Методическая статья

Локальное поле флуоресцентной микроскопией: Визуализация клеточных сигналов в интактных сердцах

DOI:

10.3791/55202

⸱

8 марта 2017 г.

 ,  ,  , 
1School of Natural Sciences, University of California, Merced, 2Centro de Investigaciones Cardiovasculares, Universidad de la Plata and Conicet, 3Facultad de Ingenieria, Universidad Nacional de Entre Rios, 4Department of Physiology, Midwestern University, 5School of Engineering, University of California, Merced

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В самом центре, молекулярные события координировать электрическую и сократительную функцию органа. Набор локальных методов микроскопии поля флуоресценции, представленные здесь позволяет записывать клеточных переменных в интактных сердцах. Выявление механизмов, определяющих функцию сердца имеет решающее значение для понимания того, как сердце работает в патологических ситуациях.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В сердце, исследования молекулярной сигнализации, как правило, выполняются в изолированных миоцитов. Тем не менее, многие патологические состояния, такие как ишемия и аритмий могут быть полностью поняты только на уровне целого органа. Здесь мы представляем метод спектроскопический локального поля флуоресцентной микроскопии (LFFM), что позволяет измерять клеточных сигналов в интактном сердце. Методика основана на комбинации Лангендорфа перфузию сердца и оптических волокон для записи флуоресцентные сигналы. LFFM имеет различные приложения в области сердечно-сосудистой физиологии для изучения сердца при нормальных и патологических состояниях. Несколько переменных сердца можно контролировать с помощью различных флуоресцентных индикаторов. К ним относятся цитозольного [Ca 2+], внутрисуставной саркоплазматического ретикулума [Ca 2+] и мембранных потенциалов. Экзогенные флуоресцентные зонды возбуждаются и излучаемый флуоресценции обнаружена с тремя различными расположений техники LFFM эпифлуоресцентнойы представлены в этой статье. Центральные различия между этими методами являются тип источника света, используемого для возбуждения и на пути света возбуждения модулируется. Импульсный LFFM (PLFFM) использует лазерные световые импульсы во время непрерывной волны LFFM (CLFFM) использует непрерывный лазерный луч для возбуждения. Наконец, светоизлучающие диоды (СИД) были использованы в качестве третьего источника света. Это некогерентного расположение называется импульсно светодиодной флуоресцентной микроскопии (PLEDFM).

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сердце является центральным органом сердечно-сосудистой системы. Сокращение сердца инициируется увеличением внутриклеточного [Са 2+]. Взаимосвязь между электрической возбудимости и изменения внутриклеточного высвобождения Ca 2+ исторически изучены в ферментативно диссоциированных клеток 1, 2. Тем не менее, кардиальные клетки электрически, метаболически и механически соединены 3, 4. Когда изолированный, миоциты не только физически отсоединен, но миоциты из разных слоев смешиваются при диссоциации 5. Кроме того, несмотря на огромные преимущества, которые возникли из исследования изолированных клеток под напряжением условий зажима, 6, 7, 8 внутренняя природа сердца как электрический синцитий AlwaYS ставит вопрос о том , как функционально отличается диссоциированы клетки от присутствующих в ткани 3.

В этой рукописи, мы описываем успехи, полученные в познании физиологии сердца с использованием локального поля флуоресцентной микроскопии методами (LFFM) в интактном сердце. LFFM использует флуоресцентные индикаторы для измерения нескольких физиологических переменных , таких как цитозольного Ca 2+, внутри саркоплазматического ретикулума (СР) Са 2+ и мембранного потенциала. Эти измерения могут быть получены одновременно и в сочетании с желудочковой давлением 9, 10, 9, электрокардиограммы электрических потенциалов действия (AP), ионный ток записи и флеш - фотолиза проарретированных соединений 4, 11. Кроме того, эти измерения могут быть получены путем стимуляции интактного сердца на более высоких частотах, близкихг к физиологическим ставкам. Хотя несколько статей 9, 11, 12, 13, 14 были опубликованы нашей группой с использованием методов LFFM, презумпция технических сложностей , связанных с этой техникой предотвратил ее массовое использование при изучении естественных физиологических бывших явлений в сердце и других органах.

Методика LFFM (рис 1) основано на результатах измерений , полученных с использованием эпифлуоресцентной многомодовое оптическое волокно , находящийся в контакте с тканью. Как и любой другой метод визуализации контактная флуоресценции, оптическое разрешение зависит от диаметра и числовой апертуры (NA) оптического волокна. Более высокое NA и меньший диаметр волокна увеличится пространственное разрешение измерений. НСБУ и диаметры волокон может находиться в диапазоне от 0,22 до 0,66 и от 50 мкм до 1 мм, соответственно. Всморщиванию НС улучшит отношение сигнал-шум (S / N), принимая фотоны, приходящие от большего телесного угла. Для того, чтобы выступать в качестве эпифлуоресцентной устройства, световой луч фокусируется в оптическое волокно с асферической линзой или объектива эпифлуоресцентной где NA линзы и матч волокна. Такое согласование максимизирует передачу энергии для возбуждения и сбора обратно фотоны, испускаемые флуорофором.

Для возбуждения экзогенные флуоресцентные индикаторы, загруженному в ткани, различные источники света и режимы освещения могут быть использованы. Наши новаторские исследования с использованием импульсного локального поля флуоресцентной микроскопии 3, 12 (PLFFM) использовали пикосекундного лазера низкой стоимости (Рисунок 1a, PLFFM). Этот тип источника света имеет огромное преимущество захватывающем большой доли молекул флуорофора под области освещения без существенного отбеливания красителя из-зана короткий длительностью импульса 12. Кроме того, использование ультракоротких импульсов позволило оценку жизни флюоресценции красителя 12. Время жизни флюоресценции является свойством , которое может быть использовано для количественного определения фракции молекул красителя , связанного с Са 2+. К сожалению, временное дрожание импульсов и вариации амплитуды от импульса к импульсу ограничить применение этой экспериментальной стратегии в тех случаях, когда изменение флуоресценции получают путем связывания лиганда с красителем велико.

Непрерывного действия (НД) лазеры обычно используются в качестве основного источника освещения в LFFM (рисунок 1b, CLFFM). Лазерный луч может непрерывно освещать ткани или может быть сегнетоактив- модулированный. Сегнетоактивное модуляция пучка позволяет генерировать микросекунд импульсами света. Эта модуляция может управляться внешним оборудованием. Эта процедура не только значительно снижает Tон височной дрожание световых импульсов, но и позволяет микшировать пучки различных длин волн. Смешивание пучков осуществляется мультиплексирование лучей от различных лазеров. Как следствие, множественные красители , имеющие различные спектральные свойства могут возбуждаться проводить измерения различных физиологических переменных, например, Rhod-2 для цитозольного Ca 2+, MagFluo4 внутрираздельный SR Ca 2+ и ди-8-ANEPPS для мембранный потенциал.

Хотя лазеры представляют различные преимущества как источник света в LFFM, другие типы источников света могут быть использованы в том числе светодиодов (LED). В этом случае источник света возбуждения состоял из InGaN светодиода (фиг.1С, PLEDFM). В светодиодах, фотоны спонтанно испускается, когда электроны из зоны проводимости рекомбинируют с дырками в валентной зоне. Отличие твердотельных лазеров является то, что излучение не стимулируется другими фотонами. Это приводит к некогерентного пучка иболее широкий спектральный выбросов для светодиодов.

могут быть использованы различные типы светодиодов высокой мощности. Для записей AP , используя ди-8-ANEPPS и Са 2+ , записанные с помощью Fluo-4 или Mag-Fluo-4, мы использовали светодиод , который имеет характерный пик излучения при 485 нм (синий) и половину ширины 20 нм (Рисунок 1d). Са 2+ , записанных с Rhod-2, светодиод имел типичный пик излучения при длине волны 540 нм (зеленый) и половину ширины 35 нм (рис 1d). Светодиоды излучают в диапазоне длины волны, и, следовательно, требуют фильтров, чтобы сузить спектральную излучение. Кроме того, импульсный свет может быть сформирован в размере 1,6 кГц с длительностью 20 мкс. СИДов импульсно быстрого питания MOSFET полевого транзистора. Одновременные записи с различными индикаторами могут быть выполнены с помощью временного мультиплексирования светодиодов. К сожалению, свет, испускаемый светодиодами труднее сосредоточиться на волоконно-оптический по сравнению с лазерным лучом. Таким образом, основным недостатком насING светодиодов является то, что их профили излучения имеют угловые смещения (± 15 °) от главной оси, а вспомогательный оптический должен использоваться, чтобы исправить ее.

Во всех оптических конфигураций, описанных ранее, возбуждающий свет отражается с помощью дихроичного зеркала. Пучок затем фокусировалось асферической линзой и объектив микроскопа на многомодового оптического волокна, который расположен на ткани. Как и в любом расположении эпифлуоресцентной, дихроичных зеркал также служит для отделения возбуждения от испускаемого света. Излучаемый световой спектр проходит обратно через барьерный фильтр для удаления любого отраженного возбуждения. И, наконец, излучаемый свет фокусируется объективом на фотодетектор (рисунок 1).

Трансдукция от света электрического тока осуществляется кремниевых лавинных фотодиодов. Эти диоды имеют быстрый отклик и высокую чувствительность, позволяя обнаружения низкой освещенности.фототок , вырабатываемые лавинных фотодиодов могут быть усилены двумя способами: усилитель , имеющий трансимпедансный резистивный элемент обратной связи (рисунок 1д) или с помощью интегратора для преобразования тока в напряжение (рис 1F). С помощью первого подхода, выходное напряжение пропорционально фототока и резистора обратной связи. Типичный пример резистивного обнаружения пикосе- лазерных импульсов показана на рисунке 2а, 2b и 2с. Панель 2a иллюстрирует выход усилителя трансимпедансного и панель 2b показывает расширение времени интервала , указанного звездочкой (*). Алгоритм отслеживания пик был реализован для обнаружения пика (красный) и основание (зеленый) для флуоресцентных ответов 12. Измерение базовой флуоресценции дает информацию как темнового тока лавинного фотодиода и помех, введенную окружающей среды осветиХТ и электромагнитное взаимодействие. Представление пиков и оснований показана на рисунке 2в. Этот рисунок иллюстрирует флуоресценции красителя (Rhod-2) , связанного с Са 2+ во время сердечного цикла бьющееся сердце Попугай.

Во втором способе, выходное напряжение интегратора является функцией текущей и емкостной обратной связью (рис 2d, 2e и 2f). Рисунок 2f показаны два последовательных циклов интеграции: первый без внешнего освещения , а второй с прикладными световыми импульсами от импульсного светодиода. Подробное описание представлено на рисунках 2g и 2h. Такой подход, хотя и более трудоемким, обеспечивает больший S / N из-за отсутствия теплового шума в конденсатор обратной связи. Прибор включает в себя стадию синхронизации, которая генерирует все управление и мультиплексирование возбуждающего света и команд интеграции headstage и ресЕТ периоды. Это, как правило , выполняется с блок обработки цифрового сигнала , который также выполняет цифровую дифференциацию интегрированного выходного сигнала путем вычисления на линии регрессии данных. В случае использования резистивный обратной связи, любой A / D плата сбора может быть использован.

И, наконец, наша техника LFFM является универсальным и может быть адаптирован для записи с более чем одной области. Добавление расщепитель луча на пути прохождения света позволяет разделить свет на два оптических волокна. Каждое оптическое волокно затем могут быть размещены на различных областях ткани, чтобы, независимо друг от друга, возбуждают и записывать излучение от экзогенных флуоресцентных зондов. Эта модификация позволяет оценить, как анатомическое региональные различия влияют на физиологические переменные. На рисунке 3 показан делитель луча используется для того разделения возбуждающего света CW таким образом, что два оптических волокна используются для измерения электрического трансмурального или внутриклеточным [Са 2+] Уровни Witч незначительной инвазии. Трансмуральных сигналы могут быть записаны путем размещения одного волокна на эндокарда, а другой на эпикарда слой стенки желудочков. Таким образом, метод LFFM имеет возможность измерять временной ход клеточных сигналов в разных регионах и могут быть использованы для тестирования, если региональные изменения происходят при патологических ситуациях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол и все обработки мышей был одобрен Institutional уходу и использованию животных комитета UC Мерсед (№ 2008-201) путем. Были проведены эксперименты с попугаи в 1999 году в соответствии с общей политикой для использования животных, установленной научной комиссией венесуэльского института научных исследований (IVIC).

1. Langendorff Set Up Подготовка

  1. Приготовьте раствор Тироде , содержащий следующие концентрации растворенных веществ в мм: 140 NaCl, 5,4 KCl, CaCl 2 2, 1 MgCl 2, 0,33 Na 2 HPO 4, 10 глюкозы, 10 HEPES. Доводят рН раствора Тироде до 7,4 с помощью NaOH и фильтруют раствор через фильтр с размером пор 0,22 мкм.
  2. Загрузите раствор Тироде в 60 мл шприцев и все трубы горизонтального Langendorff настройки 11, 12 , показанную на рисунке 4. Убедитесь в том, чтобы устранить все пузырьки воздуха.
  3. уравновешивания Tyrode раствор со 100% O 2 с помощью погружного пластиковый "воздух камень" , как показано на рисунке 4.
    1. Подсоедините пластмассовую трубку к O 2 танка.
    2. Добавьте пластмассовый переходник тройник опустить "трубу 5 в раствор Тироде в 60 мл шприц.
    3. Приложить пластиковый камень воздуха до конца "трубы 5 так O 2 будет пузыриться из в раствор Тироде.
  4. Поместите нерассасывающегося хирургический шовный материал вокруг иглы, используемой в качестве канюли. Игла соединена с коллектором (смотри рисунок 4) , что позволяет ретро-перфузию с различными растворами. Наконец, аорта сердца будет канюлю в иглу.

2. Подготовка животных и сердца Вскрытие

  1. Взвешивание и впрыснуть мышь с гепарином (напр. Мышь весом 20 г, вводят 20 единиц или 200 мкл) за 15 мин до эвтаназии путем смещения шейных позвонков. Обезболить попугаи по то направляющие использования животных вашего протокола IACUC, а затем приступить к цервикальной дислокации.
    Примечание: Используйте 8 недель мышей или 20 г попугаи.
  2. Удалите сердце из грудной полости после euthanization. Экстракт Parakeet сердца точно таким же образом , как описано для мышей.
    1. Очистите грудь мыши с этанолом.
    2. Использование рассечение ножницами, сделать надрез в нижней части живота, а затем разрезали стороны в сторону шеи.
    3. Отойдите вырезанной ткани и пин-код его вниз.
    4. Вырезать диафрагму. Будьте осторожны при резке диафрагму, чтобы избежать повреждения сердца.
    5. Удалите легкие и окружающие ткани.
    6. Используйте пинцет, чтобы выкопать сердце не сдавливая его. Вырезать аорту как можно дольше.
  3. Транспорт сердце на небольшой лодке с взвешивании приблизительно 1 мл раствора Тироде.
  4. Используя нерассасывающегося хирургический шовный материал, связать аорту на горизонтальную Лангендорфа устройство черезигла. Tie сердечную аорту с помощью двух тонких пинцетом. Начало ретро-перфузию, открыв клапан, расположенный последовательно с 60 мл шприцев, содержащих раствор Тироде.
  5. Дайте сердце для стабилизации в течение 10 мин. Используйте это время, чтобы очистить кровь и жировой ткани, окружающие сердце перед загрузкой красителя. Вытяните жировой ткани у основания сердца с помощью пинцета и вырезать с помощью небольших рассечение ножницами. Не забудьте сделать это под видом рассекает микроскопа.

3. Цитозольные Ca 2+ Размеры: Готовимся Dye Rhod-2АМ

  1. Добавьте 20 мкл 20% Pluronic (неионное поверхностно-активное вещество) в ДМСО в специальном упакованном пластиковом флаконе, предоставленного производителем красителя, содержащего 50 мкг красителя.
  2. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз, избегая пузырьков.
  3. Перенести смешанный ДМСО с неионным поверхностно-активным веществом и красителем из специального упакованной пластиковой пробирке в прозрачный стеклянный флакон. Добавить 1 мл Тироде Солуние к прозрачному стеклянном флаконе.
  4. Разрушать ультразвуком в течение 15-20 мин в ванну для обработки ультразвуком.
  5. Заливать краску с помощью перистальтических насосов в течение 30 мин при комнатной температуре.
    1. Поместите краситель в камере красителя.
    2. Используйте механический зажим, чтобы сжать все другие линии трубок, подключенных к коллектору. Зажим находится над коллектором. Это предотвратит обратный поток в трубку, подключенный к 60 мл шприцы.
    3. Включите перфузионного перистальтический насос, чтобы начать циркуляцию краситель. Немедленно закройте 3-ходовой клапан ниже 60 мл шприца.
    4. Поместите маленькую трубку, которая соединена с всасывающим перистальтического насоса, рядом с сердцем рециркуляцию краситель, который был перфузии в сердце.

4. Intra-SR Ca 2+ Размеры: Подготовка Dye Mag-Fluo4AM

  1. Подготовить Mag-Fluo4AM таким же образом, как Rhod-2АМ. Обратитесь к разделу 3 для ступенчатых инструкции.
  2. Afteг загрузки красителя, открыть клапан, расположенный последовательно с 60 мл шприцев, содержащих раствор Тироде, чтобы начать ретро-перфузию. Не забудьте снять зажим над коллектором.
  3. Добавить раствор Тироде в горизонтальной камере и нагреться до 37 ° С.
  4. Ретро-заливать раствором Тироде в течение 45 мин, чтобы удалить цитозольного краситель.

5. Мембранный потенциал Размеры: Готовимся Dye Di-8-ANEPPS

  1. Добавляют 5 мл 99% -ного этанола в пузырьке краситель, который содержит 5 мг красителя.
  2. Алиготе 10 мкл в 500 отдельных 1 мл пластиковые флаконы с использованием ретранслятора пипетки.
  3. Высушиванию в вакууме скорости и хранят при -20 ° С.
  4. Добавить 20 мкл 20% Pluronic в ДМСО до пластиковом флаконе 10 мкг высушенной красителя.
  5. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз, избегая пузырьков.
  6. Перенести смесь, содержащую ДМСО с Pluronic и красителем из пластикового флакона в градуированный цилиндр (10 мл). Добавить раствор Тироде до конечной В.О.Луме 5 мл.
  7. Разрушать ультразвуком в течение 20-25 мин в ванну для обработки ультразвуком.
  8. Заливать в сердце в течение 30 мин с помощью перистальтических насосов. Обратитесь к пошаговым инструкциям в разделе 3.5.

6. Запись эпикардиального сигналов

  1. После загрузки красителя, ретро-заливать сердце с раствором Тироде путем удаления зажима над коллектором. Открыть кран, расположенный последовательно с 60 мл шприц, содержащий раствор Тироде. Ретро-заливать раствор Tyrode в течение 10 мин, чтобы стабилизировать сердце.
  2. Заполните горизонтальную камеру с раствором Тироде и включите устройство Пельтье, чтобы довести температуру ванны до 37 ° С.
  3. Поместите оптического волокна на поверхности сердца.
    1. Поместите оптоволокно внутри пипеткой 2 мл, а затем прикрепить пипетку микроманипулятора.
    2. С помощью микроманипулятор слегка нажмите оптического волокна к поверхности левого желудочка.
  4. Внешне темп НЕАк.т. с стимулятора под контролем генератора волн.
    1. Программирование генератор волн, чтобы обеспечить прямоугольный импульс с шириной 1 мс.
    2. Установите стимулятора, чтобы быть внешне синхронизированный и подключить внешний источник сигнала к генератору волн.
    3. Для каждого выхода стимулятора, подключить провод с иглоукалыванием иглы припаян в конце.
    4. Поместите обе акупунктурные иглы в верхушке сердца примерно 3 мм друг от друга.
    5. Только после того, как иглы помещены в ткани, включите на выходе стимулятора для предотвращения поражения электрическим током.
  5. В программном обеспечении сбора, настроить частоту сбора до 10 кГц.

7. Запись Эндокардиальный сигналов

  1. Обратитесь к шагу 6.1 и 6.2, чтобы стабилизировать сердце после загрузки красителя.
  2. Используя острый 23Ga пункт о размере оптического волокна, сделать небольшое отверстие в поверхности сердца в ЛЖ возле перегородки.
  3. Поместите интравитреально адаптер хирургии склеротомия, чтобы помочь в размещении первого оптического волокна в эндокарда с помощью микроманипулятора.
  4. Внешне расхаживать сердце. Обратитесь к шагу 6.4.
  5. В программном обеспечении сбора, настроить частоту сбора до 10 кГц.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AP и Са 2+ в эндокарда и эпикарда

Для сравнения сигналов через стенку желудочка, один волоконно-оптический позиционируется в эндокарда, а другой в эпикарда. Сравнивая морфологию AP, записанной от эндокарда с одним из эпикарда является лучшим способом оценить трансмурального функцию. Стенки желудочков является весьма гетерогенным и, таким образом, морфология ЛПВ сильно ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта статья сосредоточена в описании локальных методов поля флуоресценции оценить функцию кардиомиоцитов бывших естественных условиях. Изучение этих клеток в сочетании среде не только более физиологические, но также очень подходит для оценки патологии органа уровня. Клеточные события , лежащие в основе возбуждения сжатия муфты (ECC) может быть оценена на уровне целого органа с использованием молекулярных зондов , которые осуществляют мониторинг внутриклеточного Са 2+ динамики (Rhod 2 цитозольного Ca <...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим доктора Алисии Mattiazzi для критического обсуждения представленной работы. Эта работа была поддержана грантом от NIH (R01 HL-084487) для ALE.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Хлорид натрияSigma7647-14-5
D-(+)-глюкозаSigma50-99-7
Хлорид калияSigma7447-40-7
HEPESSigma7365-45-9
Фосфат натрияSigma10049-21-5
Раствор хлорида кальцияSigma10043-52-4
Раствор хлорида магнияSigma7786-30-3
Гидроксид натрияSigmaS-8045
0,2 μ м нейлоновый мембранный фильтрватман7402-004
коллектор MPPWarner64-0216 
21G1.5 Прецизионная скользящая иглаB-D305167
Черная плетеная шелковая нить (нерассасывающийся хирургический шов)AllMech TechLOOK-SP105
Гепарин натрия для инъекций 1000USP/млAllMech TechNDC63323-540-11
DMSO D8779Sigma67-68-5
BlebbistatinSigma856925-71-8
Pluronic F-127 20% растворBiotium59004
Materflex C/L перистальтический насосCole-Parmer77122-26
Стимулятор IsostimWorld Precision InstrumentsA320RC
Генератор сигналовTeledyne LecroyWaveStation 2012
Ультразвуковой очиститель FS20Fisher Scientific1533530
Трубка Tygon ID: 1/32" OD: 3/32" Стена 1/32"Поставка компонентовTET-031A
Трубка Tygon ID: 3/32" OD: 5/32" Стена 1/32"Поставка компонентовTET-094A
Адаптер люэровского замка к 3-ходовому клапануCole-ParmerEW-31200-80
Тройник адаптеры и пластиковые фитингиCole-Parmer6365-90
Пластиковый зажимWaterZoo2465
ПельтьеTE ТехнологияTE-127-2.0-2.5
Rhod-2AMThermoFisher ScientificR1245MP
Di-8-ANEPPSThermoFisher ScientificD3167
Mag-Fluo-4AMThermoFisher ScientificM14206
Акупунтура иглыLHASATC1.20x13
Шприц BD объемом 60 мл с люэр-локомFisher Scientific14-820-11
LabViewNational Instruments
Speed vacuum Eppendorf VagufugeFisher Scientific07-748-13
Цифровая схема обработки сигналов DSP TMS 320Texas Instrument
Longpass Dichroic mirror 567 нмThorLabsDMLP567L
Объектив 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Стандартный объективEdmund OpticsStock# 33-437
Объектив 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard ObjectiveEdmundOptics Stock# 33-438
Длиннопроходный фильтр из цветного стекла 590 нм ThorLabsFGL590
Green Nd-YAG лазер 532 нм, 500 мВт
Микроманипулятор для лазераSiskiyouMX130R
Многомодовое оптоволокно 200 & микро; m NA 0.39ThorLabsFT200UMT
светодиоды синиеLumiledsL135-B475003500000
светодиоды зеленыеLumiledsL135-G525003500000
Кубический светоделитель, неполяризационныйThorLabsBS007
36 дюймов длина, ласточкин хвост оптическая рейкаEdmund Optics54-402
2,5 дюйма ширина, держатель ласточкин хвостEdmund Optics54-404
0,75" Дорожный, микронный столикEdmund Optics37-983
Оптическая шина типа "ласточкин хвост" 3"ThorLabsRLA075/M Держатель
рельса "Ласточкин хвост" 1"ThorLabsRC1
Лавинный фотодиод Helix 902Digi-KeyHELIX-902-200
Держатель объектива XY Translator& НБСП;ThorLabsST1XY-S
Алюминиевая макетная плата 6" x 6"ThorLabsMB6
Nexus OTPICAL стол 4' x6'ThorLabsT46HK
Винты колпачка из нержавеющей сталиThorLabsHW-KIT5/M
Acrylic  листHome Depot/Lowes
Sylgard Комплект силиконового эластомераDow CorningSylgard 184
Эпоксидный гель Walmart/Home Depot2-part 5 мин clr 1oz
21G1.5 Прецизионная игла для скольженияB-D305167
23G Прецизионная игла для скольженияB-D305145
Монтажное основание, 25 мм x 75 мм x 10 ммThorLabsBA1/M
Проволочные стойки 36 "AleraAALESW59PO36SR
Проволочные полкиAleraALESW582424SR
Зажим для столба и углаThorLabsSWC/M-P5
Стеклянный шприц для красильной камерыWheatonW851020
Резиновая пробкаScience ToolsCE-STOP01C
Home

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fabiato, A., Fabiato, F. Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells. J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).
  2. Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249 (5), 1056-1060 (1985).
  3. Escobar, A. L., et al. Developmental changes of intracellular Ca2+ transients in beating rat hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H971-H978 (2004).
  4. Ramos-Franco, J., Aguilar-Sanchez, Y., Escobar, A. L. Intact Heart Loose Patch Photolysis Reveals Ionic Current Kinetics During Ventricular Action Potentials. Circ Res. 118 (2), 203-215 (2016).
  5. Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249, H1056-H1060 (1985).
  6. Fischmeister, R., DeFelice, L. J., Ayer, R. K., Levi, R., DeHaan, R. L. Channel currents during spontaneous action potentials in embryonic chick heart cells. The action potential patch clamp. Biophys J. 46 (2), 267-271 (1984).
  7. Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Profile of L-type Ca(2+) current and Na(+)/Ca(2+) exchange current during cardiac action potential in ventricular myocytes. Heart Rhythm. 9 (1), 134-142 (2012).
  8. Apkon, M., Nerbonne, J. M. Characterization of two distinct depolarization-activated K+ currents in isolated adult rat ventricular myocytes. J Gen Physiol. 97 (5), 973-1011 (1991).
  9. Valverde, C. A., et al. Transient Ca2+ depletion of the sarcoplasmic reticulum at the onset of reperfusion. Cardiovasc Res. 85 (4), 671-680 (2010).
  10. Valverde, C. A., et al. Phospholamban phosphorylation sites enhance the recovery of intracellular Ca2+ after perfusion arrest in isolated, perfused mouse heart. Cardiovasc Res. 70 (2), 335-345 (2006).
  11. Escobar, A. L., et al. Role of inositol 1,4,5-trisphosphate in the regulation of ventricular Ca(2+) signaling in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 53 (6), 768-779 (2012).
  12. Mejía-Alvarez, R., et al. Pulsed local-field fluorescence microscopy: a new approach for measuring cellular signals in the beating heart. Pflügers Arch. 445 (6), 747-758 (2003).
  13. Ferreiro, M., Petrosky, A. D., Escobar, A. L. Intracellular Ca2+ release underlies the development of phase 2 in mouse ventricular action potentials. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (5), H1160-H1172 (2012).
  14. Kornyeyev, D., et al. Calsequestrin 2 deletion shortens the refractoriness of Ca2+ release and reduces rate-dependent Ca2+-alternans in intact mouse hearts. J Mol Cell Cardiol. 52 (1), 21-31 (2012).
  15. Mattiazzi, A., Argenziano, M., Aguilar-Sanchez, Y., Mazzocchi, G., Escobar, A. L. Ca2+ Sparks and Ca2+ waves are the subcellular events underlying Ca2+ overload during ischemia and reperfusion in perfused intact hearts. J Mol Cell Cardiol. 79, 69-78 (2015).
  16. Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H2138-H2153 (2010).
  17. Wang, Z. G., Fermini, B., Nattel, S. Repolarization differences between guinea pig atrial endocardium and epicardium: evidence for a role of Ito. Am J Physiol. 260, H1501-H1506 (1991).
  18. Liu, D. W., Gintant, G. A., Antzelevitch, C. Ionic bases for electrophysiological distinctions among epicardial, midmyocardial, and endocardial myocytes from the free wall of the canine left ventricle. Circ Res. 72 (3), 671-687 (1993).
  19. Litovsky, S. H., Antzelevitch, C. Transient outward current prominent in canine ventricular epicardium but not endocardium. Circ Res. 62 (1), 116-126 (1988).
  20. Lukas, A. Electrophysiology of Myocardial Cells in the Epicardial, Midmyocardial, and Endocardial Layers of the Ventricle. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2 (1), 61-72 (1997).
  21. Antzelevitch, C., Fish, J. Electrical heterogeneity within the ventricular wall. Basic Res Cardiol. 96 (6), 517-527 (2001).
  22. Gomez, A. M. Modulation of electrical heterogeneity by compensated hypertrophy in rat left ventricle. Am J Physiol. 272 (3 Pt 2), H1078-H1086 (1997).
  23. Efimov, I. R. Innovation in optical imaging: looking inside the heart. Heart Rhythm. 4 (7), 925-926 (2007).
  24. Boukens, B. J., Efimov, I. R. A century of optocardiography. IEEE Rev Biomed Eng. 7, 115-125 (2014).
  25. Zhang, H., Iijima, K., Huang, J., Walcott, G. P., Rogers, J. M. Optical mapping of membrane potential and epicardial deformation in beating hearts. Biophysics J. 111 (2), 438-451 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

LFFMLFFMPLEDFM

Похожие статьи