Методическая статья

Простой эритроцит Лизис Метод создании B лимфобластоидная клеточных линий

DOI:

10.3791/55191

⸱

14 января 2017 г.

 ,  , 
1Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, 2Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Простой эритроцитарной метод лизиса для создания B-LCLS была разработана с высокой эффективностью иммортализации, когда требуется небольшое количество крови и экономии времени от начала до криоконсервации.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует ряд методов трансформации В-лимфоцитов вирусом Эпштейна-Барр in vitro в иммортализированные клеточные линии. Мы разработали новый метод с мощной и простой стратегией для создания B-LCL, метод лизиса эритроцитов. Этот метод упростил процедуру разделения PBMC с удалением эритроцитов и использовал всего 0,5 мл цельной крови для создания клеточных линий, иммортализованных ВЭБ, которые могут размножаться до большого количества клеток за относительно короткий промежуток времени со 100% успехом. Метод прост, надежен, экономит время и применим для обработки большого количества клинических образцов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Покоящиеся В-клетки могут быть преобразованы вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ) in vitro в активно пролиферирующие В-лимфобластоидные клеточные линии (B-LCL). B-LCL сходны с половыми клетками по дифференцировке и развитию, а частота соматических мутаций B-LCL составила всего 0,3%1 с незначительными генетическими и фенотипическими изменениями. Таким образом, B-LCL, как суррогаты мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), значительно ускорили прогресс в изучении геномики, транскриптомики и протеомики заболеваний, ассоциированных с ВЭБ2,3. Кроме того, B-LCL также имеют важное применение в скрининге моноклональных антител4,5.

Было разработано несколько методов иммортизации В-лимфоцитов с помощью ВЭБ. Наиболее распространенными процедурами являются выделение В-лимфоцитов и использование клеточных линий B95-8 для производства инфекционного ВЭБ. От выделения до трансформации эти методы делятся на три стратегии. Лимфоциты отделяют от свежей крови методом центрифугирования с градиентом плотности и трансформацией ВЭБ непосредственно6-8, что в данном исследовании называется методом разделения градиента плотности. Тем не менее, другие методы преодолевают трудности доставки свежей крови и используют процедуру замораживания очищенных лимфоцитов и последующего размораживания и инфекции ВЭБ9-11. Криоконсервированная цельная кровь также может быть использована для выделения В-лимфоцитов и трансформации12,13. В дополнение к центрифугированию с градиентом плотности для разделения В-лимфоцитов, некоторые исследователи используют магнитный сортировщик клеток для отбора В-лимфоцитов12. Однако магнитная сепарация является дорогостоящим, сложным и трудоемким процессом. Несмотря на то, что эти методы полезны для увековечивания В-лимфоцитов с высокой вероятностью успеха, необходимость лечения большого количества клинических образцов и относительно небольшой объем крови требуют более простого метода для создания постоянной клеточной линии.

Другим менее часто используемым методом является использование цельной крови в качестве источника ядросодержащих клеток для инфекции ВЭБ и создания B-LCL. Эти методы упрощают технику, исключая процедуру разделения. Для получения клеточных линий достаточно лишь небольшого количества цельной крови, либо свежей14, либо замороженной15,16. К сожалению, существуют большие различия в успехах документов15, 16 и нескольких наших проверочных тестов. Кроме того, трансформированные колонии с трудом распознаются под микроскопом из-за большого количества загрязняющих примесей. Таким образом, требуется более надежный метод преобразования.

Основываясь на вышеизложенных соображениях, мы разработали новый метод для создания B-LCL без предварительной очистки лимфоцитов, названный методом лизиса эритроцитов. Этот способ удобен, экономит время и применим к большому количеству образцов. Всего 0,5 мл цельной крови было достаточно для получения B-LCL, которые легко получить от младенцев и пожилых людей без существенного вреда для их здоровья.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данное исследование было одобрено Комитетом по этике Института генетики и биологии развития путем, и протокол следует институциональные принципы для благосостояния человека.

1. Получение EB вируса

  1. На 1-й день, оттаивают В95-8 клеток и культуры в 6 мл полной среды RPMI-1640, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина и антибиотиками (100 мкг / мл стрептомицина, 100 ед / мл пенициллина) в T25 культуры колбу. Место культуры колбу в 5% CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° C.
  2. На 2-й день, наблюдать морфологии клеток под микроскопом. Клетки находятся в хорошем состоянии, когда они яркие и круглые. Добавляют 10 мл полной среды RPMI 1640.
  3. На 4-й день, добавить 10 мл свежей полной RPMI 1640, а затем переносят в колбу T75 культуры.
  4. На 8-й день, добавить 20 мл полной среды RPMI 1640.
  5. Поддерживать клетки в течение 8 дней без добавления свежей среды, то есть голодание.
  6. На 16-й день, наблюдать клеткинаблюдали под микроскопом. Сбор клеток в 15 мл центрифужную пробирку, 12 мл / трубки.
  7. Криотерапевтические сохраняют при -80 ° С в течение 1 ч, а затем быстро оттаивают при 37 ° С. Повторите 3 раза, пока вирусные частицы не будут выпущены из клеток.
  8. Центрифуга при 240 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
  9. Фильтр супернатант через фильтр 0,22 мкм, аликвоты 12 мл / пробирку и хранят при -80 ° С.

2. Лечение цельной крови с эритроцитарной лизирующего буфера

  1. Добавить 0,5 мл цельной крови с антикоагулянтом ЭДТА · K 2 в пробирку 15 мл.
  2. Положите 1 мл красных кровяных клеток лизис буфера (отфильтрованную фильтром 0,22 мкм и оттаивали до комнатной температуры перед использованием) в цельной крови и хорошо перемешать. Поместите смесь при комнатной температуре в течение 4 мин. Затем добавляют 5 - 7 мл 1X PBS быстро до остановки реакции.
  3. Центрифуга при 240 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Белые клетки крови будут осаждаться в нижней части трубы.
  4. Жидкость над осадком сливают и промывают осаждение добавлением 7 мл 1640 основной среде. Центрифуга в течение 5 мин при 240 мкг при комнатной температуре. Повторите дважды.
  5. Ресуспендируют осадок клеток в 300 мкл среды превращения (RPMI 1640, содержащей 20% фетальной бычьей сыворотки и 10 мкг / мл фитогемагглютинином (PHA)).

3. EBV инфекции

  1. Добавить 60 мкл 20 мкг / мл циклоспорина А (CsA) к клеточной суспензии.
  2. Быстро разморозить аликвоты EBV при 37 ° С. Добавить 240 мкл EBV к клеточной суспензии.
  3. Тщательно перемешать и поместить суспензии клеток в 96-луночный планшет, по 200 мкл на лунку. Для того, чтобы избежать испарения, добавить 200 мкл 1X PBS в каждую лунку вокруг 96-луночного планшета. Поместите пластину в 5% CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° С.

4. Расширение и Криосохранение B-LCLS

  1. Изменение половины среды один раз в неделю в течение первого месяца после EBV-инфекции. Только толстый Лэг фрагментов клеток видна под микроскопом на 7 -й день (рисунок 2). Через один месяц EBV инфекции, лимфобластоидные клеточные кластеры видны под толстым слоем клеточных фрагментов под микроскопом (рисунок 2).
  2. Изменение половину среды каждые 3 дня до тех пор , клеточные кластеры четко видны под микроскопом (рис 2). Как правило, этот процесс занимает от 10 до 20 дней.
  3. После смешивания пипеткой клетки и передавать на 24-луночный планшет. Двойной объем культуральной среды с полной RPMI 1640 в то время как он становится желтым. Этот процесс зависит от скорости роста клеток.
  4. Затем перенести клетки в T25 культуры колбу. Двойной объем культуральной среды, как он становится желтым, пока объем среды не расширяется до 10 - 15 мл.
  5. Изменение средних за 24 ч до замораживания. Суспензию клеток Центрифуга в течение 5 мин при 240 х г. Граф клеток с помощью счетчика клеток и заморозить при плотности 5 - 10 х 10 6 / мл в патенте Францииозен маточный раствор, содержащий 90% FBS и 10% диметилсульфоксида (ДМСО). Замораживание со скоростью 1 ° С в мин до -80 ° С, а затем передавать непосредственно в жидкий азот.

5. 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенил-тетразолия бромида (МТТ) 17

  1. Подготовка суспензии отдельных клеток В-LCLS с 1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Семенной 3 х 10 4 клеток на лунку на 96-луночный планшет , по 100 мкл на лунку.
  2. Поместите пластину в 5% CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 12 - 16 ч.
  3. Добавить МТТ (5 мг / мл) в лунки, в которой клетки растут и держать в защищенном от света в течение 4 ч при 37 ° С.
  4. клеточная пластинка Центрифуга в течение 10 мин при 168 х г.
  5. Удалить супернатант и добавляют 100 мкл ДМСО на лунку.
    Примечание: Будьте осторожны. Не прикасайтесь к игольчатые кристаллы красителя.
  6. Встряхните пластину в течение 10 мин при низкой скорости, чтобы полностью растворить кристаллы.
  7. Поглощение Измерить при 570 нмс использованием микропланшет-спектрофотометра.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В процессе трансформации, морфологические изменения клеток визуализируют с помощью световой микроскопии (рис 2). Небольшие скопления клеток были хорошо видны с градиентным методом сепарации по плотности через 7 дней после заражения, в то время как только толстый слой клеточных фрагментов видны из метода лизиса клеток красной крови. Однако лимфобластоидные клеточные кластеры видны под толстым слоем осколков клеток через 30 дней после заражения. С более частой сменой среды...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы сообщаем о разработке нового способа для иммортализации B-клеток человека из цельной крови путем растворения красных клеток крови, и его жизнеспособность клеток развившегося В-LCLS оценивали с помощью МТТ-анализе. Результаты показали, что жизнеспособность клеток В-LCLS устанавливается методом лизиса эритроцитов в крови значительно выше, чем у метода градиента плотности разделения. Основное преимущество метода лизиса красных кровяных телец, является то, что она проста и требует небольшого объема (всего лишь 0,5 мл) кр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана ключевыми проектами Китайской академии наук (KFZD-SW-205), системой поддержки технологий стратегических биологических ресурсов Китайской академии наук (CZBZX-1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ЦентрифугаTechcompCT6TЦентрифугирование
Автоматизированный счетчик ячеек Countstar  IC 1000 Для подсчета клеток 
Микропланшетный спектрофотометрBioTek InstrumentsSN263839Для измерения абсорбции
96 лунок кластер клеточных культурCorning Incorporated3599Полистирольные пластины
24 лунки кластер клеточных культурCorning Incorporated3524Полистирольные пластины
25 см2 колба для клеточных культурNest707001полистирол& НБСП;
FBSGibco10270Компонент B-LCL средний
RPMI Medium 1640Gibco31800-022Для B-LCL средний
L-глутамин   Amresco0374Компонент среды B-LCL
100x стрептомицина пенициллина раствор BioRoYeeBRY-2309BioRoYeeBRY-2309Компонент среды B-LCL
Ficoll paque plusGE  Здравоохранение17-1440-03Для выделения in vitro выделение лимфоцитов
PHA-MSigmaL8902Для стимуляции пролиферации лимфоцитов
циклоспорин АКаймановы острова Химическоевещество 12088Для ингибирования цитотоксичного эффекта Т-клеток
Буфер для лизиса эритроцитовTiangenRT122-01Для лизирования эритроцитов
MTT Amresco0793Для определения жизнеспособности клеток
DMSOSigmaD2650Для замораживания клеток

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mohyuddin, A., et al. Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines. Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).
  2. Hu, V. W., Frank, B. C., Heine, S., Lee, N. H., Quackenbush, J. Gene expression profiling of lymphoblastoid cell lines from monozygotic twins discordant in severity of autism reveals differential regulation of neurologically relevant genes. BMC Genomics. 7, 118(2006).
  3. Toda, T., Sugimoto, M. Proteome analysis of Epstein-Barr virus-transformed B-lymphoblasts and the proteome database. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 197-206 (2003).
  4. Chiorazzi, N., Wasserman, R. L., Kunkel, H. G. Use of Epstein-Barr virus-transformed B cell lines for the generation of immunoglobulin-producing human B cell hybridomas. J Exp Med. 156 (3), 930-935 (1982).
  5. Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
  6. Hussain, T., Kotnis, A., Sarin, R., Mulherkar, R. Establishment & characterization of lymphoblastoid cell lines from patients with multiple primary neoplasms in the upper aero-digestive tract & healthy individuals. Indian J Med Res. 135 (6), 820-829 (2012).
  7. Neitzel, H. A Routine Method for the Establishment of Permanent Growing Lymphoblastoid Cell-Lines. Hum Genet. 73 (4), 320-326 (1986).
  8. Oh, H. M., et al. An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes. Cell Prolif. 36 (4), 191-197 (2003).
  9. Louie, L. G., King, M. C. A Novel-Approach to Establishing Permanent Lymphoblastoid Cell-Lines - Epstein-Barr-Virus Transformation of Cryopreserved Lymphocytes. Am J Hum Genet. 48 (3), 637-638 (1991).
  10. Tremblay, S., Khandjian, E. V. Successful use of long-term frozen lymphocytes for the establishment of lymphoblastoid cell lines. Clin Biochem. 31 (7), 555-556 (1998).
  11. Reidy, J. A., Wheeler, V. A. Sample age and Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 28 (6), 383-384 (1992).
  12. Amoli, M. M., Carthy, D., Platt, H., Ollier, W. E. R. EBV immortalization of human B lymphocytes separated from small volumes of cryo-preserved whole blood. Int J Epidemiol. 37, suppl 1 41-45 (2008).
  13. Lacelle, C., Wang, E. Establishing lymphoblastoid cell lines from frozen blood of extremely old individuals. Mech Ageing Dev. 123 (10), 1415-1418 (2002).
  14. Tohda, H., Oikawa, A., Kudo, T., Tachibana, T. A greatly simplified method of establishing B-lymphoblastoid cell lines. Cancer Res. 38 (10), 3560-3562 (1978).
  15. Ventura, M., et al. Use of a Simple Method for the Epstein-Barr Virus Transformation of Lymphocytes from Members of Large Families of Reunion Island. Hum Hered. 38 (1), 36-43 (1988).
  16. Chenevixtrench, G., Kerr, B., Walters, M. Lymphoblastoid Cell-Lines from Frozen Whole-Blood - a Quick and Economical Safeguard for Linkage Analysis. Am J Hum Genet. 46 (1), 635-636 (1990).
  17. Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-Examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell-Growth Cell Kill. J Immunol Methods. 119 (2), 203-210 (1989).
  18. Bogoslovsky, T., et al. Preservation and enumeration of endothelial progenitor and endothelial cells from peripheral blood for clinical trials. Biomark Med. 9 (7), 625-637 (2015).
  19. Ambach, A., Bonnekoh, B., Gollnick, H. Routine flow cytometric immuno-staining of T-cell perforin is preserved using diethylene glycol for erythrocyte-lysis but lost by the use of ammonium chloride. Exp Dermatol. 12 (6), 825-831 (2003).
  20. Beck, J. C., Beiswanger, C. M., John, E. M., Satariano, E., West, D. Successful transformation of cryopreserved lymphocytes: A resource for epidemiological studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 10 (5), 551-554 (2001).
  21. Tosato, G., Cohen, J. I. Generation of Epstein-Barr Virus (EBV)-immortalized B cell lines. Curr Protoc Immunol. , Chapter 7, Unit 7 22(2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

EBVMTTEBV

Похожие статьи