Таким образом, она может оказаться полезным, чтобы лучше понять работу фоторецепторов лентой синапса, которая имеет решающее значение для передачи визуальной информации из матрицы активации фоторецепторов в постсинаптической ответ.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами для экспериментов на животных, выданных Федеративной Республики Германии.
Примечание: Поскольку ткань сетчатки будет лишен кислорода во время длительных частей этой процедуры все этапы должны выполняться как можно быстрее. Мыши должны быть темно-адаптированных по меньшей мере, 3 ч перед рассечение. Чтобы избежать световой адаптации сетчатки глаза, подготовки и нарезки следует проводить при тусклом красном свете.
1. Подготовка средств массовой информации и других химических веществ
- Приготовьте Эймса Medium 6. После вскрытия, погрузить ткани сетчатки в среде Эймса во все времена.
- Растворить 2,2 г Эймса среды и 298 мг HEPES в 250 мл дистиллированной воды. Концентрация HEPES будет 5 мМ. Слегка помешивая, пока все частицы не растворятся.
- Средние Bubble Эймса при комнатной температуре с карбогена (95% кислорода, 5% автомобилейДиоксид бон) в течение не менее 5 мин. карбогена Поставка со стеклянной пипетки Пастера к раствору. Подключение пипетку Пастера через соответствующие трубки к выходному отверстию газового регулятора.
- Добавить 475 мг Натрий-бикарбонат к раствору. Добавление бикарбоната после барботажа предотвращает осаждение карбоната кальция.
- Приготовьте при низкой температуре желирующий агарозы. Агарозном требуется для встраивания ткани сетчатки во время vibratome секционирования.
- Растворите 180 мг агарозы в 9 мл Эймса среды и 1 мл дистиллированной воды. С помощью микроволновой печи медленно нагревают раствор агарозы, пока все твердые вещества не растворятся. Тепло в 5 - с шагом 10 сек, чтобы избежать переполнения. Решение должно быть четким и прозрачным.
- Хранить растворенный агарозы в водяной бане при 37 ° С в течение длительности процедуры.
2. Настройка Vibratome
Примечание: Все секционирование было проведено сvibratome перечислены в таблице материалов. Данные настройки относятся к этому типу только vibratome. Для получения более подробной информации о vibratome секционирования нервной ткани , пожалуйста , обратитесь к работе 7.
- Поместите vibratome инжектор лезвие в держатель ножа.
- Измерьте вертикальное отклонение лезвия с "vibrocheck" устройства. Используйте регулировочный винт на держателе лезвия, чтобы наклонить лезвие, пока она не будет расположена параллельно к плоскости резания. Точное позиционирование лезвия необходима для предотвращения жалюзи с возможностью воздействия на поверхности раздела и производить плоский участок, содержащий живые клетки на ее поверхности.
- Установить vibratome следующие настройки: амплитуда, 1,00; Скорость, 0,20; толщина, 180 - 200 мкм.
3. Вскрытие Mouse Retina
- Анестезировать взрослых C57BL / 6 мыши испарением около 1 мл изофлуран в герметичном контейнере. При анестезии завершена, эвтаназии животных путем смещения шейных позвонков.мышь не должна быть старше 3-х месяцев, в противном случае качество ломтиков будет ухудшаться.
- Удалить глаз мяч путем размещения изогнутых щипцов под глазом. Осторожно поднимая глаз мяч выставят зрительный нерв. Вырезать зрительного нерва с пружинной ножницами и передать мяч глаз на чашку Петри 35 мм, содержащую 2 мл Эймса Medium.
- Выполнить все последующие шаги на этапе стереомикроскопа. Отрегулируйте увеличение до значения, которое позволяет оптимально визуальный контроль следующих процедур (шаги 3.4 - 3.9).
- Прокол роговицы при переходе к склере с заостренными пинцетом или иглой 20 G. На этом этапе, устойчивый мяч глаз с другим пинцетом. Будьте осторожны, чтобы не повредить сетчатку с прокалывающего устройства.
- Вставьте пружинные ножницы в маленькое отверстие сделали в шаге 3.3 и вырезать круг вокруг роговицы. Опять же, устойчивый мяч глаз с щипцами во время резки. Keep надрез очень близко к поверхности, чтобы не Cут в сетчатку.
- Осторожно удалите роговицу, хрусталик и стекловидное тело с пинцетом. Стекловидное тело содержит только тонкий прозрачный слой в задней части глаза. Тем не менее, важно для vibratome секционирования, что стекловидное тело полностью удалена.
- В чашку Петри, поместите окуляр таким образом, что каждый смотрит через отверстие вниз на сетчатку. Край отверстия должен состоять только из склеры ткани. Если круговой вырез (шаг 3.4) было выполнено слишком близко к экватору наглазника, ретинальной ткани также будет присутствовать близко к надреза. Будьте осторожны, то, чтобы не повредить сетчатку на шаге 3.8.
- Захватите склеры с пинцетом и аккуратно разрывать ткани друг от друга. Важно, чтобы не привести к разрыву сетчатки глаза во время этого этапа. При необходимости, отсоединить сетчатку от зубчатый край по придерживая склеры часть ткани с щипцами и осторожно отшелушивающим сетчатку с другими щипцами. Держите закрытыми щипцами; никогда не обрабатывать повторнотина с пинцетом с момента ткани очень мягкий и даст путь немедленно.
Примечание: На этом этапе, сетчатка и остальная часть окуляра будет подключен только на головке зрительного нерва. - Вырезать участок крепления на головке зрительного нерва с пружинными ножницами. Сетчатка должна теперь быть свободно плавающие в качестве одного куска ткани в среде Эймса.
- Вырезать сетчатку в 4 - 6 небольших прямоугольников примерно 23 мм, используя изогнутый лезвие скальпеля, удерживая сетчатку по краям с щипцами, чтобы манипулировать его в нужное положение. Избегайте защемления ткани сетчатки внутри прямоугольников. Возьмите кусочки из центральной части сетчатки, а не далеко периферии.
- Перенести куски ретинальные с большим диаметром пластиковый пипеткой Пастера до 35 мм пластиковые чашки Петри, дно которой было заменено сеткой с размером сетки менее 1 мм. Закрепите чашку Петри в верхней трети стакана или коническую колбу и затопление части сетчатки глаза в Medium бушель Эймсаbbled с карбогена.
4. Вложение Ретинального пьес в агарозном
- Аккуратно перенести 2 - 3 части сетчатки в 35 мм пластиковые чашки Петри вместе с некоторыми из Эймса среды. Это наиболее удобно использовать большого диаметра пластиковой пипетки Пастера для передачи. На этом этапе, точная ориентация частей сетчатки глаза не имеет значения.
- Удалить как можно больше средне- Оставшийся Эймса со стеклянной пипеткой Пастера. Как только жидкость была удалена переходите к шагу 4.3. Не позволяйте сухой ткани сетчатки.
- Немедленно покрывают части сетчатки глаза с 2 мл растворенного агарозы (37 ° C). Принимая во внимание размер упомянутый в пункте 3.10, кусочки не будут сворачиваться в агарозы.
- В жидком агарозы, осторожно нажмите кусочки ретинальные на дно чашки Петри. Слой ганглиозных клеток должна быть обращена вниз. Используйте стерео микроскоп для суждения о точном положении. Для позиционирования, ручки пи сетчатки глазаECES с небольшим шпателем. Расположите сетчатку, как быстро и точно, насколько это возможно, так как агароза затвердеет быстро.
- Расположить кусочки ретинальные параллельно нижней части стеклянную посуду; в противном случае участки будут тангенциальным или косой. Отдельные части не должны касаться друг друга, но и не должно быть слишком далеко друг от друга. Постарайтесь разместить части сетчатки глаза более или менее на одном горизонтальном уровне.
- Поместите стеклянную чашку Петри с вложенными кусочками сетчатки глаза в холодильник (4 - 6 ° С) в течение не менее 2 мин. Это позволит быстро затвердевают агарозы для дальнейшей обработки. Как только агарозном полимеризуется приступить к следующему шагу.
5. Монтаж Ретинального Pieces
- Осторожно снимите блок агарозы, содержащий кусочки сетчатки глаза от чашки Петри. С помощью шпателя или аналогичное устройство для подъема агарозном блок из стекла. Благодаря адгезионных сил, это может оказаться довольно сложно. Тем не менее, избежать нарушенияагарозы блок. Осуществить это и все последующие шаги, при комнатной температуре.
- Поместите блок агарозы на покровного стекла и регулировать его размер с скальпелем. Оставьте 1 - 2 мм агарозы на каждой стороне частей сетчатки глаза. Окончательный размер блока должен быть около 1066 мм (10 мм относится к высоте блока, от 6 мм до его длины кромки).
- Клей агарозы блок к держателю образца из vibratome с помощью мгновенного клея. Сетчатки части должны быть расположены в верхней части высокого блока 10 мм и ориентированы параллельно ее поверхности, в то время как нижняя прикреплена к держателю.
- Накройте блок немедленно путем заливки среды ранее ыми Эймса в буферный лоток vibratome.
6. Подготовка горизонтальных секций Vibratome
- Начало секционирования. Во-первых, установить толщину нарезки вручную, пока фрагменты ткани сетчатки появляются в срезе. Затем изменить настройки на шаге 2.3. Посколькумышь сетчатки глаза составляет лишь около 200 мкм, будет не более 2 - 3 ломтика в агарозном блоке.
- Удалить разделы из буферного лотка с помощью стеклянной палочки и передавать их в 2 мл среды Эймса в 35 мм чашку Петри.
- Разделы магазина сразу в термостате при температуре 37 ° С (5% CO 2/55% O 2). Агарозы окружающие секции будут оставаться твердым в инкубаторе и может быть использован для обработки секций без повреждения сетчатки глаза. Лучшее качество среза получается при хранении при 37 ° С в течение соответствующей атмосфере по сравнению с Medium ОКСИГЕНИРОВАННОГО Эймса при комнатной температуре. Секции могут быть использованы непосредственно или могут быть сохранены до 4 ч в инкубаторе с хорошими результатами физиологических.
- Вставить следующие части сетчатки глаза в агарозных и повторными разделах 4 - 6.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В горизонтальных срезов сетчатки мыши, горизонтальные клеточные тела могут быть легко идентифицированы в соответствии с их уникальной морфологии с несколькими первичными дендритов , выходящих из многоугольной тела клетки (рис 1А). Горизонтальные клеточные тела, расположенные вблизи поверхности среза были обычно доступны для патч-зажим электродов. Во время записи, клетки были заполнены флуоресцентным красителем, выявляя их запутанную ветвления дендритов, что походил...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В отличие от вертикальных срезов, дендритные морфология радиально ориентированных нейронов как горизонтальных клеток и клеток амакринных хорошо сохранились. По сравнению с целыми сетчатка препаратов, эти типы клеток легко доступны для микроэлектродов и могут быть изучены с помощью обоих электрофизиологических и обработки изображений методами. Здесь, мы сосредоточились на внешней сетчатки; Тем не менее, подобный подход сообщалось особенно для амакринных клеток внутреннего сетчатки 10.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 и FE464/11-1 для A.F. Авторы хотят выразить признательность Андреа Нерц за отличную техническую помощь.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Ames' Medium | Sigma | A1420 | |
| Бикарбонат натрия | Sigma | S5761 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Carbogen | Air Liquide | ||
| Agarose | Sigma | A9045 | |
| 35 мм чашка Петри (пластик) | Nunc Thermofisher | 150318 | |
| Glass Petri тарелка | Хемолин | 50-1470-40 | |
| Изофлуран | Диспансер Университетская больница | ||
| Вибратом инжектор лопасти | Biosystems | 39053250 | |
| Вибратом | Leica Microsystems | VT1200 | |
| Виброчек | Leica Microsystems | ||
| Микроволновая | |||
| Водяная баня | |||
| Щипцы | |||
| 20 G иглы | |||
| Пружинные | |||
| Изогнутые лезвия | |||
| Стереомикроскоп | |||
| Пластиковая пипетка | |||
| Стеклянная пипетка | Пастера |
Ссылки
- DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse. Neuron. 50, 735-748 (2006).
- Jackman, S. L., et al. Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response. Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).
- Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods. J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).
- Singer, J. H., Lassová, L., Vardi, N., Diamond, J. S. Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse. Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).
- Peichl, L., González-Soriano, J. Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig. Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).
- Ames, A., Nesbett, F. B. In vitro retina as an experimental model of the central nervous system. J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).
- Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J. Vis. Exp. (49), (2011).
- Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells. Development of the Retina. , Plenum Press. New York. (1998).
- Feigenspan, A., Babai, N. Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).
- Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. Horizontal slice preparation of the retina. J. Vis. Exp. (1), e108(2006).
- Babai, N., et al. Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses. J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).
- Thoreson, W. B. Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan & Babai). Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
