Методическая статья

Подготовка и оценка 99m Tc меченных тридентатной хелатов для предварительной ориентации Использование биоортогональные реакции

DOI:

10.3791/55188

⸱

4 февраля 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем протокол для радиоактивного мечения и in vivo испытаний производных тридентат-99mTc(I) хелат-тетразина для предварительного нацеливания и биоортогональной химии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Предварительное нацеливание в сочетании с биоортогональной химией становится эффективным способом создания новых радиофармпрепаратов. Из доступных методов циклоприсоединение по Дильсу-Альдеру (IEDDA) с обратным электронным спросом между тетразинами с радиоактивной меткой и трансциклооктеном (TCO), связанным с биомолекулой, оказалось высокоэффективным биоортогональным подходом к визуализации конкретных биологических мишеней. Несмотря на то, что технеций-99m остается наиболее широко используемым изотопом в диагностической ядерной медицине, существует дефицит методов получения тетразинов, меченных 99mTc. В данной работе мы сообщаем о получении семейства производных тридентат-хелат-тетразина и их комплексов Tc(I). Эти до сих пор неизвестные соединения были помечены радиоактивной меткой 99mTc с использованием микроволнового метода с радиохимическим выходом от 31% до 83%. Продукты стабильны в физрастворе и PBS и быстро реагируют с производными TCO in vitro. Их способность к предварительному нацеливанию in vivo была продемонстрирована с использованием производного ТСО-бисфосфоната (ТСО-ВР), которое локализуется в областях активного метаболизма костей или повреждения. В исследованиях на мышах 99mТс-тетразины показали высокую концентрацию активности в коленных и плечевых суставах, чего не наблюдалось при проведении экспериментов в отсутствие ТСО-ВР. Общее поглощение в органах, не являющихся мишенями, и фармакокинетика сильно варьировали в зависимости от природы линкера и полярности хелата.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

99m Tc остается доминирующим радиоизотопные используется в диагностической ядерной медицины, с более чем 50 миллионов процедур визуализации , проведенных за год во всем мире 1, 2, 3. Большинство 99m Tc агентов , используемых клинически являются радиофармпрепаратов типа перфузию. Есть ограниченное количество активно целевых соединений , в которых 99m Тс направлен связать конкретную биомаркером через лигирования к конструкции прицеливания. Создание целевых 99m Tc радиофармпрепаратов часто затруднено влиянием 99m Tc-лигандов комплексов на способность целевой молекулы , чтобы связать биомаркера интерес, или изотопы Период полураспада не достаточно долго для использования с более высокими биомолекул молекулярной массой такие как антитела. Последнее, как правило, требует нескольких дней, прежде чем изображения получены для того, чтобы биомолекулы, чтобы очистить от нецелевых Tiss ЕЭС России. Pre-нацеливание предлагает альтернативный подход для преодоления этих проблем.

Предварительно таргетирования в сочетании с биоортогональные реакции было показано, является эффективным способом для разработки новых зондов молекулярной визуализации как для флуоресценции и радио-томографии 4, 5, 6, 7, 8. Реакция обратного спроса электронный Дильса-Альдера (IEDDA) между 1,2,4,5-тетразин (TZ) и транс -cyclooctene (TCO) производных, как показано на рисунке 1, было показано, что особенно эффективным 6. Реакцию IEDDA с этими компонентами могут проявлять быструю кинетику в PBS (K 2 ≈ 6000 M -1 с -1) и высокой селективностью, что делает его идеальным для предварительного таргетинга приложений в естественных условиях 9, 10.

e_content "> Наиболее распространенным подходом включает введение ТСО полученный нацеливающего вектора и после достаточного периода задержки, радиоизотопный тетразин вводят. радиоактивно меченных тетразины на основе 11 C, 18 F, 64 Cu, 89 Zr и 111 In было сообщила 11, 12, 13, 14, 15. в отличие от этого , есть только один отчет о 99m Tc-меченого Тг, который был подготовлен с использованием типа лиганда ГНА , требующую использования сопутствующих лигандов для предотвращения связывания белка и деградации в естественных условиях 16. в качестве альтернативы, мы сообщаем здесь синтез 99m Tc (I) маркированы тетразины с использованием семейства лигандов , которые образуют стабильные тридентатные комплексы с [99m Tc (CO) 3] + ядро.

figure-introduction-1
Рисунок 1: bioorthogonal реакция IEDDA между тетразин и транс - -cyclooctene. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Семейство лигандов , приготовленных содержат тридентатные хелаты , которые различаются по полярности и от природы группы линкера между области связывания металла и Tz (рисунок 2). Цель состояла в том, чтобы идентифицировать 99m Tc-тетразин конструкция , которая может эффективно локализовать и реагировать с TCO-меченых участков в естественных условиях и быстро ясно , когда он не связан, с тем , чтобы принести высокую цель-к-нецелевых коэффициентов. Для тестирования лиганды, ТШО-производное бисфосфоната (ТСО-ВР) использовали 17. Ранее мы показали, что TCO-BP локализуется в областях активного костного метаболизма и может взаимодействовать срадиоактивномеченые тетразины в естественных условиях 18. Это удобный реагент для тестирования новых тетразины, так как он может быть получен в одну стадию, и эксперименты могут быть выполнены в нормальных мышей, где локализация происходит в первую очередь в суставах (колени и плечи).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования на животных были одобрены советом животных по этике исследований в Университете МакМастер в соответствии с Канадским советом по уходу за животными (ССАС) руководящих принципов.

1. радиоактивной из Tz-тридентатных ЛИГАНДАМИ с 99m Tc

ВНИМАНИЕ: Следующие процедуры требуют использования радиоактивных соединений. Работа должна осуществляться только в лицензированной лаборатории с соблюдением техники безопасности и утилизации правил. Реакции Микроволновые следует проводить в микроволновой печи, специально предназначенных для химического синтеза.

  1. Синтез [99m Тс (СО) 3 (H 2 O) 3] + 19, 20
    1. В микроволновую ампулу смешайте 8 мг K 2 [BH 3 CO 2], 15 мг Na 2 CO 3, 20 мг Na 2 B 4 O 7 · 10H 2 O и 25 мг KOCO [СН (ОН)]2 COONa · 4H 2 O. Продуть флакон в течение 10 мин аргоном.
    2. Добавить 4 мл 99m TCO 4 - (~ 1,100 МБк, ~ 30 мКи) в 0,9% -ном солевом растворе в ампулу.
    3. Реакционную смесь нагревают в микроволновой печи в течение 3,5 мин при температуре 110 ° С после 10 с перемешиванием, чтобы обеспечить тщательное смешивание реагентов.
    4. Доводят рН раствора до 3,5-4 с помощью ~ 400 мкл 1 М HCl. Проверка с помощью рН бумаги.
  2. Радиоактивной из тетразин лигандов 1-5
    1. Растворите 2 мг каждого лиганда (соединения 1-5) в 250 мкл МеОН 21.
    2. Добавьте 250 мкл [99m Тс (СО) 3 (H 2 O) 3] + (~ 74 МБк, ~ 2 мКи) к каждому раствору.
    3. Реакционную смесь нагревают с помощью микроволнового течение 20 мин при 60 ° С.
      Примечание: Этот шаг был одинаков для всех 5 тетразинов.
    4. Для получения соединений 2- 5, выпарить растворитель и повторно dissolве полученных продуктов в 1 мл 1: 1 об / об ДХМ: ТФК.
    5. Нагреть растворенные продукты реакции (2-5) при 60 ° С в микроволновой печи в течение 6 мин (2-4) или 10 мин (5).
    6. После охлаждения до комнатной температуры, выпаривают растворитель , используя испаритель (36 ° С, 8 мбар, 3 мин, 6000 оборотов в минуту) и растворяют высушенный соединение в соотношении 1: 1 ACN: H 2 O или 1: 1 MeOH: H 2 O, перед очисткой ЖХВД.
    7. Очищают 99m Tc-меченого соединения (1-5), в том числе отделение меченого продукта от немеченого лиганда тетразин, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (C 18 с обращенной фазой). Как правило, используют градиент элюции 30:70 ACN: H 2 O (оба с 0,1% TFA) до 40:60 ACN: H 2 O в течение 20 мин (18 мин) и аналитической колонке C 18 4,6 х 100 мм. Использование в УФ-области (254 нм) и регистрации гамма.
      1. Возьмите небольшую пробу каждого меченого продукта и сравнить его время удерживания ВЭЖХ, что и со-инъекцected, нерадиоактивного, Re-меченого стандарта (0,125 мг в 20% метанол-H 2 O). Стандартный меченый Повторно идентифицируется в трассировке УФ - ВЭЖХ, и будет элюировать в то же самое время, что и 99m Tc-меченого соединения в γ-ВЭЖХ следа. Это совместное введение показывает пики при сравнимых временах удерживания, подтверждающие личность 99m Tc-меченого соединения.
    8. Выпаривают растворитель из фракций ВЭЖХ с использованием испарителя (36 ° C, 8 мбар, 3 мин, 6000 оборотов в минуту).
    9. Формулирование Очищенное соединение в концентрации 7,4 кБк / мкл в PBS, содержащем 0,5% БСА и 0,01% Tween-80.
    10. Для того, чтобы обеспечить меченые соединения стабильны, выполняют экстракорпорального исследование устойчивости в. Выдержите сформулированное соединение при 37 ° С в течение 1, 4 и 6 ч, вводя небольшое количество (3,7 МБк) смеси на ВЭЖХ в каждый момент времени для оценки стабильности.

2. Предварительно целенаправленные исследования Био-распределительные

    Подготовка животных
    1. Использование 7-9-недельного возраста, женщины-BALB / C мышей (n = 3), введение ТСО-ВР сформулировали в физиологическом растворе (20 мг / кг) (5 мкг / мкл), с помощью в хвостовую вену.
    2. Поместите мышь в физическом устройстве удержания, а также определить вены, расположенные на боковых поверхностях хвоста и протереть тампоном, смоченным спиртом. По прошествии около 2 см от кончика хвоста, вставьте 30 иглы калибра под небольшим углом, параллельно вене. Медленно нажмите на поршень, чтобы впрыснуть, удалить иглу и не применять чистую марлевую губкой в ​​месте инъекции с небольшим давлением до остановки кровотечения.
    3. Через 1 ч после инъекции TCO-BP, администрировать ~ 0,74 МБк (20 мкКи) из 99m Tc-тетразин Сформулированные в 100 мкл 0,5% БСА, 0,01% твин-80 в PBS, с помощью в хвостовую вену.
  1. Исследования Био-распределительные
    1. В желаемый момент времени (Т = 6 ч), анестезию мышей с использованием 3% изофлуран и 2% -ной смеси газообразного кислорода. Продемонстрировать ке снятие щепотка на наркозом мыши, чтобы гарантировать, что они находятся под хирургической плоскости анестезии.
    2. Собирают кровь (1 мл) с помощью пункции сердца с использованием шприца предварительно обработанной гепарином. Место мыши на спине с носом в носовом обтекателе для продолжения анестезии и найти мечевидного отростка на животном.
      1. Вставка 25 G иглу, слегка слева от средней линии животного под мечевидного отростка, под углом 20 °. Полностью вставить иглу, и медленно потяните на себя поршень, чтобы увидеть кровь в ступице иглы, если сердце проколоты. Слегка подрегулировать иглу, удерживая поршень, при необходимости, чтобы проколоть сердце. Медленно потянуть кровь в шприц.
    3. Эвтаназии животное шейным смещением, в то время как под анестезией.
    4. Поместите каждое животное в полиэтиленовый пакет и использовать дозы калибратор (99m Tc установка) для измерения весь уровень активности тела.
    5. Соберите следующие ткани и жидкости в предварительно взвешиватьред считая пробирки: кровь, кости (колено и плечо), желчного пузыря, почек, печени, желудка (с содержанием), тонкий кишечник (с содержанием), толстой кишки и слепой кишки (с содержимым), щитовидной железы и трахею, мочевой пузырь с мочой , и хвост.
    6. Промыть соответствующие ткани (за исключением крови, желчного пузыря и мочевого пузыря) в PBS, чтобы удалить кровь и промокните насухо перед размещением тканей в соответствующих счетных трубок.
    7. Поместите туши животного в полиэтиленовый пакет и измерить остаточную всю активность тела с использованием дозы калибратор.
    8. Взвесить каждую пробирку, содержащую образец ткани. Вычесть начальный вес трубы, чтобы получить массу ткани.
    9. Используйте дозы калибратор (99m Тс настройка) для измерения количества активности в исследуемом образце (100 мкл) в момент впрыска для каждой мыши.
      Примечание: Образец теста равен объему впрыска, таким образом, давая счетчик активности в момент инъекции.
    10. Во время измерения ткани, вliquot 5 мкл тестируемого образца, используемого ранее. Использование мульти-детектора гамма - счетчика (99m Tc настройка) и считать , чтобы получить значение в минуту (CPM) для испытуемого образца 5 мкл.
    11. С помощью двух значений , полученных в 2.2.9 и 2.2.10 , чтобы вычислить активность и отношения СРМ с помощью уравнения 1 , чтобы получить коэффициент преобразования (CPM мкКи -1).
      (1) figure-protocol-1
    12. С помощью гамма-счетчика для измерения количества радиоактивности в каждом образце ткани или жидкости.
    13. С помощью уравнения 1, чтобы вычислить количество активности в каждой ткани или жидкости, во время измерения по отношению к общей вводили дозы. Это значение затем нормализовали по массе органа и выражают в процентном содержании вводили дозы на грамм (т.е.% ID / г) ткани.
    14. Выполните шаги 2.1.2 2.2.13 провести отрицательный контрольный эксперимент с использованием 99m Tc-меченых лигандов тетразин в Absenв.п. ТШО-BP. Жертвоприношение мышей (n = 3) в 0,5, 1, 4 и 6 ч после инъекции и получения ткани или жидкости, как описано выше.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лиганды , были синтезированы с использованием различных сшивающих агентов и энтеросорбенты с помощью простого восстановительного аминирования стратегии (рисунок 2), за которой следует соединение продукта с коммерчески доступным тетразин 22, 23. Радиоактивной проводили с использованием того же метода для всех соединений и был хорошо воспроизводимым. Процесс был оптимизирован путем изменения рН, количество лиганда,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Коллекция тетразина-сшитый тридентатных хелатов различной полярностью был подготовлен, и оценивали полезность их 99m Tc комплексов в реакции IEDDA с производным TCO в естественных условиях. Эффективная и воспроизводимый метод маркировки 99m Tc была разработана для пяти тетразин-хелатов, где концентрация лиганда 10 -3 М. Стадию мечение с последующим удалением защитной группы Т- бутиловых групп (для соединений , 2-5). Высокая концентрация лиганда использо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа поддержана грантом на исследования от Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) Канады, Института исследований рака Онтарио (OICR, #P.SI.015.8) и Канадского онкологического общества (CCS, #703857). Авторы выражают признательность доктору Денису Снайдеру, оказавшему помощь в подготовке рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Газ аргонAlphagaz------
Na2CO3EMD Millipore106395---
Na2B4O7· 10H2OАнахимияS9640---
KNaC4H4O6· 4H2OAnachemia217255---
Technelite 99mTc генератормедицинской визуализации Lantheus---Источник 99mTcO4-
0,9% физиологического раствораLantheus медицинская визуализация---Для элюирования генератора
1 M HClLab Chem------
MeOHCaledon------
ACNКаледон---ВЭЖХ класса
Millipore H2OThermo Fisher ScientificBarnstead Nanopure---
DCMCaledon------TFA
Caledon------
PBSThermo Fisher Scientific10010023pH 7,4 1x
BSASigma AldrichA7906---
Tween80Sigma AldrichP8047---
IsofluraneCDMV108737Поставщик: Fresenius Kabi Animal Health
HPLCWaters1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (артикул # 15590)---
Колонка ВЭЖХ для анализа и очистки соединений 2-4Phenomenex00G-4435-E0Gemini® 5 & micro; м С18 110  Å, LC Колонна 250 х 4,6 мм
ВЭЖХ колонка для анализа и очистки соединений 1 и 5Воды 186003115XBridge BEH C18 Колонна, 130 Å, 5 & микро; m, 4,6 мм x 100 мм
микроволновый реактор Биотаж Инициатор 8---
Biotage V10 ИспарительBiotage Серийный номер # V1041---
Калибратор дозыCapintec, Inc. CRC-25R---
Гамма-счетчикPerkinElmer Wizard 1470 Автоматический гамма-счетчик---
Весы для помещений животных Mettler ToledoXP105 Delta Range---
флаконы для микроволновой печи Биотаж 3556290,5-2 мл 

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jurisson, S. S., Lydon, J. D. Potential Technetium Small Molecule Radiopharmaceuticals. Chem. Rev. 99 (9), 2205-2218 (1999).
  2. Kluba, C. A., Mindt, T. L. Click-to-chelate: Development of Technetium and Rhenium-Tricarbonyl Labeled Radiopharmaceuticals. Molecules. 18, 3206-3226 (2013).
  3. Amato, I. Nuclear Medicines Conundrum. Chem. Eng. News. 87 (36), 58-70 (2009).
  4. Hnatowich, D. J., Virzi, F., Rusckowski, M. Investigations of Avidin and Biotin for Imaging Applications. J. Nucl. Med. 28 (8), 1294-1302 (1987).
  5. Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactivity. J. Am. Chem. Soc. 130 (41), 13518-13519 (2008).
  6. Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Tetrazine-Based Cycloadditions: Application to Pretargeted Live Cell Imaging. Bioconjugate Chem. 19 (12), 2297-2299 (2008).
  7. Rossin, R., et al. In Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice. Angew. Chem., Int. Ed. 49 (19), 3375-3378 (2010).
  8. Zeglis, B. M., et al. Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics. Mol. Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).
  9. Rossin, R., et al. Highly Reactive trans-Cyclooctene Tags with Improved Stability for Diels-Alder Chemistry in Living Systems. Bioconjugate Chem. 24 (7), 1210-1217 (2013).
  10. Rossin, R., Robillard, M. S. Pretargeted Imaging Using Bioorthogonal Chemistry in Mice. Curr. Opin. Chem. Biol. 21, 161-169 (2014).
  11. Denk, C., et al. Development of a 18F-Labeled Tetrazine with Favorable Pharmacokinetics for Bioorthogonal PET Imaging. Angew. Chem., Int. Ed. 53 (36), 9655-9659 (2014).
  12. Herth, M. M., Andersen, V. L., Lehel, S., Madsen, J., Knudsen, G. M., Kristensen, J. L. Development of a 11C-labeled Tetrazine for Rapid Tetrazine-Trans-Cyclooctene Ligation. Chem. Commun. 49 (36), 3805-3807 (2013).
  13. Li, Z., et al. Tetrazine-Trans-Cyclooctene Ligation for the Rapid Construction of 18F Labeled Probes. Chem. Commun. 46 (42), 8043(2010).
  14. Nichols, B., Qin, Z., Yang, J., Vera, D. R., Devaraj, N. K. 68Ga Chelating Bioorthogonal Tetrazine Polymers for the Multistep Labeling of Cancer Biomarkers. Chem. Commun. 50 (40), 5215-5217 (2014).
  15. Zeglis, B. M., et al. A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. J. Nucl. Med. 54 (8), 1389-1396 (2013).
  16. García, M. F., et al. 99mTc-Bioorthogonal Click Chemistry Reagent for In Vivo Pretargeted Imaging. Bioorg. Med. Chem. 24 (6), 1209-1215 (2016).
  17. Russell, R. G. G. Bisphosphonates: The First 40 Years. Bone. 49 (1), 2-19 (2011).
  18. Yazdani, A., et al. A Bone-Seeking Trans-Cyclooctene for Pretargeting and Bioorthogonal Chemistry: A Proof of Concept Study Using 99mTc and 177Lu-Labeled Tetrazines. J. Med. Chem. , (2016).
  19. Alberto, R., et al. A Novel Organometallic Aqua Complex of Technetium for the Labeling of Biomolecules: Synthesis of [99mTc(OH2)3(CO)3]+ from [99mTcO4]- in Aqueous Solution and its Reaction with a Bifunctional Ligand. J. Am. Chem. Soc. 120 (31), 7987-7988 (1998).
  20. Alberto, R., Ortner, K., Wheatley, N., Schibli, R., Schubiger, A. P. Synthesis and properties of boranocarbonate: A convenient in situ CO source for the aqueous preparation of [99mTc(OH2)3(CO)3. J. Am. Chem. Soc. 123 (13), 3135-3136 (2001).
  21. Lu, G., et al. Synthesis and SAR of 99mTc/Re-labeled Small Molecule Prostate Specific Membrane Antigen Inhibitors with Novel Polar Chelates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1557-1563 (2013).
  22. Maresca, K. P., et al. Small Molecule Inhibitors of PSMA Incorporating Technetium-99m for Imaging Prostate Cancer: Effects of Chelate Design on Pharmacokinetics. Inorg. Chim. Acta. 389, 168-175 (2012).
  23. Bartholomä, M. D., et al. Insight into the Mode of Action of Re(CO)3 Thymidine Complexes. ChemMedChem. 5 (9), 1513-1529 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

99mTCO BPin vivo

Похожие статьи