Методическая статья

Живая съемка Cell и 3D Анализ ангиотензина типа 1a Торговля в трансфицированных человеческих эмбриональных клеток почки с помощью конфокальной микроскопии

9.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55177

⸱

27 марта 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Georgetown University Medical Center, 2Department of Medicine, Georgetown University Medical Center, 3Department of Physics, Georgetown University Medical Center, 4Department of Oncology, Georgetown University Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы приводим протокол к клеткам изображения, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок-меченый типа ангиотензина 1a рецепторы во время эндоцитоза, инициированные лечения ангиотензина II. Этот метод включает в себя маркировочные лизосом со вторым флуоресцентным маркером, а затем программное обеспечение, использующие для анализа совместной локализации рецептора и лизосом в трех измерениях с течением времени.

Аннотация

Живых клеток используется для одновременного захвата покадровой изображения 1a рецепторов типа ангиотензина (AT 1a R) и внутриклеточным в трансфицированных человеческих эмбриональных почек-293 (НЕК) клеток после стимуляции ангиотензина II (Ang II). Клетки НЕК которые трансфицированы плазмидной ДНК , содержащей AT 1a R меченой с улучшенным зеленого флуоресцентного белка (EGFP). Лизосомы идентифицированы с красным флуоресцентным красителем. Live-ячейки изображения, снятые на лазерной сканирующей конфокальной микроскопии после стимуляции Ang II и анализировали с помощью программного обеспечения в трех измерениях (3D, вокселей) с течением времени. живых клеток позволяет расследование незаконного оборота рецептора и избегает путает, связанных с фиксацией, и в частности, утрата или артефактного перемещение EGFP-меченых мембранных рецепторов. Таким образом, как отдельные клетки отслеживаются через время, субклеточных локализации рецепторов можно визуализировать и измерить. Изображения должны быть приобретены sufficientlу быстро захватить быстрое перемещение везикул. Тем не менее, при более высоких скоростях обработки изображений, число фотонов, собранных уменьшается. Компромиссы также должны быть выполнены при выборе параметров обработки изображений, таких как размер воксела, чтобы получить скорость обработки изображений. Значительные применения живых клеток являются изучение незаконного оборота белка, миграцию, пролиферацию, клеточный цикл, апоптоз, взаимодействие аутофагии и белок-белок и динамику, чтобы назвать только некоторые из них.

Введение

Общая цель состоит в том, чтобы получить количественные данные во времени и пространстве рецепторов колокализации с конкретными субклеточных органелл после обработки агонистом рецептора. Таким образом, ближайшая цель здесь заключается в захвате покадровой конфокальной образы лизосом и трансмембранного рецептора в эмбриональных клетках почки человека (HEK) после трансфекции и затем собрать и проанализировать данные изображений в 3D, чтобы количественно измерить доставку рецептора лизосом. Исследуя одновременно торговлей трансмембранного рецептора с лизосом или других органелл во время эндоцитоза при активации лиганда рецептора может помочь определить, как трансмембранный рецептор регулируется при физиологических и патофизиологических условиях.

AT 1a R предполагается разлагаться в лизосомах после обработки Ang II в модельных системах клеток, в первую очередь HEK293 1 , хотя большинство гееeptors в основном локализованы в мультивезикулярных эндосомами рециркуляции для последующего повторного использования в плазматическую мембрану в то время как основная масса лиганда, Ang II, деградирует в лизосомы 2, 3, 4, 5. Совсем недавно, Ли и др. продемонстрирована с использованием передачи Фёрстера энергии резонанса (FRET) и флуоресцентной микроскопии срок службы томографии (FLIM) методы , которые АТ 1a R колокализуется (на ~ 10 нм масштабе) с ЛАМПА1, лизосомального мембранный белок , предполагая , что по крайней мере некоторые из рецептора нацелен на и деградирует лизосомами 6. Эти авторы отметили , что ингибитор лизосомальная хлорохин заблокирован AT 1a R-LAMP1 ассоциации , которая согласуется с предыдущими сообщениями о том , что эффект хлорохина является блокирование слияния поздних эндосом или автофагосомы с лизосом. Другие косвенные подходы к определению AT 1a R Localization в лизосомах использовали bafilomycin, ингибитор лизосомальное вывести при наличии 1a R в лизосомах 3, 4, 5, 6, 7, 8.

живых клеток позволяет избежать потенциальных эффектов фиксации по объему клеток и потере / затемнением / перераспределения GFP-химерного рецептора. Предыдущие исследования полагались на фиксированные клетки , чтобы определить , колокализацию или смежности рецептора с лизосомы или с использованием живых клеток , меченных суррогатами связывающих рецептор , таких как β-arrestin 1, 2, 3, 4, 5, 6. Live-ячейки изображения других GPCRs с помощью конфокальной вращающийся диск или лазерной сканирующей точки конфÖçal микроскопы , оснащенные датчиками GaAsP или Hyd позволило исследователям наблюдать за интернализации и оборота рецепторов в отдельных клетках отображенных в Z-стеки по 30 с интервалом 9, 10. Тем не менее , даже если живая клетка Z-стеки быстро собираются, анализ может происходить только после выбора одной плоскости в пределах каждого стека, т.е. в 2D 10. В то время как это могло бы быть достаточно для изучения интернализированный GPCR или тирозин киназный рецептор в вопросе, 1а ЗС в п накапливается в пузырьках , которые изменяют размер и положение с течением времени и , таким образом , по своей природе более трудно адекватно образец с использованием репрезентативного единственного среза в каждый момент времени. Для того, чтобы тщательно определить маршрут меченый AT 1a R через ячейку и обнаруживать каждый субпопуляции везикулы , различающихся по размеру и положению, мы разработали метод для 3D визуализации и 3D - анализа , чтобы отслеживать эти изменения и быть используется в сочетании с маркировки различных внутриклеточных компартментах, таких, как лизосомы.

Исследователи могут использовать этот протокол для живых клеток изображений непосредственно визуализировать движение AT 1a R в клетку и ее передачи в субклеточных отсеков после стимуляции Ang II. Субклеточные отсеки помечены флуоресцентным белком химер или других флуоресцентных маркеров. Этот протокол также может быть использован в качестве первого подхода к локализации рецепторов в субклеточных органелл с минимальным разрешением 200 нм для того, чтобы сравнить мутировали против рецепторов дикого типа или для обнаружения изменений после фармакологического лечения. Техника доступна, так как оно может быть осуществлено на любом конфокальный микроскоп, оснащенный для живых клеток. Относительная простота этого подхода контрастирует с увеличением опыта и оборудования , необходимого для проведения FRET / FLIM / методы Брет, распознающие молекулярные взаимодействия 6,"Xref"> 11. Эти измерения определяют белок-белковых взаимодействий с высоким разрешением (~ 10 нм) и локализация в пределах внутриклеточных органелл выводится. Эти более продвинутые методы используются для наблюдения и дальнейшего определения молекулярных взаимодействий , представляющих интерес, а не прохождение через рецепторы субклеточных отсеков, и они непосредственно демонстрируют белок-белковых взаимодействий в определенное время и в местах внутри клетки 11. FLIM, метод FRET зависит от концентрации акцепторной, чаще всего выполняется на фиксированных образцов, так как получение изображений происходит медленнее. В противоположность этому, соотношение FRET обеспечивает быстрое и обработки изображений с высоким разрешением колокализацию взаимодействующих белков. Недостатком соотношения FRET является то , что визуализация использует с широким полем зрения эпи-флуоресценцию , чтобы получить скорость обработки изображений и включить всю клетку, что приводит к уменьшению разрешения и контрастности органелл 12. передача Биолюминесценция энергия резонанса (BRET) является еще однимпередовая техника , которая была применена к GPCRs для измерения приобретения молекулярной близости с течением времени 11. В этой технике белок флуорофор молекул рно разделены и каждая половина связана с одним из двух белков, о которых идет речь. Когда два нужных белков, связываются друг с другом, части химерного тега Сборку приобрести флуоресценции и повышенную флуоресценцию количественно с течением времени.

Здесь мы представляем простой метод для живых клеток изображений в сочетании с количественной оценки изображения для изучения торговли AT 1a R в клетке после стимуляции Ang II и потенциального изменения в доставке усвоены AT 1a R в лизосомы после стимуляции Ang II. Конечной использование этого метода заключается, чтобы охарактеризовать различия в мембранном сравнивающие дикого типа и мутантных рецепторов. Эти различия помогут определить механизм (ы) , которые влияют физиологические активности AT 1a R leadiнг регуляции кровяного давления.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

День первый

1. Посев Cell

  1. Подготовить всю Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM). Добавьте 50 мл фетальной бычьей сыворотки, 5 мл пенициллина / стрептомицина, 5 мл L-глутамина до 450 мл DMEM, чтобы сделать 500 мл полной среды DMEM, дополненной фетальной бычьей сыворотки (10%), пенициллин / стрептомицин (1%) и L-глутамин (1%).
  2. Семенной эмбриональной почки (НЕК) клетки человека, проход номер 6-11 на 50000 / лунку в 8 хорошо патроннике системы покровного стекла в полной DMEM.
  3. Поддерживать камерные скольжение при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 в течение 24 ч.

День второй

2. липосом Трансфекция

  1. Свеже сделать AT плазмиды и липосом решений 1a R-GFP с использованием стерильных условиях с кабинетом уровень биологической безопасности 2.
  2. Разбавляют 2 мкл плазмидной ДНК в 900 нг / мкл исходного раствора в 178 мкл восстановленного сыворотки сред для достижения Концентратион плазмидной ДНК приблизительно 10 нг / мкл.
  3. Развести 4,5 мкл липосом исходного раствора в 175,5 мкл восстановленного сыворотки сред для создания разбавлении 1:40 запаса.
  4. Добавьте раствора липосом плазмиде раствора и смешивают с использованием 1 мл пипетку, чтобы пипеткой вверх и вниз 20 раз, чтобы перемешать раствор для трансфекции.
  5. Выдержите смесь в течение 30 мин при комнатной температуре (25-27 ° C).
  6. В то время как эта смесь инкубирования, удалить носитель медленно с 1 мл пипетки и медленно добавляют 400 мкл 1х фосфатно-буферным раствором (PBS), который предварительно нагревают до 37 ° С.
  7. Аккуратно удалите PBS и заменить 200 мкл / лунку восстановленного сыворотки средства массовой предварительно подогретой до 37 ° С.
    Примечание: Будьте осторожны, на всех этапах при мытье клеток, чтобы избежать отряд клеток от покровного из-за огромного стресса, вызванного пипеткой.
  8. Поддерживать клетки при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 в течение 30 мин.
  9. ОднаждыИнкубационный период заканчивается, добавляют 80 мкл смеси для трансфекции в каждую лунку и инкубировать клетки в течение 4,0-4,5 ч , но не более , чем 5 ч при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2.
  10. После окончания периода трансфекции инкубации завершена, медленно извлеките носитель из камер с использованием 1 мл пипетку и осторожно заменить 300 мкл / лунку полной DMEM и инкубировать клетки в течение 24 ч при температуре 37 ° C в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 ,

День третий

3. Сыворотка Голодание

  1. Извлеките носитель осторожно с помощью 1 мл пипетку и медленно заменить 300 мкл не содержащей сыворотки DMEM без фенолового красного.
  2. Поддерживать камеру при температуре 37 ° С в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 в течение 10-12 ч.

День четвертый

4. Живая съемка Cell

  1. Пятно внутриклеточные отсеки (лизосом в данном случае).
    1. аборигенУТ 30 мин до получения изображения лизосом в клетках, добавьте 22,5 мкл из 1 мкМ флуоресцентного красителя маточного раствора (0,5 мкл 1 мМ флуоресцентный краситель разводили в 499,5 мкл не содержащей сыворотки DMEM без фенолового красного), в каждую лунку для концентрации окончательного красителя 75 нМ.
    2. Выдержите в течение 25-30 мин при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 , а затем осторожно удалить краситель и медленно добавить 300 мкл свежей бессывороточной DMEM без фенолового красного.
  2. Подготовьте микроскоп для работы с изображениями.
    1. Отрегулируйте ступень вниз, чтобы избежать повреждения объектива при запуске автоматизированного микроскопа.
    2. Включите питание микроскопа, питание сканера, мощности лазера, а затем лазерного излучения, и, наконец, металлогалогенные лампы для визуального наблюдения (смотрите инструкции производителя конфокальной микроскопии).
    3. Откройте программу обработки изображений и в свою очередь программного обеспечения на аргон (488 нм) лазера и мощностью до 30-50%. Обратите внимание, что сила зависит отвозраст лазера. В экспериментах имеет решающее значение для поддержания постоянной настройки.
    4. Включите красный излучающий лазер (например , 568 нм или 594 нм).
    5. Настройка формата изображения 12-битной глубиной.
    6. Установите крошечное отверстие для аргона лазерной линии 488 нм и для 568 нм или 594 нм лазер с 1 Эйри диска устройства. Если GFP очень тускло, используйте установку 2-х дисковых блоков Эйри, но совпадают каналы соответствующим образом.
    7. При использовании дихроичных наборов фильтров, выберите соответствующие длины волн излучения для GFP и флуоресцентного красителя. Или установите длину волны излучения (Em) при 499-580 нм для GFP и Em 599 - 680 нм для красного светоизлучающего флуоресцентного красителя.
    8. Убедитесь, что протечка и кроссовер не происходит. Выключите каждый лазер в свою очередь, и проверьте оба канала выбросов для каждой из них. Когда лазер Аргон выключен, зеленая эмиссия должна быть равна нулю. Когда зеленый излучающий лазер выключен, красный канал излучения должен быть равен нулю.
      Примечание: Самый безопасный способ заключается в изображении каждого в отдельные треки (sequренциальный).
    9. Включите канал светлого при желании. Избегайте дифференциальной контрастности изображений (DIC), так как это может исказить измерения колокализационные.
    10. Для живого изображения, выберите линию, последовательный, а не последовательных кадров.
  3. Выберите ячейки для визуализации.
    1. Использование цели 1,4 числовая апертура (NA), таких, как цель 63X / 1.4 Н.А. нефти в клетках изображение (или 40X / 1.4 NA). Сосредоточьте цели и добавить каплю высокой вязкости, низкой аутофлуоресценция иммерсионного масла на цель.
    2. Перенести камеру с трансфектированных клеток из инкубатора на столик микроскопа. Будьте осторожны, чтобы держать слайды плоские и убедитесь, что камера хорошо сидит и удерживается от движения.
    3. Перемещение цели вверх, пока капля нефти не коснется нижней части слайда; право фокальной плоскости находится рядом с этой позиции. В автоматических микроскопов, сохранить эту позицию, а также опущенное положение использовать для бэрainder эксперимента формирования изображения для облегчения замены образцов.
    4. Выберите тусклые клетки. Клетки сверхэкспрессией AT 1a R-GFP будет неправильно направлять рецептор в клетке и нарушить нормальную функцию.
    5. Убедитесь, что контур ячейки, определяемый плазматической мембраной, видна и предпочтительно не перекрывается с другими клетками.
    6. Сосредотачиваете ячейку в поле зрения.
    7. Переключение в режим конфокальной.
    8. Выберите режим быстрого формирования изображения. С одной стороны, на регулировки фокуса, а другой на контроле XY этапе, сосредотачиваете ячейку интереса визуализируется на мониторе.
    9. Убедитесь, что ячейка, представляющая интерес, хорошо разнесены и его дно или брюшная сторона сопоставляются в тесном контакте с покровным, сосредоточив внимание вверх и вниз через ячейку.
  4. Установите параметры г-стадии к изображению ячейку в 3D.
    1. Нажмите кнопку On для верхней Z-стека и нижнего диалога (или его эквивалент) и сосредоточить внимание на нижней части CELL затем нажмите "начать". Затем, фокус на верхней части ячейки и нажмите "конца". Перепроверьте, что вся ячейка включена в Z-стека.
    2. Установить размер Z-шага до 1,0 мкм.
  5. Настройка параметров изображения.
    1. Выбор масштабирования 2, в зависимости от объектива, так что конечный размер пиксела составляет около 0,279 мкм х 0,279 мкм до 0,14 мкм х 0,14 мкм в измерении XY.
    2. Для НЕК клеток в этом эксперименте, установить скорость сканирования приблизительно 1 мкс на воксела и выберите 2 усреднение или 2 накоплениями от линии, в зависимости от яркости клеток.
    3. Регулировка интенсивности лазерного излучения и получить для визуализации GFP и флуоресцентный краситель. В общем, counterstains будет намного более ярким, и поэтому детектор ФЭУ (ФЭУ) и не Галлий арсенид фосфид (Gaasp) или гибридные детекторы (HYD) следует использовать для этого второго цветового канала в то время как ГБПБ и HYD детекторы необходимы для канала GFP. Если HyD или GaAsP обнаружитьОРР используются для флуоресцентного красителя, оказывают осторожность и начать с лазером при чрезвычайно низкой мощности.
    4. Установить продолжительность сканирования и частоты сканирования, например, через каждые 30-60 сек в течение 25 мин или дольше , чтобы увидеть нацеливание AT 1a R-GFP в лизосомы.
    5. Установите автофокусировку для поддержания стабильности фокусного плоскости с течением времени.
  6. Начните эксперимент визуализации.
    1. Приготовьте заранее 100x Ang II запас на уровне 5 мкг / мкл (4,7793 мм) и добавляют 2,1 мкл этого 998 мкл среды (10 мкМ).
    2. Начинают стимуляции лигандом путем добавления 3 мкл 100-кратного исходного раствора лиганда (Ang II) в лунку, содержащую 300 мкл непосредственно перед формирующим изображение (конечная концентрация 100 нМ).
    3. Нажмите кнопку Пуск и изображение в 3D в течение желаемого времени и частоты.
    4. Прежде чем закончить работу в микроскоп, собрать Z-стек для последующего использования в фоновом режиме во время анализа вычитанием. В режиме счета фотонов, это ненеобходимо, так как фон, по существу 0. При освещении включается и все другие условия формирования изображения так же, но без пробы брать образец изображения. См вычитание фона (ниже) при анализе.

День пятый

Анализ 5. Изображение

  1. Экспорт изображений в формате TIFF.
    1. Щелкните правой кнопкой мыши на имени файла изображения, чтобы увидеть меню и выберите Экспортировать или нажмите File | Экспорт | Импортировать.
    2. Экспорт в формате TIFF для последующего анализа убедившись, что экспортировать RAW, 12-разрядные данные [не "Красный Синий Зеленый '(RGB), используемый для преобразования качества публикации изображений]. Не экспортировать в формат JPEG.
    3. Обратите внимание, X, Y, Z размеры воксельных и размер Z-шага для последующего использования во время анализа изображений. Например, используя 40X / 1.4. NA линзы объектива эти значения могут быть 0,138 мкм х мкм с 1 мкм Z-размер шага 0,138 (см данные в разделе результатов репрезентативной).
  2. <сильный> Создание стека изображений для анализа.
    1. Открыть изображение Количественное программного обеспечения (Рисунок 2)
    2. Используйте "Действие | Создать новый | Изображения из выбранной последовательности" , чтобы создать единый файл образа из импортированных одиночных последовательностей (рисунок 2, стрелка # 1).
    3. Введите число каналов, число Z-секций, а число моментов времени.
    4. В зависимости от структуры * .tiff файлов выберите, например, каналы, Z-плоскости, и моменты времени как порядка плоскостей изображения. Убедитесь, что окончательный стек изображения правильно представляет цветовые каналы, Z-стек, а временные точки исходного изображения.
    5. Выберите имя изображения (рисунок 2, выделенный имя файла слева, стрелка # 2). Щелкните правой кнопкой мыши на изображение и / или поле изображения, а из опций в нижней части списка выберите "Свойства". В пикселе мкм для (X) (Y) и (Z) размера, введите правильные изображения свойства отмеченных выше.
  3. Вычитание фона до анализа изображений. Коррекция фона может быть выполнена в любом программном обеспечении для анализа изображений. Вычтите фон , используя один из двух вариантов.
    1. Вариант 1: Выберите "Действие | Создать новый | вычитание фона" (рисунок 2, стрелка # 1). Используйте полученные фоновое изображение, полученное в конце сеанса визуализации, описанной выше, в качестве изображения "Dark Reference" в разделе "Инструменты | Вычитание фона".
    2. Вариант 2: Проверьте самые темные участки в изображениях, где нет образца, найти среднюю или максимальную яркость пикселей в этом регионе, игнорируя любые необычно яркие пиксели, которые могут быть поддельной флуорофор, случайно яркий пиксель, или некоторые другие явления. Выберите "Действия | Создать новый | Фон Вычитание". Используйте эту яркость пикселя (сделанный отрицательным) в качестве смещения.
  4. Проверьте для регистрации цвета и при необходимости откорректировать.
      Использование положительного контроля , такие как изображаемых микрогранул, или, локализуется GFP-содержащие везикулы и флуоресцентный краситель (рисунок 3) оценить необходимость коррекции путем переключения либо красного или зеленого цвета канала и снова включите. Визуально, если регистрация сбита даже 1 пиксель, очевидно, для глаз.
    1. Произведите коррекцию регистрации, выбрав "Действия | Создать новый | Регистрация Коррекция" (Рисунок 2, стрелка # 1) и использовать диалоговое окно , чтобы внести коррективы. После завершения новый пункт папка появится под названием "коррекции регистрации".
    2. Нанести регистрацию на одну или несколько изображений , представляющих интерес, щелкнув имя изображения (рисунок 2, выделенный имя файла слева, стрелка # 2) , а затем выбрав пункт "Tools | правильной регистрации" (кнопка инструмента прилегающую к действиям).
  5. Создать последовательность измерений для анализа АТ 1a R-GFP везикулы и интенсивности целом клеток послеЛечение с Ang II.
    1. Выберите изображение (рисунок 2, выделенный имя файла слева, стрелка # 2) и нарисуйте область интереса (ROI) вокруг одной ячейки с помощью инструмента фристайл область (рисунок 2, 3 стрелка #). Используйте режим расширенной фокусировки (2D, выпадающее меню на левом верхнем углу), чтобы наблюдать клетку в качестве инструмента обрезки работает только в 2D-визуализации.
    2. Щелкните правой кнопкой мыши на изображение и выберите пункт "Crop к выделению" и новый элемент изображения формируется.
    3. Выберите обрезанной ячейку, щелкнув на его имени , а затем выберите вкладку "Измерение" выше (рисунок 2, стрелка # 4).
    4. Для того, чтобы измерить и определить усвоенные везикулы для GFP, перетащить "Найти объекты" под "Поиск" (рисунок 2, стрелка 5 #) в поле последовательности (рисунок 2, 6 стрелка #).
    5. Набор "Поиск объектов" Канал к каналу GFP.
    6. Открыть настройки (значок колеса в диалоговом окне, стрелка # 6) и установите4; Порог с помощью: "СД и" нижний предел "до 6. Установить" Минимальный размер объекта "до 3 мкм 0.
      ПРИМЕЧАНИЕ: SD нижний предел будет зависеть от индивидуальных экспериментов. Визуальное подтверждение , что правильные объекты порогами производится путем изучения различных временных точек (рисунок 2, стрелка 7 #). "Измерение | Обратная связь Параметры" диалоговое окно используется для выбора пути , что выбранные порогами объекты визуализируются (рисунок 2, стрелка # 8).
    7. Нажмите кнопку "Measure" в разделе "Поиск объектов" диалоговое окно (Рисунок 2 стрелка # 6) и выбрать каналы и тип измерений. Как правило, выберите "Все каналы" и "интенсивность и объем измерений".
    8. Для того, чтобы определить пороговую и фильтры для идентификации всей клетки и измерить суммарную интенсивность GFP, повторите вышеуказанные шаги (5.5.4 - 5.5.8), используя следующие параметры: SD 0 и "Минимальный размер объекта" до 2 мкм; м 3 во втором диалоговом окне «Поиск объектов» для идентификации клеток с помощью GFP (Рисунок 2, стрелка # 9)
    9. Перетащите "Фильтр населения" в разделе "Фильтрация" в поле последовательности под населения 2 (второй "Поиск объектов" окно, рисунок 2, стрелка # 9). Выберите "Объем (мкм 3> 100).
    10. Визуально убедиться, что только один объект идентифицируется. Вся клетка должна быть порогами и все остальные объекты отфильтровывают. Параметр "Фильтр" (ей), возможно, потребуется корректировка, если клетка мала, например.
    11. После того, как измерение было стандартизировано, сохранить протокол, щелкнув правой кнопкой мыши на изображение и выберите пункт "Сохранить протокол" с целью повторного использования ( "Восстановить протокол"). Протокол также могут быть экспортированы, чтобы обеспечить запись в том же подкаталоге, что и изображение.
    12. Перейдите к разделу "Make Измерение", выбрав "Измерения | Сделать измерения Пункт" (Рисунок 2 , стрелка # 8) или правой кнопкой мыши на изображение и выберите пункт "Сделать Измерение" и "Все" временные точки.
    13. Введите правильное название измерения (скопировать пасту с изображения удобно) и анализа кода или даты (а полезное дополнение для ведения учета) и выберите "Все" временные точки. Новый элемент рабочего листа будет создан под изображением. Держите имена файлов кратким.
  6. Анализировать и экспортировать данные.
    1. Нажмите на имя файла рабочего листа и выберите вкладку "Анализ". Определить, если насыщенными Вокселы присутствуют сначала выбрав "ограничивать анализ:" выберите Население 2 (ячейка).
    2. Щелкните правой кнопкой мыши на поле под "вкладке Анализ" и в диалоговом окне в разделе "Анализ этих данных:" выберите "Max ([GFP цветового канала])"; под "суммированы:" выберите "Среднее ([GFP цвет канала]", а также в разделе "Организация данных с помощью:" и "строка" выберите "временной точки" и интерфейс командной строкиск "OK".
      Примечание: Если данные содержат насыщенные пиксели (например , 65536 для 16-бит или 4,096 для 12-бит), анализ не будет точным (он будет недооценивать содержание везикул). Игнорируйте эту ячейку для анализа. Если не насыщен, переходите к следующему шагу.
    3. Далее, на вкладке "Raw", а затем на вкладке "Анализ" и щелкнув правой кнопкой мыши данные найти "ограничивать анализ:", а затем выбрать для населения 1 везикулы или населения 2 для всей клетки.
    4. В разделе "Анализ этих данных:" выберите "Sum" (цветового канала GFP); под "суммированы:" выберите "Сумма"; и, в разделе "Организация данных с помощью:" и "строка" выберите "временной точки" или "относительного времени", а затем нажмите кнопку "OK". Анализ выборы могут быть сохранены и использованы повторно.
    5. Выбрать и копировать / вставить непосредственно из изображения программное обеспечение для количественного определения пустой таблицы или экспортировать данные электронной таблицы, щелкнув правой кнопкой на DATа и выбора сохранить как CSV-файл. Измерение интенсивности вся ячейка будет включена с измерениями каждого пузырьком в популяции, поэтому обязательно, чтобы идентифицировать и отделить его от везикул.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После построения данных, увеличение общей флуоресценции GFP, содержащаяся в пузырьках быстро возрастает. Фотообесцвечивания, если это происходит, определяется как потеря общей интенсивности клеток GFP с течением времени.
  7. Создание измерения для анализа последовательности GFP , присутствующего в лизосомах.
    1. В Поиск объектов (население 1), установите "Найти объекты" канал для красного канала и значком колеса в этом диалоговом окне , указанном стрелкой # 6 (рисунок 2) набор "Порог с помощью:" СД и "нижнего предела" в 6. Установить "Минимальный размер объекта" до 0,017 мкм 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: SD нижний предел будет зависеть от индивидуальных экспериментов. Визуальное подтверждение того, что правильные объекты в настоящее время порогами должны быть сделаны экзаменаоцен- ками разные моменты времени. "Измерение | Обратная связь Параметры" диалоговое окно используется для выбора пути , что выбранные порогами объекты визуализируются (рисунок 2, стрелка # 8).
    2. Нажмите кнопку "Measure" в "Найти" Объекты "диалогового окна (Рисунок 2 стрелка # 6) и выбрать каналы и типы измерений. Как правило," Все каналы "и" Интенсивность и Том измерения "выбираются.
    3. Для населения 2, использовать настройки , идентичный используемому для идентификации всей трансфицированной клетки экспрессируют по 1a R-GFP (5.5.9).
    4. Если несколько клеток (в том числе нетрансфецированной клеток с флуоресцентным красителем-положительными везикулы) присутствуют, кадрирование ячейку на первом этапе анализа имеет решающее значение. В качестве альтернативы, использование "полочкам" следует использовать для ограничения идентификации лизосом внутри трансформированных клеток , экспрессирующих AT 1a R-GFP. Лизосомы должны быть идентифицированы только в пределах GFP клетки ине из близлежащих, нетрансфецированной клеток.
    5. Анализ и экспорт данных, как описано выше.
      Примечание: Пример из порогами клеток и везикул показана на рисунке 4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом представительном наборе экспериментов клетки НЕК трансфицируют типа ангиотензиновую 1a рецептора (AT 1a R-GFP) , конструкцию (E1,2,3-АТ 1a R) , клонированного в плазмиду pEGFP-N2 13. Время покадровой изображения НЕК были приобретены и играли в кино (см живых изображений сотовый 1 и Живая съемка Cell 2 фильмов). Фильмы и фотоизображение показывают , что после того, как стимуляции лигандом, АТ 1a

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Предварительные эксперименты , представленные здесь , показывают , что в течение довольно короткого времени течение 24 мин, без заметного изменения в поставке AT 1a R-GFP в лизосомах не произошло. В общем, поставка интернализированных рецепторов к лизосом может произойти уже в 15-20 мин. Этот эксперимент согласуется с гипотезой о том , что основная масса интернализированный AT 1a R является мишенью для больших, околоядерных эндосомами. Доказательства того, что по крайней мере некоторые AT 1a

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Научно-исследовательская работа представлена ​​в этой рукописи была поддержана грантом R01 HL121456-01A1 к Kathryn Сандберг. Эта работа была поддержана в дополнение наличием в Leica SP8 АОБ в микроскопии и обработки изображений совместно используемых ресурсов (MISR) в Джорджтаунском университете Медицинского центра, который частично финансируется P30-CA051008 из Национальных институтов здравоохранения Соединенных Штатов Америки. Мы выражаем глубокую признательность Leica помощь SP8 изображения Питера Джонсона, а также использование Цейсс LSM880 в лаборатории Томаса Coate, факультет биологии в Джорджтаунском университете, с помощью визуализации, предоставленной Alma Арнольд Carl Zeiss Микроскопия LLC. Содержание в этой рукописи является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здоровья.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ангиотензин II (Ang II)Sigma-AldrichA9525 
Модифицированная среда Dulbecco's Eagle (DMEM 1x)Gibco -ThermoFisher Scientific11960-044Теплый в 37 градусов; C водяная баня перед применением 
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Sigma-AldrichF2442теплая в 37 градусов; C водяной бани перед применением
Пенициллин Стрептомицин (Pen Strep Strep)Gibco -ThermoFisher Scientific15140-122Теплый в 37 градусов; C водяная баня перед применением
L-Glutamine 200 мМ (100x)Gibco (life technologies)25030-081Теплый в 37 градусов; C водяная баня перед использованием
эмбриональной почки человека (HEK)-293 AmericanType Culture Collection (ATCC) CRL-1573Passage No5 - 12
Nunc Lab-Tek II под патрон 1.5 Немецкая система покровных стеколSigma-Aldrich155409
Lipofectamine 2000 Реактив для трансфекцииThermoFisher Scientific11668019хранить в 4° С 
Opti-MEM, Пониженная сыворотка MediumGibco- ThermoFisher Scientific31985-070Warm in 37 ° C водяной баней перед применением
PBS 10x Биореагенты FisherBP3994теплые в 37°С; C водяной баней перед применением
среды Dulbecco's Modified Eagle (DMEM 1x) Gibco -ThermoFisher Scientific31053-028Тепло в 37 градусов; C водяной баней перед использованием
молекулярных зондовLysoTracker Red DND-99L7528Хранить алицитаты в темноте при температуре -20 °° С . 
Volocity Ver. 6.3 Программное обеспечение для анализа изображенийPerkinElmerМодули визуализации и количественной оценкиДля анализа 3D-изображений стеков изображений
Leica SP8 AOBSLeica Microsystemsлазерный сканирующий конфокальный микроскопДля сбора изображений
Zeiss LSM 880Лазерный сканирующий конфокальный микроскопCarl ZeissДля сбора изображений
клеток -ThermoFisher Scientific

Ссылки

  1. Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
  2. Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
  3. Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
  4. Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
  5. Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206(2008).
  6. Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003(2010).
  7. Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
  8. Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
  9. Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
  10. Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
  11. Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26(2014).
  12. Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613(2016).
  13. Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
  14. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
  15. Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
  16. Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670(2015).
  17. Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
  18. Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HEK 293GFP3D

Похожие статьи