3D Magnetic Stem Cell Aggregation и биореактор Созревание для регенерации хряща

Краткое содержание

Хондрогенез из стволовых клеток требует тонкой настройки условия культивирования. Здесь мы представляем магнитный подход для конденсации клеток, существенный шаг для инициирования хондрогенеза. Кроме того, мы покажем, что динамическое Созревание в биореакторе применяется механическое раздражение на клеточные конструкции и повышает хрящевой внеклеточный матрикс.

Аннотация

Хрящ инжиниринг остается проблемой из - за трудности в создании функционального имплантат в пробирке , похожий на нативную ткань. Подход недавно исследовали для развития аутологичных замены предполагает дифференциацию стволовых клеток в хондроциты. Для того, чтобы инициировать этот хондрогенез, степень уплотнения стволовых клеток требуется; Таким образом, мы показали возможность магнитно-конденсационные клеток, как в толстых подмостях и строительных лесов, свободные, с использованием миниатюрных источников магнитного поля в виде клеточных аттракторов. Этот магнитный подход был также использован для руководства совокупного слияния и построить помост свободного, организованный, трехмерный (3D) ткани на несколько миллиметров в размере. В дополнении к наличию усовершенствованного размера, ткань, образованная магнитным приводу слияния представлена ​​значительному увеличение экспрессии коллагена II, и подобная тенденция наблюдались для аггрекан экспрессии. Как родной хрящ был подвергнут сил тшлю повлиял на его структуру 3D, динамическое созревание также было проведено. Биореактор, который обеспечивает механические раздражители использовали для культуры магнитно высевают каркасы в течение периода в 21 дней. Биореактор созревание в значительной степени улучшен хондрогенезе в cellularized строительных лесов; внеклеточный матрикс, полученный в этих условиях был богат коллагеном II и аггреканен. Эта работа описывает инновационный потенциал магнитного конденсации меченых стволовых клеток и динамического созревания в биореакторе для улучшения хондрогенной дифференциации, как строительные леса, свободных и внутри полисахаридные строительных лесов.

Введение

Магнитные наночастицы уже используются в клинике в качестве контрастных агентов для магнитно-резонансной томографии (МРТ), и их терапевтическое применение продолжать расширяться. Например, недавно было показано , что меченые клетки можно манипулировать в естественных условиях с помощью внешнего магнитного поля и может быть направлен и / или поддерживать на определенном месте имплантации ^{1, 2, 3.} В регенеративной медицине, они могут быть использованы для конструирования тканей , организованных в пробирке ^4, в том числе сосудистой ткани ^{5, 6, 7, 8,} кости и хряща ^9.

Суставной хрящ погружает в аваскулярной среде, что делает ремонт внеклеточных компонентов матрицы очень ограниченный при возникновении повреждений. По этой причине, researcч в настоящее время сосредоточена на проектировании гиалиновых хрящевых замен, которые могут быть имплантированы в месте дефекта. Для того , чтобы произвести замену аутологичной, некоторые исследовательские группы изучают использование аутологичных хондроцитов в качестве источника клеток ^{10, 11,} в то время как другие подчеркивают способность мезенхимальных стволовых клеток (МСК) дифференцироваться в хондроциты ^{12, 13.} В предыдущих исследованиях здесь воспроизводятся, мы выбрали MSC, так как их отбор проб костного мозга достаточно прост и не требует принесения в жертву здоровых хондроцитов, которые рискуют потерять свой фенотип ^14.

Одним из первых шагов необходимо инициировать хондрогенную дифференцировку стволовых клеток являются их конденсацией. Клеточные агрегаты , как правило , формируются с использованием либо центрифугирования или Micromass культуры ^15; Однако, эти методы конденсации neitheг представить потенциал, чтобы создать кластеры клеток в пределах толстых лесов, ни потенциала, чтобы контролировать слияние агрегатов. В этой статье мы описываем новаторский подход к конденсации стволовых клеток с использованием MSC магнитной маркировки и магнитного притяжения. Эта техника была доказана , чтобы сформировать строительные леса , свободные 3D конструкций через слияние агрегатов друга с другом , чтобы получить миллиметровый масштаб хрящевой ткани ^9. Магнитный высев и толстых больших лесов также позволил возможность увеличения размера сконструированной ткани, проектируя форму с большей готовностью полезной для имплантации, а также диверсификации потенциала для клинического применения в восстановлении хрящей. Здесь мы подробно протокол для магнитного высева MSC в пористые каркасы , состоящих из природных полисахаридов, пуллулана, и декстраны, каркасы , которые ранее использовались для удержания стволовых клеток ^{16, 17.} Хондрогенная дифференцировка finallу проводил в биореакторе, чтобы обеспечить непрерывные питательные вещества и диффузию газа в матрице сердцевину каркасов, посеянных с высокой плотностью клеток. Помимо обеспечения питательных веществ, хондрогенные факторов роста и газа к клеткам, биореактор предложил механическую стимуляцию. В целом, магнитная технология, используемая для удержания стволовых клеток, в сочетании с динамическим созреванием в биореакторе, может заметно улучшить хондрогенную дифференциацию.

Протокол

1. Построение магнитных устройств

Примечание: Устройства , используемые для посева клеток варьируются в зависимости от применения (рисунок 1). Для формирования агрегатов, количество клеток ограничено до 2,5 × 10 ⁵ / совокупности, так что магнитные наконечники должны быть очень тонкими (750 мкм в диаметре). Для семян на 1,8 см ^2/7 мм толщины строительных лесов, магниты должны быть больше (3 мм в диаметре) и будут обеспечивать миграцию клеток через пору строительных лесов.

1. Конструкция устройства с микро-магнитов для образования агрегатов (Фигура 1А)
   1. Сделать микроотверстия с 0,8-мм сверлом через алюминиевые пластины (3 см в диаметре и толщиной 6 мм).
   2. Вставьте магнитный наконечник (750 мкм в диаметре) в каждое отверстие пластины.
   3. Поместите этот диск через постоянный неодимовый магнит, который обеспечивает намагниченность насыщения.
2. Строительство устройства для строительных лесов высева ( Фигура 1В)
   1. Вырезать жесткий полистирол в 2,4 см ² квадратов.
   2. Вставка 9 маленьких магнитов (3 мм в диаметре, длиной 6 мм) на равном расстоянии над площадью поверхности 1,6 см ^_2.
   3. Поместите это устройство на постоянный неодимовый магнит.

2. Stem Cell Этикетировочное

Примечание: Стволовые клетки метили 0,1 мМ магнитных наночастиц в течение 30 мин (2,6 ± 0,2 пг железа / клеток) с образованием агрегатов, в то время как они были помечены 0,2 мМ магнитных наночастиц в течение 30 мин (5 ± 0,4 пг железа / клеток) семени строительные леса. Эти концентрации наночастиц и времени инкубации были использованы ранее , и опубликованы для MSC и других клеток ^{18, 19,} и было установлено , что наночастицы влияет ни на жизнеспособность клеток , ни потенциала дифференциации MSC. Железа масса включена стволовые клетки измеряли с помощью одного-CeLL магнитофорез ^{19, 20.}

1. Культура человека мезенхимальные стволовые клетки (MSC) в полной среде мезенхимальных стволовых роста клеток (MSCGM) при 37 ° С и 5% СО ₂ до вблизи до слияния (~ 90%).
2. Подготовка магнитного раствора маркировки путем смешивания 0,1 или 0,2 мМ маггемитовой цитрат покрытия оксида железа (γFe ₂ O _3; сердечник: 8 нм в диаметре) в бессывороточной 5 Маккой среды модифицированного Институте Roswell Park Memorial (RMPI) без глутамина и содержащих 5 мМ цитрат натрия.
3. Удалите среды, промыть клетки с бессывороточной RPMI средой без глутамина, и добавляют 10 мл раствора железа оксида наночастиц на 150 см ² культуральной колбы, минимальный объем , необходимый , чтобы покрыть все клетки.
4. Инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С и 5% CO ₂ , а затем выбросить раствор наночастиц. Полоскание в течение 5 мин с бессывороточной RPMI средой без глутамина интернализации в нанoparticles все еще прикреплен к плазматической мембране.
5. Удалите среду RPMI и добавляют 25 мл полной среды MSCGM на колбу. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С и 5% СО _2.

3. Магнитный сотовый Посев

1. Свеже подготовить хондрогенный среду с использованием Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) высокий уровень глюкозы с L-глутамина, добавляя 50 мкМ L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата, 0,1 мкМ дексаметазон, 1 мМ пирувата натрия, 0,35 мМ L-пролин, 1% универсальной культуры добавка, содержащая инсулин, трансферрин человека и селенистой кислоты (ITS-премикса) и 10 нг / мл трансформирующего фактора роста бета-3 (& beta; 3-ТФР).
2. Отделить магнитные клетки с использованием 8 мл 0,05% трипсином-ЭДТА на 150 см ² культуральной колбы и центрифуги диссоциированных клеток при 260 × г в течение 5 мин. Аспирируйте среды и считать ресуспендировали клетки.
3. Поместите прозрачным дном культивирования клеток чашки Петри (35 мм) в верхней части обоих магнитных устройств.
4. Для мagnetically образуют агрегаты, добавляют 3 мл хондрогенной среды в чашке Петри и осторожно депонировать наименьший объем возможного (не более 8 мкл) , содержащий 2,5 × 10 ⁵ клеток на меченых агрегата (до 16 агрегатов могут быть осаждены). Оставьте чашку Петри в течение 20-30 мин , не перемещая его, что позволяет ему формировать сфероиды, а затем поместить полное устройство, в том числе чашки Петри , содержащей 16 заполнителей в инкубатор при 37 ° С и 5% CO _2.
5. агрегаты управления формы по тому же протоколу и заменить полную среду с хондрогенной средой без TGF-В3.
   1. Для того, чтобы генерировать совокупный конструкцию 3D, 2 место агрегатов в контакт на 8-й день, чтобы сформировать 8 дублеты и инициировать синтез. На 11-й день, объединить 2 дублеты с образованием 4 четверок. И, наконец, предохранитель 4 четверок на 15-й день, чтобы получить конечную структуру.
   2. В то же время, образуют агрегаты центрифугирования 2,5 × 10 ⁵ клетки помечены стволовых при 26015; г в течение 5 мин в 15-мл пробирки с 1,5 мл хондрогенной среды с добавлением или без TGF-& beta; 3 (для образца и контроля, соответственно).
6. Магнитны семенных подмости, поместите каждую высушенную леску в чашку Петри. Использование полисахаридные пористых каркасов , изготовленных из пуллулана / декстран ^21. Для каждого помост, развести 2 × 10 ⁶ меченых стволовых клеток в 350 мкл среды без хондрогенной TGF-В3 и осторожно пипеткой клетки на помост.
   1. Инкубировать в течение 5 мин при 37 ° С, чтобы обеспечить проникновение в клетки полного каркаса, а затем осторожно добавляют 3 мл хондрогенной среды с или без TGF-& beta; 3 (для образца или контроля, соответственно) в чашку Петри.
   2. Инкубируйте cellularized леску на его магнитном устройстве при 37 ° С и 5% СО ₂ в течение 4 дней , чтобы обеспечить миграцию клеток через пору строительных лесов и заключение.
7. В то же время, семена строительных лесов с 2 × 10 ⁶ меченые стволовые клетка, следуя тот же метод и инкубировать без магнита, чтобы получить равномерно сеяные строительные леса в качестве положительного контроля.

4. Дифференцирование в хондроциты

Примечание: После 4 дней инкубации, удалить магниты и продолжить хондрогенное созревание либо в чашке Петри (статические условия) или в биореакторе (динамические условия). Отрицательные контрольные образцы выдерживаются в статических условиях при хондрогенной среде без TGF-& beta; 3.

1. В статических условиях, сохранить cellularized подмости или агрегатов в той же чашке Петри. Изменение хондрогенный среду дважды в неделю в течение 21 дней.
2. В динамических условиях, подготовить биореактор.
   1. Вырезать силиконовые трубки на соответствующей длины в соответствии с протоколом производителя.
   2. Автоклав все материалы: 500 мл культуры в камере, насосно-компрессорных, 2-полосная ротаторы, и садках.
   3. Поместите биореактор части в стерильный Microbioлогической безопасности станции. Подключите трубку к 2-полосным ротаторам и к культуре камере в соответствии с инструкциями изготовителя.
   4. Аккуратно перенести cellularized каркасов в стерилизованные клетки с использованием стерильного шпателя. Поместите 2 подмости на клетку. Когда клетки готовы, вставить их в иглы крышки, чтобы держать их от перемещения во время дальнейшего вращения. Заполните камеру культуры с хондрогенной средой и закрыть его с крышкой, содержащей клетку.
3. Включите шланговый насос для заполнения трубки с хондрогенной среды и удаления пузырьков воздуха.
4. Поместите и закрепите камеру, заполненную в двигатель биореактора и включите компьютер, который контролирует вращение оба плеча и камеры.
5. Нанесите скорость вращения 5 оборотов в мин (оборотов в минуту) на обоих руку и камерой. Настройка перистальтического насоса при скорости потока 10 оборотов в минуту для непрерывной подачи из cellularized каркасов.

5. Экстракция РНК и анализ экспрессии генов

Примечание: Перед экстракции РНК, переваривать каркасы с раствором ферментативного.

1. Подготовить 1 мл ферментативного раствора добавлением 100 мкл пуллуланазы (40 ед / мл) и 50 мкл декстраназы (60 мг / мл) до 850 мл свободной от сыворотки DMEM среды.
2. Промыть каркасы дважды бессывороточной DMEM среде, отказаться от среды, и добавить 800 мкл ферментативного раствора на строительных лесов. Инкубировать в течение 15-30 мин при температуре 37 ° С при осторожном перемешивании.
3. Когда каркас полностью растворяется, перенести раствор, содержащий клетки в пробирку 1,5 мл, центрифуге при 300 × г в течение 10 мин, тщательно аспирата среду, в два раза промыть стерильной 1 × фосфатно-солевом буфере (PBS), центрифуге при 300 × г в течение 10 мин, и вновь приостановить клетки в растворе для выделения РНК.
4. Для того, чтобы извлечь РНК из агрегатов, поместите сфероидов в растворе изоляции РНК иполностью подавить их с помощью гомогенизатора перед проведением экстракции РНК.
5. Изолировать РНК с использованием набора для экстракции суммарной РНК в соответствии с инструкциями изготовителя.
6. Синтезировать комплементарную ДНК от 400 нг тотальной РНК с использованием обратной транскриптазы в соответствии с инструкциями производителя, используя 250-нг случайных праймеров, 1 мкл смеси дНТФ (10 мМ каждого), и 40 Ед / мл РНКазы ингибитора; конечный объем реакции 20 мкл. В конце реакции, добавить 80 мкл дистиллированной воды с получением конечного объема 100 мкл.
7. Для количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР), используют смесь ПЦР, содержащий флуоресцентный реагент для количественного определения относительной экспрессии генов, представляющих интерес, таких как аггрекан (AGC) и коллагена II (COL II), 10 × разбавленной кДНК. Нормализация уровней экспрессии генов с рибосомным белком контрольного гена, Большой, Р0 (RPLP0). Выполните расчеты с 2 ^- формула ^ΔΔCT, Где ΔΔCT = & Delta; ЕТ дифференцированное состояние - среднее & Delta; ЕТ состояние управления, и каждый представляет собой & Delta; ЕТ КТ интерес гену - КТ эталонного гену (RPLP0).
8. Определение статистических измерений, как средние значения ± стандартная ошибка среднего (SEM). Выполните анализ с п ≥ 2 независимых экспериментов. Используйте Т-тест Стьюдента для анализа статистических различий между центрифугированными гранулами и магнитным слитыми (* р <0,05). Определяют значение с критерия Крускала-Уоллиса (односторонний ANOVA непараметрической) анализировать статистические различия между дифференцированными подмостей и с контрольной эшафот (* р <0,05).

6. Гистологический анализ

1. Промыть cellularized каркасы или агрегаты со стерильным 1 × PBS, фиксируют их в 10% растворе формалина в течение 1 ч при комнатной температуре, и промывают 1 × PBS.
2. Удалить PBS, встраивать образцы в оптимальном разрезалг Температура соединение (ОКТ), и заморозить их в ванне изопентана, погруженной в жидком азоте. Хранить образец при -20 ° С. Вырезать образцы с криостатом, чтобы получить 8-мкм криосрезов для агрегатов или 12-мкм для cellularized каркасов.
3. Пятно криосрезов с 0,5% толуидиновым синим раствором в течение 2 мин, промыть в водопроводной воде, обезвоживают со 100% -ный этанолом, уточнение с использованием толуола, и смонтировать слайды с монтажной средой для световой микроскопии.

Результаты

Во- первых, агрегаты могут быть индивидуально сформированы с использованием микро-магнитов путем осаждения 2,5 × 10 ⁵ меченых стволовых клеток (фиг.2А). Эти агрегаты одиночные (~ 0,8 мм по размеру), могут быть затем слиты в более крупные структуры, благодаря последовательному, магнитоиндуцированного слияния. Так, например, на 8-е дня хондрогенного созревания, агрегаты были помещены в контакте в парах с образованием дублеты; квадруплетные были собраны на 11-й д...

Обсуждение

Во-первых, потому что методы, представленные здесь, основаны на интернализации магнитных наночастиц, один важный вопрос, является результатом наночастиц, когда они локализуются в клетках. Это верно , что наночастицы железа могут вызвать потенциальную токсичность или нарушенную способность дифференциации в зависимости от их размера, покрытия, и времени экспозиции ^{19, 22.} Тем не менее, некоторые исследования не показали никакого влияния на клеточной физиологии , к...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Наночастицы оксида железа (маггемита) (γ-Fe2O3)	PHENIX - University Paris 6	Сделано и предоставлено C. Mé	nager Средний диаметр 8,1 нм и отрицательный поверхностный заряд
Полисахаридные скаффолды Пуллулан/Декстран	LIOAD - University Nantes	Изготовлен и предоставлен C. Le Visage	Приготовлен из смеси пуллулан/декстрана в соотношении 75:25 в щелочных условиях (10  M NaOH). Пористость: 185-205  &микро; m; Толщина: 7  миллиметр; Площадь поверхности: 1,8  см<суп>2.
Система регенерации TisXell	QuinXell Technologies	QX900-002	Двухосный биореактор с камерой для культивирования объемом 500 мл
Сепаратор для строительных лесов: Histosette II M492	VWR	720-0909
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК)	Lonza	PT-2501	Были использованы три независимые партии
Среда MSCGM BulletKit	Lonza	PT-3001	Для полной среды добавьте прилагаемый набор BulletKit (содержащий сыворотку, глютамин и антибиотики) в среду MSCGM
DMEM с Glutamax I	Life Technologies	31966-021	Без пирувата натрия, без HEPES
RPMI medium 1640, без глютамина	Life Technologies	31870-025	Без пирувата натрия, без HEPES
PBS без CaCl2 без MgCl2	Life Technologies	14190-094
0,05% трипсин-ЭДТА (1x)	Life Technologies	25300-054
Пенициллин (10,000  U/mL) / стрептомицин (10,000  &микро; г/мл)	Life Technologies	15140-122
ITS Premix Универсальная питательная добавка (20x)	Corning	354352
раствор пирувата натрия 100 мМ	Sigma	S8636
L-аскорбиновая кислота 2-фосфат	Sigma	A8960	Приготовьте концентрированный раствор (25 мМ) в дистиллированной воде временно
L-Proline	Sigma	P5607	Приготовьте стоковый раствор 175 мМ, разведенный в дистиллированной воде и храните при 4°нл.; ° C
Дексаметазон	Sigma	D4902	Приготовить 1 мМ стоковый раствор, разведенный в этаноле 100% и хранить при -20°nbsp; ° Белок C
TGF-beta 3 10  &микро; g	Interchim	30R-AT028
Тринатрия цитрат	VWR	33615.268	Приготовьте 1  М стоковый раствор разводят в дистиллированной воде и хранят при 4°nbsp; ° C
Пуллуланаза от Bacillus acidopullulyticus	Sigma	P2986
Декстраназа от Chaetomium erraticum	Sigma	D0443
Набор для экстракции РНК NucleoSpin	Macherey-Nagel	740955.5
SuperScript II Обратная транскриптаза	Life Technologies	18064-014
Random Грунтовка - Hexamer	Promega	C1181	500 & г/мл: Используйте разбавленный 1/2 и положите 1 & микро; L на образец
Рекомбинантные РНК в ингибиторе рибонуклеазы	Promega	N2511	40 U/&микро; L: поставьте 1 & микро; L на образец
ПЦР нуклеотида dNTP смеси (10  mM каждый)	Roche	10842321
SyBr Green PCR Master Mix Life	Technologies	4368708
Step One Plus Real-Time PCR System	Life Technologies	4381792
Формалиновый раствор 10% нейтральный буферизованный	Sigma	HT5012
OCT раствор	VWR	361603E
Изопентан	Sigma	M32631
Толуидин синий O	VWR	1.15930.0025
Абсолютный этанол	VWR	20821.310
Толуол	VWR	1.08323.1000
Монтажная среда Pertex	Histolab	840
RPLP0 Праймер для количественной ПЦР	Eurogentec		5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTAATC CGTCTCCACAGA-3'Aggrecan
Primer for qPCR	Eurogentec		5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'Collagen
II Primer for qPCR	Eurogentec		5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'