Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Разработка системы доставки Экономичный ДНК по «Acufection» и его применение к исследованию кожи

6.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55206

⸱

19 апреля 2017 г.

 ,  , 
1Graduate Institute of Immunology, National Taiwan University College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол является экономически эффективной альтернативой для экспрессии голой плазмидной ДНК в коже мыши. Общая цель протокола заключается в предоставлении иммунных связанных генов в ткань кожи, чтобы очертить функциональную роль специфического гена в кожных воспалениях.

Аннотация

Дисрегуляция иммунного ответа в коже связано с многочисленными нарушениями кожи человека. Прямая передача связанных с иммунитетом генов в ткань кожи является захватывающим подходом для исследования иммунной модуляции кожного воспаления в мышиных моделях заболеваний человека. Здесь мы представляем собой экономически эффективный протокол, который поставляется голую ДНК в коже мышей и приводит к трансгенной экспрессии. Метод придуман «acufection», обозначающий ACU прокол-опосредованной ДНК транс fection. Чтобы выполнить acufection, кожи мыши была впервые переплетаются с ДНК в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS), а затем слегка кололи с пачкой акупунктурных игл, чтобы облегчить поглощение ДНК и трансфекции в клетки. Плазмидная ДНК предположительно рассмотрена кератиноцитами и дендритные клетки (ДК) в коже и выражается в белка. Механический укол с иглой самих по себе не вызывает повреждение кожи или вызвать активацию кератиноцитов. Выражениетрансфицированных генов был обнаружен в коже на обоих транскрипции и трансляции уровней ниже acufection в течение 2 дней и сохраняется до 7 дней. Основная целью разработки этого метода acufection была исследовать ранее неопределенные изоформы IL-15. С помощью этого метода, альтернативно сплайсинга IL-15 изоформ с частично удаленной экзон 7 (IL-15ΔE7) было выражено в коже и затем обрабатывали с Toll-подобный рецептор 7 (TLR7) агониста, Имиквимод (IMQ), чтобы вызвать воспаление. Acufection доставляемых ИЛ-15ΔE7 в коже подавляется кератиноцитов пролиферацию, толщину эпидермиса и набора нейтрофилов в IMQ-индуцированного кожного воспаления. С ростом интереса к идентификации регуляторных механизмов кожного воспаления, протокол , описанный здесь , обеспечивает экономически эффективную и универсальную альтернативу артсистемой гена или microseeding для доставки ДНК в естественных условиях. Это потенциально может позволить открытие функции романагена в коже или для исследования нового лечения кожных заболеваний.

Введение

Кожа является первой линией защиты организма. Кератиноциты (КИС) являются основным типом клеток в коже человека и мышей. В ответ на раздражители окружающей среды (например , солнечного света, кислорода, химических веществ и патогенные вторжения), KCS активируются и производить широкий спектр провоспалительных цитокинов и хемокинов , таких как IL-8, IL-6, IL-1 & alpha ; , IL-1, TNF- α и GM-CSF , 1. Вместе они вызывают набор иммунных клеток к коже. Усугубляется кожное воспаление часто связано с многочисленными человеческими заболеваний , включая острый внематочной контактный дерматит и хронический Т клеточного воспаления (например , аллергический контактный дерматит и псориаз) 2. Плавное провоспалительные реакции в коже путем ингибирования активации KC является правдоподобным подход для лечения кожного воспаления. Этот протокол описывает новый подход к транзиторна экспрессии гена цитокина в эпидермисе с целью изучения иммунного РезаПонс косвенного такой обработки в коже.

Эпидермис сочиняет наиболее поверхностный слой кожи. Он служит в качестве физического барьера, сохраняя внешние вещества, такие как нуклеиновые кислоты и патогенов от входа в более глубокие слои кожи. Несколько безыгольных методы были созданы для передачи эпидермального ДНК 3, 4. ДНК в растворе или связанный с катионными липосомами или аденовирусными векторами были непосредственно применены к эпидермису, модифицированный методы, таким как удаление рогового слоя или обработка эпиляции реагента. Удаление рогового эпителия способствует ДНК пересечения эпидермальный барьер и взаимодействие с кератиноциты и клетки Лангерганса , чтобы вызвать иммунный ответ 5. В то время как большая площадь поверхности для переноса ДНК, и этот подход не включает в себя иглу, есть недостатки, включая требованиедля больших количеств ДНК (10 - 100 мкг), грубого обращения на кожу путем отгонки, и противоречивые результаты в индукции иммунного ответа у иммунизированных животных без доставки ДНК усилител 6. Микрочастицы опосредованных внутриклеточная доставка голой ДНК к коже была показана, высокой эффективность и воспроизводимость для индукции иммунного ответа 7, 8. Ручная генная пушка была использована для бомбардировки целевого участка кожи с плазмидной ДНК , покрытые частицами золота 2 мкм диаметра по размеру с помощью гелия под давлением воздуха потока 9. Плазмидная ДНК предположительно поглощается KCsand дендритных клеток (ДК) в коже и белки локально выраженная или транспортируются в дренирующие лимфатических узлы с помощью ДК 10. Хотя система генной пушки проста и требует ограниченного технического опыта, расходы на подготовку и доставку "ДНК булпусть "(т.е. золотых порошков, газообразный гелий) и для генной пушки сами ограничивают его общее применение. Кроме того, потребность в систему доставки газообразного гелия ограничивает легкость генной пушки транспорта , когда эксперименты проводятся в разных местах. Microseeding было показано , что достичь более высокой эффективности переноса генов , чем одной инъекции и бомбардировок частиц 11. Microseeding использует татуировку пистолет для доставки ДНК на кожу без использования шариков частиц 11. Качающийся микроигло на коже , используя этот подход, скорее всего, непосредственно скрести клеточную мембрану и, таким образом, перенос ДНК в нескольких ячеек одновременно. тем не менее, боль, связанная с большим количеством инъекций с иглами мм диаметра 0.254 является недостатком.

Здесь мы предлагаем альтернативный подход к доставке ДНК в естественных условиях. «Acufection» Протокол мы описали здесь обеспечивает экономичный и эффективный способ доставки плазмидной ДНК в коже мышей. Вкратце, десять акупунктурные иглы (диаметром 0,2 мм х 13 мм в длину) были связаны в пучок с помощью клейкой ленты. Объем 10 мкл PBS с 10 мкг плазмидной ДНК, содержащей трансген интерес был помещен на бритой, депиляции кремом обработанной боковой поверхности кожи. С помощью пучка акупунктуры иглы вибрировать поверхность (1 см х 1 см) кожи, кератины в роговом слое были ослаблены и плазмидная ДНК наносила на поверхность была поглощена в эпидермис. Повреждение кожи контролировалась и оказался минимальным. Экспрессия гена, трансфицированной в acufected кожи была подтверждена как количественной ПЦР в реальном времени (QRT-PCR) и ELISA. Иммунные модулирующие эффекты acufection доставляемых IL-15ΔE7 на кожном воспалении были продемонстрированы с использованием IMQ обработанной модели мыши 12. В то время как acufection оказывается простым и менее Демаметод nding для доставки ДНК в естественных условиях, оптимальное количество ДНК для различных генов и времени , чтобы проколоть кожу должно быть тщательно оптимизировано , чтобы получить воспроизводимые результаты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Самок мышей на 8 - 12 недель возраста были использованы для этого исследования. C57 / НД6 дикого типа (WT) и IL-15 дефицитных (IL15 - / -) мышей были приобретены в Национальной лаборатории Центра животных (NLAC), Тайвань и Taconic Farm, соответственно. ИЛ-15-дефицитных (IL15 - / -) и ИЛ-15-доминантной (IL15 +/- и IL15 + / +) показал соотношение 1: 3 во втором поколении от скрещивания IL15 +/- гетерозигот. Генотип IL15 - / - мышей была подтверждена анализом ПЦР. Мыши выдерживались в специфический патоген (SPF) объекта в лаборатории Центра животных (ЛАК), Национальный университет Тайваня (NTU) Колледж медицины. Все процедуры на животных, включая анестезирующие материалы и методы были выполнены в соответствии с протоколом животных утвержденного Национального тайваньского университета Медицинского колледжем и колледжем здравоохранения институциональной помощи общественных и использование животных комитета (IACUC) (АФФИДЕВИТ одобрения Протокола животных 20130225).

<р класс = "jove_title"> 1. Получение акупунктурных игл

Примечание: акупунктурные иглы медицинские приборы , состоящие из рукоятки и конец иглы (фиг.1А). Диаметры акупунктурной иглы варьировались от 0,2 мм (36 G) до 0,35 мм (28 G). Мы выбираем лучшие точки иглы, чтобы избежать возможного чрезмерного повреждения клеток во время прокалывания кожи. Есть 4 различных длин 0,2-мм иглу в том числе 13 мм (0,5 дюйма), 25 мм (1,0 дюйма), 40 мм (1,5 дюйма) до 50 мм (2,0 дюйма) в длину. Пучок из 10 игл с длиной 13 мм при условии, что лучше удобный захват во осциллирующих иглу на C57BL / 6 мыши кожи. Параметры могут быть изменены, если метод применяется к коже крупных животных или выполнены исследователями с большими руками.

  1. Удалить акупунктурные иглы из стерильного апирогенно пакета. Поместите иглы на стерильной драпировки.
  2. Используйте клейкую ленту маркировки, чтобы связать 10 иглы вместе Какна расслоение (Фигура 1В).
    Примечание: 10 игл геометрически расположены, чтобы сформировать форму цилиндра. Для удобства использования куска парафиновой пленки, чтобы стабилизировать устройство перед нанесением клейкой ленты. Убедитесь, что все точки иглы находятся на одной и той же плоскости. Используя связку вместо одной иглы облегчает максимальную инфузию ДНК путем увеличения площади контакта между иглами и кожей.

2. Получение большого количества эндотоксина и свободный плазмидная ДНК

  1. Преобразование химически компетентных бактериальных клеток с плазмидной ДНК.
  2. Выбор и инокуляции одну бактериальную колонию в 3 мл LB - среды , содержащей антибиотики и инкубировать при 37 ° С в шейкере в течение ночи.
  3. Интенсификация культуры путем разбавления бактериальной культуры в соотношении 1: 100 в 250 мл LB среды с антибиотиками и встряхивания в течение ночи при 37 ° С
  4. Подготовьте большое количество ДНК с помощью высокой QUALITу, эндотоксинов плазмида подготовка комплекта в соответствии с инструкциями изготовителя.
    Примечание: Протокол Acufection требует высокой чистоты и большое количество плазмидной ДНК. Использование высокого качества, эндотоксинов и столбец-очищенной ДНК плазмиды рекомендуется.
  5. Элюции ДНК в стерильной воде. ДНК Хранить в небольших аликвот при -20 ° С до готовности к acufection.
    Примечание: Во избежание повторного замерзания и оттаивания ДНК, чтобы обеспечить последовательное выражение плазмидной ДНК.
  6. Развести ДНК плазмиды до 1 мг / мл в стерильном PBS для acufection.

3. Порядок Acufection

Примечание: Оптимальное количество ДНК и площадь поверхности кожи мишени может изменяться для различных генов и должно быть дополнительно оптимизировано. Сила, покалывание и количество раз, чтобы ослабить роговой слой кожи может также варьироваться в зависимости от толщины кожи. Эти условия должны быть тщательно определены после оценки уровня экспрессии гена acufected transcriPTS с помощью QRT-PCR.

  1. Взвесьте мышей и управлять tribromoethanol (400 мкг на г веса тела) путем перитонеального инъекции.
    Примечание: 2,2,2-tribromoethanol является инъекционным анестетиком, который обычно используется в мышах. Растворы изготовлены путем растворения нефармацевтического класса 2,2,2-tribromoethanol (2,5 г) в дистиллированной воде (200 мл), содержащая 2,5% 2-метил-2-бутанол.
  2. Используйте ветеринар офтальмологической мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
    Примечание: обезболивающий эффект будет индуцируется в 1 - 2 мин. Проверьте схождение щепотку рефлекс, чтобы обеспечить достаточную глубину анестезии до начала работы.
  3. Бритье спинной фланговой кожи и нанесите крем депиляции растворять кератин белок в стержне волоса.
    Примечание: Использование депиляции крема для удаления волос будет способствовать вливанию ДНК в кожу.
  4. Используйте воду пропитанной ватные тампоны, чтобы вытереть депиляции крем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крем для депиляции растворим в воде. Полное удаление крема Вильл предотвратить жирную поверхность и обеспечить лучший результат покалывания.
  5. Используйте стерильный ватный тампон, смоченный в 70% этаноле для дезинфекции поверхности кожи.
  6. Отметить целевую область (1 см х 1 см) на депилированной коже с предварительно измеренным трафаретом. Примечание: Маркировка целевого сайта поможет применить пакет иглы вверх-вниз в пределах определенной области. Это важно, чтобы гарантировать доставку одного и того же количества ДНК к удельной площади поверхности, чтобы свести к минимуму эксперимент-к-эксперимента вариации.
  7. Поместите каплю 10 мкл плазмидной ДНК (10 мкг) на отмеченной коже.
    Примечание: Количество ДНК для acufection варьируется в зависимости от различных генов и типа вектора экспрессии. Количество ДНК, используемой должно быть тщательно титрует до проведения эксперимента интереса. 10 мкл небольшой капля жидкости и хорошо сидит на бритую и депилированную коже без скатывания в то время как покалывание. Включите контрольную группу мышей, обработанных 10 мкл пустого вектора ДНК для сравнения с мышамcufected с геном исследования.
  8. Удерживая акупунктуру иглу пучка (Фигура 1В) и колоть отмеченную поверхность с движением вверх-вниз по 100 раз или до влаги из ДНК в PBS на коже исчезает. Примечание: Некоторые покраснение поверхности кожи может произойти. Избегайте глубокие сокращения, которые кровоточат. Количество вверх и вниз колющие движения на поверхности кожи функционально определяется, когда влага из ДНК в PBS (10 мкл) исчезает на коже. Мы решили 100 раз в 30 секунд, потому что он дал наиболее достоверные результаты acufection доставляемых генов. Если это применимо, иглы могут быть повторно использованы до 6 уколов мишени кожи (1 см х 1 см) каждый. Промыть иглы в 70% этаноле и PBS между acufection. Замените их на новые иглы, когда они тупые или для различной плазмидной ДНК, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
  9. Поместите acufected мышей на грелку, чтобы поддерживать температуру тела до бодрствования.
  10. Возвращение мышей в клетку, когда у них естьвосстановила достаточное сознание. Примечание: Следует acufected мышей в отдельной клетке (менее 5 животных в клетке) из клетки не-acufected мышей.
  11. Поместите бутылку с водой на месте и вернуть клетку к IVC (индивидуально вентилируемые клетки) стойки.

4. Послеоперационный уход

  1. В течение первых 48 часов после процедуры, внимательно следить за мышами для любого дискомфорта, включая поведенческие изменения (беспокойство, возбуждение или расстройства пищевого поведения) или ненормальную внешность (грубый волос пальто или сгорбившись позу).

5. Имиквимод (IMQ) Лечение IL-15ΔE7-acufected кожи

Примечание: Выражение Транскрипционного и белка производство acufected гена может быть обнаружено на 3 день мышея acufected плазмиду интереса можно лечить с помощью различных видов стимуляторов 3 дня после трансфекции. Проиллюстрируем здесь путем обработки IL-15ΔE7-acufected кожу мыши с IMQ кремом. IMQ является imidazoquinolin амина одобрен Fили лечения внешних половых органов и перинатальные кондиломы 13. Местное лечение IMQ показано , чтобы вызвать псориаз подобные заболевания кожи человека у мышей с проявлением слоеного кожи, эпидермального и дермального пролиферации нейтрофильной инфильтрации 12, 14, 15.

Примечание: плазмидный вектор содержал всю длину мыши IL-15 кДНК, при регулировании фактора элонгации 1-альфа (ПЭФ), по бокам с пептидом IL-2 сигнала и FLAG тегом на С-конце (ПЭФ-ИЛЫ 15, 5859 пар оснований), который был построен , как описано Bamford и соавт. 16. Плазмиду используют в качестве матрицы IL-15, чтобы удалить первые 16 аминокислот в остатках 33 - 48 в экзоне 7 гена IL-15 для IL-15ΔE7 (ПЭФ-IL-15ΔE7, 5,811 пар оснований) с помощью SOE (синтез расширение перекрытия) ПЦР - метод 17. Бактериальные колонии, которые успешно былитрансформировал с IL-15ΔE7 были проверены с помощью расщепления ферментов рестрикции и ДНК с последующим секвенирование 12, 18. Большое количество эндотоксинов плазмидной ДНК получали, как описано на стадии 2 протокола.

  1. Обезболить acufected мышей путем внутрибрюшинной инъекции tribromoethanol (400 мкг на г массы тела) и применять ветеринара офтальмологическую мазь на глаз, чтобы предотвратить сухость под анестезией. Проверьте схождение щепотку рефлекс, чтобы обеспечить достаточную глубину анестезии перед началом оперативных процедур. Примечание: Так как 2 см х 2 см кожа будет лечиться IMQ, 2 дозы PIL-15ΔE7 плазмидной ДНК (10 мкг в 10 мкл PBS на дозу) является acufected на 2 целевых сайтах (1 см х 1 см каждый).
  2. Марк обрамляет кожи (2 см х 2 см), покрывающий acufected области.
  3. Используйте Q-наконечник аппликатора для местно применять IMQ крем на область отмеченной поверхности. Примечание: шаг 5.1 выполняется только для первой дозы (60 мг / дозы).Следующие последовательные дозы применяются к не анестезированному мышею.
  4. Документирование изменения IMQ обработанной кожи спины ежедневно с видеокамерой высокой четкости. Примечание: Один человек держит мышь в то время как другой находится в режиме записи. Фотоснимки снято и смонтировано в более позднее время.
  5. Эвтаназии мышей путем введения передозировки tribromoethanol (800 мкг на г веса тела) с последующим смещением шейных позвонков на 4-й день или 7-й день после обработки IMQ. Кожа вырезают и обрабатывают (шаги 4.1 - 4.5).

6. гомогенат кожи мыши

  1. Используйте пару хирургических ножниц, чтобы сделать горизонтальный разрез от основания хвоста. Продолжить на двусторонней основе, к основанию задних конечностей и продолжают резать по вертикали вдоль боковой к основанию передней конечности.
  2. Тщательно очистить кожу от основной ткани от задней к передней. Используйте ножницы, чтобы отрезать спинной кожи. Поместите кожу на стерильную чашку Петри.
  3. Используйте скальпель, чтобы иссечь целикожа и заморозить его в жидком азоте немедленно. Примечание: Тот же самый размер acufected кожи без (1 см х 1 см) или с лечением IMQ (2 см х 2 см), установленной для каждой мыши, чтобы свести к минимуму эксперимент-в-эксперименте вариации.
  4. Поместите замороженные ткани кожи в центре предварительно охлажденной 2-отсечной ступки с ручками и пестиком. Использование свинцового молотка на ступку, чтобы распылить ткань.
  5. Быстро поместить пылевидного ткани в новую пробирку, содержащую 500 мкл реагента для лизиса клеток для экстракции РНК или в пробирку, содержащую 50 мкл PBS и 1x ингибитор протеазы коктейль для получения белка лизата.

7. Н & Е и иммуногистохимическое окрашивание кожи Раздел

  1. Поместите ткань кожи в кассете и погрузить его в 4% параформальдегид в течение ночи.
  2. Вставить и срез ткани, которая в нашем случае была выполнена в лаборатории патологии в LAC, NTU. Примечание: В разделе разрезают при толщине 5 мкм. Место secti тканидополнениях на положительно заряженные горки.
  3. Нагреть слайды при температуре 65 ° С в течение 15 мин.
  4. Поместите слайды в окрашивании стойке. Погрузите стойки в соответствующие резервуар, содержащий ксилол замену в течение 5 мин с последующим дважды путем последовательного погружения в 100%, 95%, 80%, 75%, 60% и 50% этанола (5 мин каждый) для регидратации. Погрузите слайды в водопроводной воде в течение 3 мин перед окрашиванием.
  5. Выполните гематоксилин и эозин окрашивание. Примечание: H & E окрашивание проводили по запросу на лаборатории патологии в LAC, NTU.
  6. Для иммуногистохимического окрашивания, блокировать секцию с блоком раствором при комнатной температуре в течение 5 мин, чтобы уменьшить неспецифическое фоновое окрашивание. Примечание: Блок раствор коммерчески разработан с методами иммуноокрашивания. Ни одно животное в сыворотке крови не содержится в этом продукте.
  7. Погрузите слайд в PBS, чтобы промыть блок раствор.
  8. Развести блок раствора в PBS в 1:10 и добавить 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (разбавитель раствора).
    9. Пипетка соответствующим образом разводили первичное антитело на секции и инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре. Примечание: Антитела разводили в растворе разбавителя. Концентрация антител для этого окрашивания были оптимизированы в соотношении 1: 800 и 1: 200 для Ki67 (клон SolA15) и Ly6G (клон 1A8), соответственно. Эти концентрации найдены, чтобы показать четкое пятно без фона окрашивания.
    1. Пятно один последовательный участок в том же периоде с тем же раствором, опуская первичное антитело для контроля за неспецифическое связывание вторичного антитела.
  9. Промыть слайды три раза в TBS плюс 0,1% Твин-20 (TBST раствор) в течение 5 минут каждый. Менять раствор между стирок.
  10. Пипетировать одну каплю меченых полимеров в каждой секции и инкубируют при комнатной температуре в течение 40 мин. Примечание: Меченый полимер коммерчески получают смешивание полимеров аминокислот с пероксидазой и вторичным антителом, которое сводится к фрагменту в Fab». Реагент готов к использованию дляиммуногистохимическое окрашивание срезов тканей мыши.
  11. Промыть слайды три раза в TBST в течение 5 минут каждый. Менять раствор между стирок.
  12. Пипетка 3,3'-diaminobenzindine тетрагидрохлорид раствор (ДАБ) на срез ткани и выдержать при комнатной температуре до тех пор, пока осадок коричневого цвета виден при ярком поле микроскопа. Примечание: Время ДАБ для осаждения в присутствии пероксидазы составляет около 30 мин.
  13. Погрузитесь скользит в воде, чтобы остановить пероксидазную активность. Dip слайды в метил-зеленый раствор для ядерного окрашивания. Промыть слайды три раза в PBS в течение 5 мин каждый.
  14. Поместите покровный над окрашенной секцией, которая покрыта постоянной монтажной средой (8 мкла на секцию).

8. Фотография и анализ раздела тканей Витраж

  1. Визуализируйте срезы ткани H & Е и окрашивали IHC под ярким поле микроскопа. Захват изображение с использованием прибора с зарядовой связью (CCD) камеры, прикрепленной к микроскопу. Для дuantitative анализ, программное обеспечение визуализации может быть использована
    1. Сканирование целых окрашенных срезов с помощью ScanScope с целью 20X.
    2. Измерить толщину эпидермиса в пределах 1 мм сегмента эпидермиса и в подсчете количества Ki67-иммунореактивных клетки внутри сегмента.
      Примечание: Количественный анализ выполняется с помощью автоматизации микроскопии & программного обеспечения для анализа изображений. Толщина эпидермального определяется расстоянием между базальным слоем и наружным слоем эпидермиса.
    3. Подсчитайте число Ly6G-иммунореактивные клетки в зоне дермы (230 х 270 мкм 2 прямоугольника) непосредственно ниже местного IMQ обработанной кожи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В то время как некоторые покраснение было очевидно в течение первого часа после того, как прокалывание с акупунктурных игл, кожа очищается от 2 -й день , и не наблюдалось никакой негативной реакции кожи до 7 -й день после того, как прокалывание (фиг.2А). Игла колющая индуцированное очень низкий уровень эпидермального orthokeratosis и минимальной дермального проникновения H & E анализа по сравнению с необработанной кожи (Фигура 2В).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наиболее важный шаг, чтобы обеспечить экспрессию acufected плазмидной ДНК, чтобы равномерно осциллировать и ослабить роговой слой кожи. Прижимая иглу осторожно, не разрезая кожу, сила должна быть достаточно трудно нажимать на поверхность. Для того, чтобы облегчить поглощение ДНК в 10 мкл раствора на 1 см х площадь поверхности 1 см, иглы должны колебаться вверх и вниз в течение приблизительно 100 раз в 30 с. Можно определить силу, которую необходимо проколоть кожу и отмечая количество раз, которые необходимы для получени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют никаких финансовых интересов раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Министерства науки и технологии (MOST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048). Мы благодарим доктора. Бетти Ву-Се и Chien-Куо Ли в NTU, Ли Зербони Стэнфордского университета и доктором Питер Гофман в Гавайском университете для чтения рукописи, Юн Чин в НТУ для технической помощи, а также д-р Вэнь-Чи Вэй в сельскохозяйственной биотехнологии Научно-исследовательский центр в Академии Синике для технических консультаций.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Accu Handy NeedleAccu36Gx0.5Медицинское устройство
NairTM ЛосьонChurch & ДуайтН/АИспользование для удаления волос
Заменитель ксилинаШандон Термо Фишер Научный6764506Депарафинизация
Авертин (2,2,2-триброметанол)Сигма-ОлдричТ4,840-2Анестезия
2-метил-2-бутанолСигма-Олдрич152463растворитель для растворения авертина
Дифко<суп>ТМ ЛБ бульон, МиллерБ.Д244620Размножение и поддержание E. coli для молекулярной биологии
мыши IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kiteBioscience88-7215Measure IL-15
protein Anti-mouse Ly6GBioLegend127601Антитело для иммуногистохимического окрашивания
Anti-mouse Ki-67eBioscience14-5698-80Антитело для иммуногистохимическое окрашивание
Simple Stain Mouse MAXPO (Rat)Nichirei Biosciences414341FРеагент для блокировки фонового сигнала при окрашивании мыши
DAB Пероксидаза (HRP) Набор субстратаVector LaboratoriesSK-4100Пероксидный субстрат для иммуногистохимического окрашивания
Ultra V блокThermo Fisher ScientificTA-060-UBУменьшить неспецифическое фоновое окрашивание
Метиловый зеленыйSigma-AldrichM8884Ядерное окрашивание
Vecta MountTMVector LaboratoriesM-5000Перманентно сохраняющие гистохимические красители
Коктейль ингибиторов протеазыRoche04-693-116-001Ингибирование активности протеазы в клеточном лизате
крем Aldara3M ParmaceuticalsN/A5% крем имиквимод
Bessman Tissue PulverizerSpectrum Labs189475Использование для измельчения кожной ткани
ABI7900HT помощью амплификатораThermo Fisher ScientificN/AКоличественный анализ ПЦР в реальном времени
ВидеокамераPanasonicHDC-SD60Документирование изображений
Axio Scope.A1ZEISSN/AСветлопольная микроскопия
мышью

Ссылки

  1. Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
  2. Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
  3. Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
  4. Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
  5. Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
  6. Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
  7. Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
  8. Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
  9. Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
  10. Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
  11. Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
  12. Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
  13. Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
  14. van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
  15. Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
  16. Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5' untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
  17. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
  18. Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
  19. Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
  20. Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
  21. Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

15TLR7
Разработка системы доставки Экономичный ДНК по «Acufection» и его применение к исследованию кожи
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.