Методическая статья

Целенаправленное плазматической мембраны Поставка гидрофобной Cargo инкапсулированы в жидком кристалле наночастицы Carrier

7.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55181

⸱

8 февраля 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Center for Biomolecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory, 2Optical Sciences Division, Naval Research Laboratory, 3Sotera Defense Solutions

В этой статье

Краткое содержание

Жидкокристаллический наночастицами (LCNP) nanocarrier эксплуатируется в качестве носителя для контролируемой доставки гидрофобного груза к плазматической мембране живых клеток.

Аннотация

Контролируемая поставка агентов лекарственного средства / визуализации для клеток имеет решающее значение для развития терапевтических средств и для изучения процессов клеточной сигнализации. В последнее время наночастицы (NPS) показали значительные перспективы в развитии таких систем доставки. Здесь жидкокристаллическая НП (LCNP) система доставки основанное была использована для контролируемой доставки нерастворимого в воде краситель, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine перхлорат (DIO), внутри ядра НП в гидрофобной области плазмы мембранный бислой. Во время синтеза наночастиц, краситель эффективно включен в гидрофобное ядро ​​LCNP, как это было подтверждено с несколькими спектроскопических анализов. Конъюгирование производное холестерина пегилированного к поверхности NP (DIO-LCNP-ПЭГ-Хол) позволило связывание красителя загруженным NPs к плазматической мембране в клетках НЕК 293T / 17. Времяразрешенная лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) томография подтвердила пропускив оттоку Диу из ядра LCNP и его введения в плазму мембранный бислой. И, наконец, поставка DiO как LCNP-PEG-Чхоль ослабляется цитотоксичность DiO; НП форма DiO выставлены ~ 30-40% меньшую токсичность по сравнению с DiO свободным избавлены от массы раствора. Такой подход демонстрирует полезность LCNP платформы в качестве эффективного механизма для доставки мембраны специфических и модуляции гидрофобных молекул грузах.

Введение

С момента появления взаимодействия наноматериалов (материалов ≤ 100 нм, по меньшей мере, в одном измерении) с живыми клетками, постоянная цель состояла в том, чтобы воспользоваться уникальными размерами зависящих от свойств наночастиц (NPS) для различных областей применения. Эти приложения включают клеток и тканей маркировки / обработки изображений (как в пробирке и в естественных условиях), в режиме реального времени зондирования, и контролируемой доставки лекарств и других грузов 1. Примерами таких соответствующих свойств NP включают в себя зависящее от размера эмиссии полупроводниковых нанокристаллов (квантовых точек, квантовых точек); в фототермические свойства наночастиц золота; большая несущая способность водной сердцевины липосом; и баллистическая проводимость углерода аллотропов, такие как одностенных углеродных нанотрубок и графена.

В последнее время значительный интерес возник в использовании NPs для контролируемой модуляции лекарственных средств и других грузов, таких как контраст / построения изображенияджентльмены. Здесь суть заключается в существенно повысить / оптимизировать общую растворимость, обеспеченную дозу, время циркуляции, и в конечном итоге оформление груза наркотиков, поставляя его в качестве препарата NP. Это стало известно как NP-опосредованной доставки лекарств (NMDD), и в настоящее время имеется семь FDA утвержденных лекарственные NP для использования в клинике для лечения различных видов рака и сотни больше на различных стадиях клинических испытаний. По сути, цель состоит в том, чтобы "достичь большего с меньшими затратами;" то есть, чтобы использовать NP как строительные леса , чтобы доставить больше лекарства с меньшим количеством дозирующих администраций, пользуясь большой площади поверхности: объем (например, твердые частицы, такие как КТ и оксидов металлов) ЯЭУ или их большой внутренний объем для загрузки большие грузовые полезных нагрузок (например, липосомы или мицеллы). Целью здесь является снижение необходимости в нескольких системно доставленных режимов дозирования в то время как в то же время продвижения водной стабильности и улучшения циркуляции, в частности, длясложные гидрофобные грузов наркотиков, что, в то время как высокоэффективна, плохо растворимы в водных средах.

Таким образом, цель работы, описанной здесь в том, чтобы определить жизнеспособность с помощью нового NP помост для специфической и контролируемой доставки гидрофобных грузов к липофильной плазматической мембраны бислой. Мотивация для работы была присуща ограниченная растворимость и трудности в доставке гидрофобных молекул в клетки из водной среды. Как правило, доставка таких гидрофобных молекул требует использования органических растворителей (например, ДМСО) или амфифильных поверхностно -активных веществ (например, полоксамеры), которые могут быть токсичными и компромиссом клеток и тканей жизнеспособность 2 или мицеллы носители, которые могут иметь ограниченную внутреннюю нагрузку производственные мощности. NP - носитель выбран здесь был роман жидкокристаллический NP (LCNP) препарат разработан ранее 3 и что было показано ранее для достижения ~ 40 раз Улучшение эффективности противоопухолевого препарата доксорубицина в культивируемых клетках 4.

В работе, описанной в данном документе, представитель грузовой выбранный был потенциометрического мембранного красителя, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine перхлорат (DIO). DiO представляет собой нерастворимый в воде краситель , который использовался для Антероградный и ретроградной трассировку в живых и фиксированных нейронах, мембранного потенциала измерений, а также для общей мембраны маркировки 5, 6, 7, 8, 9. Благодаря своей гидрофобной природы, DIO , как правило , добавляют непосредственно к монослоев клеток или тканей , в кристаллической форме 10, или его инкубируют при очень высоких концентрациях (~ 1-20 мкМ) после разбавления от концентрации исходного раствора 11, 12.

Содержание "> Здесь подход был применение к LCNP платформе, многофункциональная НП которого внутреннее ядро ​​полностью гидрофобными и поверхность которого одновременно гидрофильными и поддается биоконъюгации, как средство доставки для DiO. DiO встроен в ядро ​​LCNP в процессе синтеза , а поверхность НП затем функционализированные с холестерином фрагментом пегилированного для продвижения мембраны связывания с DIO-LCNP ансамбля к плазматической мембране. Такой подход привел к системе доставки, которая размечены DIO в плазматической мембране с большей точностью и мембранным жительства времени , чем свободная форма Диу избавлены от массы раствора (DIO бесплатно). кроме того, этот метод показал , что LCNP-опосредованной доставки Диу существенно модулирует и гонит скорость конкретного разделения красителя в липофильной плазматической мембраны бислой. Это достигается при одновременном снижении цитотоксичность свободного препарата на ~ 40%, обеспечивая его в качестве препарата LCNP.

Предполагается, что методология, описанная здесь, будет мощным позволяет технику для исследователей, работа которых связана или требует сотовой доставки сильно гидрофобного грузов, которые плохо растворимы или полностью не растворяется в водном растворе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Получение DIO-LCNP и DIO-LCNP-PEG-Чхоль

  1. Разведите жидкий кристаллический диакрилат сшивающий агент (DACTP11, 45 мг), 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine перхлорат (DIO, 2 мг), и инициатор свободных радикалов (азобисизобутиронитрил, 1 мг) в течение полимеризации в 2 мл хлороформа. Добавьте к этому водному раствору акрилата-функционализированного поверхностно-активного вещества (AC10COONa, 13 мг в 7 мл).
  2. Смесь перемешивают в течение 1 ч и гомогенат, при амплитуде 80% в течение 5 мин для получения miniemulsion, состоящий из мелких капель органического материала, окруженного полимеризуемого поверхностно-активного вещества в воде.
  3. Нагревают смесь до 64 ° C на масляной бане в чтобы инициировать полимеризацию как сшивающего агента и поверхностно-активного вещества, как хлороформ медленно испаряется, оставляя DIO-содержащий NP подвеску, которая стабилизирована поверхностно-активным веществом.
  4. Суспензию фильтруют NP (3 раза) через шприц-фильтр 0,2 мкм для удаления какой-либо агрегации. Stoповторно отфильтрованного раствора NP при 4 ° С до дальнейшего использования.
  5. Конъюгирование PEG-Чхоль к DIO-LCNP через EDC муфты.
    1. Растворите Чхоль-ПЭГ-NH2 & bull ; HCl (ПЭГ-Хол, 0,9 мМ) в 25 мМ HEPES - буфера (рН 7,0).
    2. Приготовить рабочий раствор , содержащий N - гидрокси-sulfosuccinimide натриевой соли (НГС, 40 мМ) и 1-этил-3- (3- (диметиламино) пропил) карбодиимида (EDC, 400 мМ) в буфере HEPES от концентрированных маточных растворов.
    3. Немедленно добавьте 20 мкл свежеприготовленного рабочего раствора НГС / EDC до 1,0 мл DIO-LCNP в буфере HEPES и перемешивают в течение 5 мин.
    4. Добавьте 20 мкл исходного раствора Хол-ПЭГ-NH 2 · HCl , к этой смеси и перемешивают в течение 2 часов.
    5. Кратко центрифугировать реакционную смесь при максимальной скорости (~ 2000 XG) в течение 30 сек с помощью столообразного мини центрифугу и передать супернатант через PD-10 , размер колонки гель -проникающей хроматографии , уравновешенной 13Дульбекко фосфатный буферный солевой раствор (DPBS, 0,1 x).

2. Характеристика DIO-LCNP и DIO-LCNP-PEG-Чхоль

  1. Подтвердите успешную ковалентной конъюгации ПЭГ-Чхоль к поверхности DIO-LCNP с помощью гель - электрофореза.
    1. Растворить 0,5 г агарозы в 50 мл (1x) трис-борат-электрофореза (КЭ; 89 мМ Трис (рН 7,6), 89 мМ борной кислоты и 2 мМ ЭДТА) буфере. Раствор нагревают в микроволновой печи для растворения агарозы. Дайте раствору немного остыть и вылить содержимое в гелевой пластине в поле электрофорез. Вставьте гель гребень для создания образцов скважин.
    2. После того, как гель затвердеет, добавьте необходимое количество (достаточно, чтобы погрузить гель в камере) КЭ рабочего буфера в камеру.
    3. Добавьте 35 мкл DIO-LCNP образца (с поправками с глицерином, 5% об / об) в лунки геля и работать в течение 20 мин при напряжении 110 В.
    4. Изображение геля с использованием системы визуализации геля Wiго возбуждения и эмиссии фильтров при длине волны 488 нм и 500-550 нм соответственно.
  2. Оценить размер частиц и распределение с помощью динамического рассеяния света (DLS) путем разбавления DIO-LCNP раствор (~ 200-кратное разведение) в PBS (рН ~ 8, 0.1x) и измерения на DLS инструмента 14. Мера дзета-потенциал DIO-LCNPs с помощью соответствующего дзета-потенциала, измерительный прибор.

3. Получение клеточных культуральных чашках для экспериментов Доставка и обработка изображений

Примечание: маркировка DIO-LCNP выполняется на НЕК 293T / 17 эмбриональные клетки почки человека (между проходами 5 и 15), которые культивировали , как описано ранее 4. Выполните эксперименты доставки и последующую ячейки изображения, как описано ниже.

  1. Готовят 35 мм чашках культуры ткани диаметром (оснащенную 14 мм № 1 покровного стекла вкладышами) путем нанесения на них с бычьим фибронектином (~ 100 мкл при концентрации 20 мкг/ Мл) в DPBS в течение еще 2 ч при 37 ° С.
  2. Удалите раствор фибронектина покрытия от культуральной чашки. Урожай НЕК 293 Т1 / 7 клеток, отобранных из Т-25 колбы первой промывки монослой клеток с 3 мл ДЗФР и затем путем добавления 2 мл трипсин-ЭДТА (0,5% трипсина-0,25% ЭДТА).
  3. Выдержите в колбу при температуре 37 ° С в течение ~ 3 мин. Удалите трипсин-ЭДТА и возвращают колбу в инкубаторе. После того, как клетки отделяют от колбы, нейтрализовать трипсина путем добавления 4 мл полной среды (среда Игла в модификации Дульбекко; DMEM; внесены поправки содержат 10% фетальной бычьей сыворотки, 5% пирувата натрия и 5% антибиотик / противогрибковым) в колбу , Определить концентрацию клеток в суспензии путем подсчета их в счетчике клеток.
  4. Отрегулируйте концентрацию клеток до ~ 8 × 10 4 клеток / мл среды роста. Добавьте 3 мл суспензии клеток к блюду и культуры в инкубаторе в течение ночи; На следующий день, клетки должны быть ~ 70% сплошности и должен быть готов к использованию. адекватныйплотность клеток имеет решающее значение для надежной и эффективной маркировки высоким процентом клеток.

4. Клеточная Поставка Дио и DIO-LCNPs и визуализации фиксированных клеток

  1. Подготовить 1 мл растворов Dio, DIO-LCNP и DIO-LCNP-PEG-Чхоль в доставочной среде (HEPES-DMEM; DMEM , содержащей 25 мМ HEPES) путем разбавления исходных растворов Диу свободной и DIO-LCNPs; соответствующие концентрации DIO для инкубации на клетках будет ~ 1-10 мкМ (выраженное в любой концентрации Диу свободной или DiO в виде DIO-LCNP).
  2. Удалите среду для роста из чашек для культивирования с использованием серологических пипетки и промыть монослоев клеток (см шаг 3) два раза HEPES-DMEM (2 мл каждого мытья). Выполните промывок, осторожно добавляя и удаляя HEPES-DMEM с помощью пипетки к / от края посуды.
  3. Добавить 0,2 мл приготовленных растворов Dio бесплатно или DIO-LCNP доставки в центре блюда культуры и возвращают блюда в Incubator в течение соответствующего периода времени (как правило, 15 или 30 мин, в зависимости от потребностей эксперимента). Более длительное время инкубации добавить к более неспецифической клеточной маркировки не-мембранными областей (например, цитозольных).
  4. После периода инкубации, удалите растворы доставки с помощью серологических пипетки. Промыть клеточные монослои два раза с ДЗФР (2 мл каждой промывки). Выполните промывок, осторожно добавляя и удаляя DPBS к / от края тарелки.
  5. Закрепить монослоев клеток с использованием 4% параформальдегида (полученного в ДЗФР) в течение 15 мин при комнатной температуре.
    ВНИМАНИЕ: параформальдегид является горючим, раздражает дыхательные и канцероген.
  6. Удалите раствор параформальдегида с помощью пипетки и осторожно промыть клетки 1 раз с ДЗФР (2 мл), добавляя и удаляя DPBS с помощью пипетки / от края посуды.
  7. Фиксированные клетки готовы быть отображены на наличие мембранном флуоресцентного сигнала с помощью конфокальной лазерной сканирующеймикроскопии (CLSM). Выполнить визуализацию немедленно или, в качестве альтернативы, замените носитель с ДЗФР , содержащим 0,05% NaN 3 и хранить посуду при температуре 4 ° С.
    ВНИМАНИЕ: NaN 3 является токсичным; проявлять крайнюю осторожность при использовании NaN 3.
    Примечание: Фиксированные образцы, хранящиеся таким образом, должны быть отображены в течение 48 часов для достижения оптимальных результатов.

5. Клеточная Поставка Дио и DIO-LCNPs и FRET изображений в живых клетках

Примечание: В этом методе клетки colabeled с 6 мкМ каждого DIO-LCNP-ПЭГ-ХОЛ (где DiO является донором FRET) и 1,1'-диоктадецил-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine перхлорат (DII свободный, где DiI является FRET акцептором). Освобождение DiO от DIO-LCNP-PEG-Чхоль и его включения в мембрану плазмы подтверждается наблюдаемым увеличением передачи энергии от донора к DiO DiI акцептора.

  1. Этикетка клетки последовательно с DIO-LCNP-PEG-Чхоль и DiI Freе используя метод , описанный на этапе 4.
  2. После окрашивания промыть клетки 1 раз с ДЗФР (2 мл) с использованием серологических пипетки и замените промывочный буфер с 2 мл раствора изображений живых клеток (LCIS).
  3. На стадии микроскопа, снабженного инкубационной камеры с подогревом, изображение образце живой клетки с помощью конфокальной микроскопии (60X цель) с конфигурацией FRET изображений с интервалом в 30 мин в течение 4 ч при возбуждении донора DiO при длине волны 488 нм и собирают полный выброс спектры как донора DiO и DiI акцептора от 490-700 нм с 32-канального детектора спектральной.
  4. Примечание: Для получения дополнительной информации о визуализации FRET см ссылке 15.
  5. Определить с временным разрешением интенсивности излучения как донора DiO и DiI акцептора из клеток, окрашенных с DIO-LCNP-PEG-Чхоль и DiI. Рассчитайте с временным разрешением акцептор / донор FRET соотношение (DiI ЭМИ / DiO ЭМП) для изображений, который будет неуклонно возрастать и в конце концов пластиныAu раз сумму DiO донора разбито на мембрану достигла максимального 16.

6. цитотоксичности Диу и DIO-LCNPs к НЕК 293T / 17 клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Цитотоксичность материалов DIO-LCNP оценивается с использованием анализа 17 пролиферации тетразолиевую на основе красителя. Клетки культивируют в многоямного пластины в присутствии различных концентраций веществ в условиях, которые имитируют доставки / маркировки. Клетки затем культивировали в течение 72 ч, чтобы обеспечить пролиферации. Краситель (МТС, (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -5- (3-карбоксиметоксифенил) -2- (4-сульфофенил) -2H-тетразолия) затем добавляют в лунки, и метаболически активными клетки превращают краситель в синий формазана. количество образуемого цвета прямо пропорционально числу жизнеспособных клеток.

  1. Урожай НЕК 293 Т1 / 7 клеток, отобранных из Т-25 колбы, следуя процедуре, описанной в стадии 3.2.SeedНЕК 293T 17 клеток / (5000 клеток / 100 мкл / лунку) в лунки для культуры ткани обработанной пластины 96-луночного и культуры в течение 24 часов.
  2. Полное удаление культуральной среды из скважин с помощью микропипетки и добавить 50 мкл HEPES-DMEM , содержащие Dio бесплатно, DIO-LCNPs или DIO-LCNP-PEG-Чхоль при увеличении концентрации реплицировать скважин. Инкубируют на клетки при 37 ° С в течение 30 мин.
    Примечание: Как правило, реплицируется сделано в трех экземплярах или четырех повторностях достаточны для получения статистически достоверных данных.
    1. После инкубации удалите среду доставки, содержащей материалы, используя микропипетку и заменить его на 100 мкл ростовой среды. Культуры клеток в течение 72 ч.
  3. Добавьте 20 мкл тетразолия субстрата в каждую лунку, вернуть пластину в инкубаторе, и позволить образование цвета протекать при температуре 37 ° С в течение 4 часов. Измерить оптическую плотность (ABS) формазана продукта при 570 нм (поглощение минимумов для DIO-LCNPs, используемых в этом СТЮду) и 650 нм (для вычитания неспецифического фона оптической плотности) с использованием ридере.
  4. Участок значение дифференциальной оптической плотности (ABS 570 - ABS 650) в зависимости от материала концентрации и сообщить о результатах в процентах пролиферации клеток (контроль степени пролиферации клеток в среде для культивирования клеток только).

7. Анализ данных

  1. Статистически анализировать данные с однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Для множественных сравнений, применяются после испытания специальной в Бонферрони. Обеспечить все средние значения, как ± стандартная ошибка среднего (SEM), если не указано иное.
    Примечание: Приемлемая вероятность значение имело р <0,05.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

LCNPs были подготовлены, в котором был загружен гидрофобное ядро ​​NP с репрезентативной мембраной мечения зонда, чтобы продемонстрировать полезность LCNP как эффективное средство доставки для гидрофобных грузов. С этой целью груз был выбран весьма растворимым в воде потенциометрический мембрана мечение краситель, DIO. DIO-нагруженные LCNPs (DIO-LCNPs) были синтезированы с использованием двухфазной техники мини-эмульсии с химическими компонентами DACTP11, AC10COONa и Dio, как показано на рисунке

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Продолжающееся цель NMDD является контролируемое нацеливание и доставку лекарственных средств для клеток и тканей, в сочетании с одновременным улучшением эффективности лекарственного средства. Один конкретный класс молекул лекарственного средства, для которых это представляет серьезную проблему является гидрофобные агенты лекарства / обработки изображений, которые экономно не растворяются в водной среде. Эта проблема преследует переход сильнодействующих препаратов из ин витро системах клеточных культур в клинич...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Программой финансирования NRL (Base Unit MA041-06-41-4943 работа). ON поддерживается Национальным исследовательским советом докторант Research Associateship.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1-этил-3-(3-(диметиламино)-пропил)карбодиимида гидрохлорид (EDCA)ThermoFisherE2247
3,3′-диоктадецилоксакарбоцианина перхлорат (DiO)Sigma AldrichD4292-20MGHazardous; сделать стоковый раствор в ДМСО
Холестерин поли(этиленгликоль) амина гидрохлоридNanocs, Inc.PG2-AMCS-2k
Автоматизированный счетчик ячеек CountessThermoFisherC10227
Dioctadecyl-3,3,3′ ⁠,3′-тетраметилиндокарбоцианина перхлорат (DiI)Sigma Aldrich468495-100MGОпасный; сделайте стоковый раствор в DMSO
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)ThermoFisher21063045Warm in 37 ° C перед применением
фосфатно-солевого буфера Dulbecco's Buffered (DPBS)ThermoFisher14040182подогреть в 37°; C перед использованием
прибора динамического рассеяния светаZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Вустершир, Великобритания)
Белка крупного рогатого скота фибронектина, плазмыThermoFisher33010018Сделайте стоковый раствор 1 мг/мл с использованием DPBS. Используйте 20-30 & микро; г/мл для покрытия чашки MetTek, 2 часа при 37 °°; C
формальдегид (16%, W/V)ThermoFisher28906Опасный; разбавлять до 4% с использованием DPBS
Эмбриональные клетки почек человека (HEK 293T/17)American Type Culture CollectionATCC® CRL-11268&торговля;
Решение для визуализации живых клеток (LCIS)ThermoFisherA14291DJWarm in 37 °° C перед использованием
MatTek 14 мм # 1.0 покровное стекло вставка для клеточной культуры чашка для культивированияMatTek корпорацииP35G-1.0-14-C
Модифицированная Eagle Medium (DMEM), содержащая 25 мМ HEPESThermoFisher21063045Warm in 37 ° C перед использованием
N-гидроксисульфосукцинимид натриевая соль (NHSS)ThermoFisher24510
Nikon A1si спектральный конфокальный микроскопNikon Instruments
Trypan Blue Stain (0,4%) ThermoFisherT10282смешать в качестве 50% к суспензии клеток перед подсчетом потенциала ячеек
приборZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Вустершир, Великобритания)
Ультразвуковой процессорSonics and Materials IncGEX 600-5
Mini CetntrifugeBenchmarkMini-fuge-04477
PD-10 Sephadex™ G-25 MediumGE Healthcare17-0851-01
Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging SystemBio-RAD76S/07434
Трипсин-ЭДТА (0,25%), феноловый красныйThermoFisher25200056

Ссылки

  1. Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress. Ther. Deliv. 7 (5), 335-352 (2016).
  2. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
  3. Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions. ACS Nano. 3 (10), 3214-3220 (2009).
  4. Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery. ACS Nano. 8 (7), 6986-6997 (2014).
  5. Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy. J. Microsc. 208 (Pt 1), 65-74 (2002).
  6. Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI. Neurobiol Aging. 11 (6), 649-653 (1990).
  7. Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62 (4), 327-351 (2000).
  8. Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12 (9), 333-341 (1989).
  9. Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-20 (1999).
  10. Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
  11. Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry. 97 (4), 329-333 (1992).
  12. Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons. J. Biol. Chem. 274 (31), 21673-21678 (1999).
  13. Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. , 5th, Brooks/Cole Cengage Learning. Belmont, CA. (2013).
  14. Berne, B. J., Pecora, R. Dynamic Light Scattering. , Courier Dover Publications. 41155-41159 (2000).
  15. Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. Basics of FRET Microscopy. , http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html (2016).
  16. Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).
  17. Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells. Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).
  18. Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers. Bioconjug. Chem. 27 (4), 982-993 (2016).
  19. Karve, S., et al. Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8230-8235 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FRETHEK 293T

Похожие статьи