Гидравлический экструзионный спинного мозга и выделение спинальных ганглиях в Грызуны

Mette Richner; Sara B. Jager; Piotr Siupka; Christian B. Vaegter

doi:10.3791/55226

Методическая статья

Гидравлический экструзионный спинного мозга и выделение спинальных ганглиях в Грызуны

53K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55226

⸱

22 января 2017 г.

Mette Richner¹ , Sara B. Jager¹ , Piotr Siupka¹ , Christian B. Vaegter¹

¹Department of Biomedicine, Aarhus University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол гидравлической экструзии спинного мозга, а также идентификации и изоляции специфических ганглиев дорсальных корешков (DRG) у одного и того же грызуна. По сравнению со стандартными методами изоляции спинного мозга, этот метод значительно быстрее и снижает риск повреждения тканей.

Аннотация

Традиционно, спинной мозг изолируется с помощью ламинэктомии, т.е. путем вскрытия спинных позвонков по одному. Это отнимает много времени и может привести к повреждению спинного мозга, вызванному процессом расслоения. В этой статье мы покажем, как спинной мозг может быть выдавлен с помощью гидравлического давления. Время обработки значительно сокращается до нескольких минут, что, вероятно, снижает повреждение белка. Низкий риск повреждения тканей спинного мозга улучшает последующий иммуногистохимический анализ. Выполняя гидравлическую экструзию спинного мозга вместо традиционной ламинэктомии, грызунов можно в дальнейшем использовать для изоляции DRG, тем самым снижая количество животных и позволяя проводить анализ тканей одного и того же грызуна. Мы демонстрируем последовательный метод идентификации и изоляции DRG в соответствии с их локализацией относительно берегов. Тем не менее, важно адаптировать этот метод к конкретному используемому животному, так как количество сегментов спинного мозга, как грудных, так и поясничных, может варьироваться в зависимости от типа животного и нагрузки. Кроме того, мы проиллюстрируем примеры дальнейшей обработки выделенных тканей.

Введение

Общая цель этого метода заключается в изоляции спинного мозга, а также для идентификации и выделения ДРГ ^{^1,} ^2. Гидравлический экструзионный спинного мозга является значительно более быстрый метод , чем традиционный способ спинного изоляции шнура путем ламинэктомии, т.е. разбив спинных позвонков по одному за раз, и этот метод уменьшает риск повреждения тканей , вызванные процессом рассечение ^{^3,} ⁴ , DRGs может быть трудно идентифицировать. Правильная идентификация очень важна для анализа тканей, например , после травмы седалищного нерва. Нумеруя ДРГ в соответствии с их локализации по отношению к ребрышками, DRGs могут быть идентифицированы последовательно.

Ткань изолированы с помощью методик , демонстрируемых здесь могут быть применены к широкому спектру анализов , включая Вестерн - блоттинга ^{^5,}6, ⁷ и КПЦР иммуногистохимического окрашивания ^8.

При определении ДРГ, важно учитывать , что число сегментов спинного мозга , как известно, меняются в зависимости от типа животного и деформации ^{^9,} ^{^10,} ^11. Преимущества в выполнении этого метода на мышах, являются большое количество генетически модифицированных вариантов, доступных и относительно низких расходов на жилье. Преимущества в использовании крыс являются сравнительно высокой ткани и, если с участием повреждения нерва, то процедура будет облегчен с размером.

Протокол

Все животные были обработаны в полном соответствии с датскими и европейскими нормами. Номер Разрешение: 2012-15-2934.

1. Подготовка Шприц для гидравлического Extrusion спинного мозга

Для взрослых крыс, используют шприц объемом 10 мл. Для взрослой мыши, используйте 5 мл шприц. Для щенят, используйте 2,5 мл шприц.
Отрегулируйте пипетку без фильтра универсально пригодного для 2-200 мкл пипеток путем обрезки большой конец наконечника пипетки, пока он не подходит плотно к шприцу. Поместите скорректированный наконечник на шприц. Для щенят, используйте 23 G или аналогичную иглу вместо скорректированной наконечника пипетки.
Отберите ледяной стерильной PBS и оставьте шприц на льду до дальнейшего использования.

2. Эвтаназия

Не выполнять шейки дислокации, так как это будет мешать спинных позвонков рендеринга экструзию невозможно.
Для взрослых крыс / мышь, эвтаназии с использованием газа , такого как CO ₂ или isofluRane. Эти вещества являются вредными. Выполните эвтаназию в вытяжном шкафу и обрабатывать вещества в соответствии с директивами учреждения. (ВНИМАНИЕ: CO _2: H280, P410, P403, изофлуран: H361d, P260, P281, P280)
1. Для того, чтобы гарантировать, что грызун умер, обеспечить отсутствие рефлекса, зажимая лапой с помощью пинцета. Обезглавьте грызуна с помощью больших ножниц. Для щенят, эвтаназии путем декапитации.

3. Выделение позвоночнике

Разбрызгивали воду на шерсть, чтобы контролировать волосы.
Используя пару ножниц, разрезать шерсть вдоль позвоночника в дистальном направлении и изолировать позвоночника путем разрезания с обеих сторон вдоль позвоночника мимо тазовой кости. Отрежьте спинной мозг дистально к тазовой кости с парой ножниц.
Примечание: Ростральный-каудальном ось обозначена как проксимальной-дистальной оси на протяжении всего протокола.
1. Обрежьте позвоночника с помощью пары ножниц, чтобы избежать proximal-наиболее и дистальных большинстве районов, поскольку они могут оказать позвоночник слишком S-образную форму для успешного спинного мозга экструзии. Убедитесь, что спинной мозг имеет на обоих концах. Если спинной мозг не видно, обрезать позвоночника с ножницами, пока спинной мозг не станет видимым.

4. Гидравлический экструзионный спинного мозга

Поместите чашку Петри (100 мм в диаметре), заполненной стерильным PBS на льду.
Выпрямите позвоночник, применяя указательный палец на изогнутой части (проксимального наиболее конец) позвоночника, тем самым выпрямление позвоночника в максимально возможной степени.
1. Для щенят, избежать изгиба позвоночника, а позвонки будет нарушена рендеринг спинного мозга экструзию невозможно.
Вставьте наконечник (23 G иглы для щенков, в качестве альтернативы 18 G иглы для взрослых мышей) на дистальных большинстве конце позвоночника. Если вставлена правильно, кончик стабилизируется в спинном полости.
Убедитесь, что позвоночник распрямляется, насколько это возможно. Применить постоянное давление, и прессовать спинного мозга в чашку Петри на льду. Убедитесь в том, что спинной мозг находиться во влажном состоянии на льду не держа его в PBS до дальнейшей обработки.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Типичные спинного мозга. Гидравлически выдавливается спинного мозга. Слева направо: взрослой крысы, взрослой мыши, мыши щенка. Поясничные утолщения отмечен коробкой. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

5. Определение спинальных ганглиях (DRGs)

Разделить позвоночника в двух одинаковых продольных частей с помощью ножниц и место раздвоение позвоночника под микроскопом.
Определить сегмент T13 позвонка путем местонахождение места прикрепления дистального-наиболее ребрышками на позвоночнике обращая внимание, чтобы не путать с ребрышками близлежащих межреберных нервов. Дистальные-большинство ребрышки прикреплены к проксимальной части сегмента позвонка Т13 и Т13 КСГ расположен дистально к позвонка Т13 и проксимально к позвонка L1.
Определить сопутствующую ДРГ в дистальном направлении. Для взрослой крысы, сопутствующее DRGs появляются белые с четко видимой спинных и брюшных корней. Для взрослой мыши, сопутствующее DRGs появляются белые с четко видимой спинных и брюшных корней. Для щенят, сопутствующее DRGs появляются как четкие сферы.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Определение ДРГ в позвоночнике после экструзии спинного мозга. Позвоночник была разделена позволяет визуализировать КСГ, как показано стрелками. ПРИМЕРЕ взрослой крысы и мыши детеныша. исх = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

6. Выделение КСГ

Блюда Количество Петри (диаметром 30 мм) в соответствии с конкретными КСГ быть изолированы, например , L3, L4, L5. Заполните чашки Петри с ледяной стерильной PBS и поместите их на лед.
Использование микро-ножницы, вырезать спинной и брюшной корни как можно ближе к КСГ, как это возможно, чтобы освободить их, избегая при этом повреждения ДРГ.
С помощью кончика закрытых пинцетом, аккуратно выкопайте ДРГ и передавать их в соответствующие пронумерованные чашки Петри.

figure-protocol-3
Рисунок 3: Представитель изолированных ДРГ. Слева направо: взрослой крысы, взрослой мыши, мыши щенка."_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

7. Обработка тканей для дальнейшего анализа

Вестерн-блоттинга
1. Изолировать область ткани интерес, например , спинного мозга расширения поясничного отдела. При необходимости отделить спинной мозг в ипсилатеральных и контралатеральной стороны и далее в спинных и брюшных рога.
2. Поместите ткань в буфере для лизиса , таких как TNE буфера для лизиса (10 мМ Трис-основание, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% NP40 в бидистиллированной H ₂ O) , содержащий соответствующие ингибиторы фермента на льду.
3. Однородный ткани в течение примерно 30 секунд на льду с помощью механического измельчения пестик.
4. Центрифуга в течение 15 мин при 16000 х г при 4 ° С и используют надосадочную жидкость для дальнейшей обработки в соответствии со стандартными протоколами ^{^5,} ⁶ или держать супернатант при -20 ° С до дальнейшего использования.
РНК-анализ
1. Изолировать интересующей ткани.
2. Сразу же место ткани в период стабилизации РНК растворе для стабилизации РНК для хранения.
3. Изолировать РНК в соответствии со стандартными протоколами ^7.
4. Преобразование РНК в кДНК и выполнять КПЦР в соответствии со стандартными протоколами ^7.
иммуногистохимия
1. Для свежезамороженной ткани (применительно к спинному мозгу):
  1. Готовят из сухого льда порошок измельчением сухих кубиков льда в количестве, соответствующем двум столовыми ложками порошка. Накройте сухие кубики льда в ткань и распылить кубов с помощью молотка. Поместите серебряную фольгу (примерно 5 см х 5 см) на слой сухих кубиков льда и покрывают фольгой серебро с сухим льдом порошка.
  2. Поместите область спинного мозга, выбранные для дальнейших анализов на сухой лед порошка с помощью пинцета, пусть оснастке замораживать, и передать спинной мозг к крио трубки. Так держать на сухом льду в любое время или хранить его при температуре -80 ° C до тех пор, пока в дальнейшем наме.
  3. Перенести спинной мозг к криостат (-20 ° С). При необходимости, обрезать спинной мозг внутри криостата. Поместите спинной мозг в встраивание материала внутри криостата для того, чтобы прикрепить ее к образцу диска.
  4. Нарежьте спинного мозга в желаемой толщины, например , 5 мкм, и собрать на стеклянных пластинах. Нагреть стеклянные пластины с пальцем непосредственно перед началом сбора ткани для лучшего крепления. Хранить неизрасходованная ткани в крио пробирках при -80 ° С до дальнейшего использования.
  5. Оставьте секции на стеклянных пластинах внутри криостата до готовности для последующей фиксации.
  6. После фиксации секций путем погружения в 4% PFA в течение 10 мин при комнатной температуре.
  7. Выполнение окрашивания в соответствии со стандартными протоколами ^8.
2. Фиксированный ткани для крио секционирования (применительно к спинному мозгу и КСГ)
  1. Фикс спинной мозг и ДРГ в 4% PFA (2 ч для спинного мозга, 1,5 ч для КСГ мыши и 4 ч для КСГ крыс) в4 ° С (место спинного мозга в горизонтальном положении, чтобы не допустить его фиксации в согнутом положении).
  2. Передача ткани до 25% вес / объем сахарозы в течение ночи при температуре 4 ° С. Ткань может храниться в 25% вес / объем сахарозы с добавлением нескольких капель 10% азида натрия, чтобы предотвратить микробное загрязнение при температуре 4 ° С до дальнейшего использования. При необходимости, обрезать спинной мозг, чтобы компенсировать расширение поясничного только на силиконовой борту или аналогичный.
  3. Используя кончик бумажного полотенца, аспирация избыток раствора сахарозы из ткани.
  4. Заполните крио формы наполовину с вложением материалов. Нажмите пузырьки по бокам крио пресс-формы с помощью инструментов, таких как закрытые пинцетом.
  5. Поместите ткань на вложении материала с помощью пинцета и обеспечить ориентацию желаемой ткани.
  6. Заполните форму крио полностью с вложением материалов и нажать пузырьки подальше от ткани , насколько это возможно (например , при использовании закрытых пинцет).
  7. Заполните чашку Петри (100 ммв диаметре) с 2-метилбутана. Это вещество является вредным. Выполните этот шаг в вытяжном шкафу и обработать веществом в соответствии с директивами учреждения (ВНИМАНИЕ: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310).
  8. Поместите чашку Петри на слой сухого льда и добавить два сухих кубиков льда в чашке Петри. Поместите крио плесень в чашку Петри и позволяют вложение материал замораживать полностью.
  9. Хранить внедренный ткани на сухом льду в любое время или при -80 ° С не обернутой в Parafilm до дальнейшей обработки.
  10. Разрежьте ткань на криостате (-20 ° C) в желаемой толщины, например , 5 мкм.
  11. Выполнение окрашивания в соответствии со стандартными протоколами ^8.
3. Фиксированный ткани для парафиновой-вложении (применимо к спинному мозгу и КСГ)
  1. Закрепить спинной мозг и ДРГ в 4% PFA (2 ч для спинного мозга, 1,5 ч для КСГ мыши и 4 ч для КСГ крыс) при 4 ° С (место спинного мозгав горизонтальном положении, чтобы не допустить его фиксации в согнутом положении).
  2. Передача ткани до 25% вес / объем сахарозы в течение ночи при температуре 4 ° С. Ткань может храниться в 25% вес / объем сахарозы с добавлением нескольких капель 10% азида натрия, чтобы предотвратить микробное загрязнение при температуре 4 ° С до дальнейшего использования.
  3. Изолировать область ткани интерес, например , спинного мозга расширения поясничного отдела.
  4. Заполните вложение формы наполовину с парафином.
  5. Охладить вложение формы кратко, поместив его на охлаждающем области вложения машины слегка затвердеть парафина. Это позволяет добиться более точного позиционирования ткани.
  6. Поместите ткань в желаемой ориентации в вложению пресс-формы. Заполните вложение формы с парафином и охлаждения немедленно.
  7. Поместите парафинсодержащего вложение пресс-формы при температуре 4 ° С в течение ночи, чтобы позволить ей затвердеть полностью и удалить парафиновый блок, содержащий ткань из вложения пресс-формы.
  8. Срезанные участки Oна микротом в желаемой толщины, например , 5 мкм.
  9. Выполнение окрашивания в соответствии со стандартными протоколами ^8.

Результаты

Гидравлически экструдированные спинной мозг отобразить гладкую поверхность неповрежденной , показанную на рисунке 1. Расширение поясничный может быть легко идентифицированы как утолщенной области спинного мозга, в штучной упаковке на фиг.1. Дорсальной и вентральной стороны спинного мозга могут быть идентифицированы с помощью глаз в соответствии с морфологией. На рисунке 1, брюшная сторона обращена к зрителю, опознаваемый одной ясной средней линии вдоль всего спинного мозга. Две широкие линии вдоль спинного мозга позволяют идентифицировать спинной стороне. На дистальном-самые конце концов, конского хвоста могут иногда остаются прикрепленными у взрослых крыс и взрослых мышей.

Индивидуальные DRGs могут быть идентифицированы только в то время как расположенный в позвоночном столбе, на рисунке 2. После выделения, рис 3, отдельные DRGs не могут быть идентифицированы по внешнему виду. В случае необходимости, поэтомуважно, чтобы держать их четко отделены друг от изоляции. После изоляции, спинной мозг и DRGs могут быть обработаны и окрашивали , как описано в пункте 7.3 и представлены на рисунке 4. На рисунке 4а показано иммуногистохимическое окрашивание секции DRG , где нейроны и их глиальные клетки , окружающие спутника отчетливо видны. При правильной идентификации DRG можно проанализировать влияние седалищного нерва травмы на сомы травмированной нейроне, а также на их окружающих спутник глиальных клеток. На фиг.4b показана Нисслю окрашивание гидравлически экструдированного спинного мозга , где ткань неповрежденной отражаемое более гладкими краями разреза.

figure-results-1
Рисунок 4: секции Представительные ткани. A. Иммуногистохимическое окрашивание секции DRG. B. Нисслю витражное Sectioп гидравлически экструдированного спинного мозга. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Если позвоночник нарушается, например , путем смещения шейных позвонков, спинной мозг разделится в процессе экструзии. Если спинной мозг не может быть экструдирован, позвоночник может быть слегка обрезаны на обоих концах, и попытка экструзия можно повторить. В случае , если весь спинной мозг необходим для дальнейшего анализа, т.е. состоящий из цервикального расширения, а также поясничного утолщения, позвоночник должен быть слегка обрезаны только. Если только расширение поясничного необходим для дальнейшего анализа, спинной мозг должен быть отделан в соответствии с настоящим протоколом. Позвоночник должен быть выпрямлены, используя кончики пальцев, чтобы облегчить экструзию.

Протокол применим к грызунам всех возрастов и здесь на примере взрослой мыши (8 недель), щенком мыши (5 дней) и взрослой крысы (10 недель). В зависимости от типа животного и штамма, количество грудного и поясничного секций может изменяться ^{^9,} ^{^10,} ^11. В зависимости от белков, которые будут проанализированы, взрослые грызуны могут быть перфузию ферментных ингибирующих растворов до эвтаназии. При выполнении эксперимента с участием одностороннее повреждение нервов, спинного мозга можно разделить на ипсилатеральных и контралатеральной стороны с использованием ультратонких пинцет сразу после экструзии. Кроме того, каждая из сторон может быть разделена на спинной и брюшной сторон. Ткани могут быть обработаны для дальнейшего анализа, например , Вестерн - блоттинга.

Transcardial перфузия-фиксация с PFA предварительного спинного мозга экструзии следует избегать, так как это делает спинной мозг, не гибкий и предотвращает спинного мозга Гидравлический экструзионный. Гидравлический экструзионный спинного мозга оторвут спинной корни. Для экспериментов, в которых прикреплены спинные корни необходимы, рекомендуется ламинэктомии. Кроме того, спинной мозговых оболочек теряются с помощью гидравлического экструзии, который можно избежать с помощью стандартной ламинэктомии 3.

Гидравлический экструзионный из спинного мозга и DRG изоляции также может быть выполнена с использованием насыщенной кислородом искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) вместо охлажденного льдом PBS. Использование ACSF позволяет сохранение изолированной ткани в более физиологической среде, что особенно важно в случае последующих электрофизиологических записей ^{^12,} ^13. Альтернативой ACSF может быть PBS , содержащий 1 г / л глюкозы для генерации первичных DRG культур ^14.

Гидравлический экструзионный спинного мозга является значительно более быстрый метод, чем традиционный способ спинного мозга изоляции путем ламинэктомии, сокращая время ткани обработки и, следовательно, снижая риск повреждения белка. Перфузия с фиксирующим до отключения спинного мозга ламинэктомии может уменьшить риск повреждения тканей во время рассечения и во время окончательного удаления изспинной мозг от позвоночного столба. Тем не менее, фиксация ткани исключает его применимость к анализов, таких как Вестерн-блоттинга. Гидравлические экструзионные выходы структурно неповрежденной ткани ³ подходит для более широкого спектра анализов.

Последовательное определение КСГ может быть затруднено. Тем не менее, это очень важно для анализа тканей, например , после травмы седалищного нерва. Нумеруя ДРГ в соответствии с их локализации по отношению к ребрышками, DRGs могут быть идентифицированы последовательно. Окрашивание ткани спинного мозга, а также КСГ могут быть оптимизированы путем выполнения проиллюстрированных вариантов обработки ткани, описанной в шаге протокола 7.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Выражаем благодарность Дэвиду Килю из Орхусского университета за съемки и монтаж. Для обработки видеопоследовательностей микроскопов использовалось программное обеспечение VirtualDub. Мы благодарим Датский научно-исследовательский институт трансляционной нейронауки - DANDRITE, Nordic EMBL Partnership за доступ к оборудованию и Исследовательский фонд Орхусского университета, проект ЕС 7FP PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) и Фонд Лундбека за финансирование.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Боннские ножницы, особо тонкие, прямые, 8,5 см	F.S.C. (Fine Science Tools)	# 14084-08	Для вскрытия спинного мозга перед выделением DRG (взрослая мышь, взрослая крыса); Другим производителем может быть использована
центрифуга	Eppendorf	# 5427 R	Для центрифугирования гомогенизированной ткани
Cryostat microtome	Leica Biosystems	# CM 3050 S	Для резки внедренной ткани перед окрашиванием; Другая модель и производитель могут быть использованы
Щипцы, Dumont, # 3	F.S.C. (Fine Science Tools)	# 11231-30	Для обработки спинного мозга после экструзии; Другой производитель/тип может быть использован
Щипцы, Dumont, # 5	F.S.C. (Fine Science Tools)	# 11252-20	Для изоляции DRG (взрослая мышь, взрослая крыса, щенок); Другим производителем может быть использован
Изофлуран (фуран) IsoFlo Vet 100%	Abbott	# 002185	Для эвтаназии; Может быть использован другой производитель; ВНИМАНИЕ: токсичные
изо-пентаны GPR rectapur VWR	химикаты #	24872.298	Для мгновенной заморозки тканей; Может быть использован другой производитель; ВНИМАНИЕ: токсичный
Microtome	Leica Biosystems	# RM 2155	Для срезания парафиновой залитой ткани; У других моделей и производителей могут быть использованы
парафиновые восковые гранулы	Sigma-Aldrich	# 76243	Для заделки парафина; Другим производителем может быть использована
станция для заделки парафиновой ткани	Leica Biosystems	# EG1160	Для заделки парафина в ткань для последующего срезирования; Другая модель и производитель могут быть использованы
Пеллетный пестель, моторный аккумуляторный	Sigma-Aldrich	# Z359971-1EA	Для механической гомогенизации изолированной ткани перед вестерн-блоттингом; Другим производителем может быть использована
чашка Петри, 35 мм	Thermo Fischer Scientific	# 121V	Для хранения изолированных DRG; Другого производителя и размера может быть использована
чашка Петри, 100 мм	Sigma-Aldrich	# P7741	Для экструзии спинного мозга; В зависимости от производителя и размера могут быть использованы
ингибитор фосфатазы, Фостоп	Сигма-Олдрич	# 04906845001	коктейль ингибиторов фосфатазы для добавления к буферу для ТН-лизиса, если это необходимо; Другим производителем может быть использован
наконечник для пипетки, 1-200 мкм; L, без фильтра	Sarstedt	# 70.1189.105	Для гидравлической экструзии; Другим производителем может быть использован
ингибитор протеазы, полный коктейль ингибиторов	Sigma-Aldrich	# 05892791001	протеазы для добавления в буфер для TNE-лизиса, если это необходимо; Другим производителем может быть использован
раствор RNAlater	Sigma-Aldrich	# R0901	Для стабилизации РНК при хранении; Для выделения РНК может быть использован другой производитель
Rneasy Protect Mini KiT	Qiagen	# 74124	У других производителей может быть использован
скальпель; Хирургическое лезвие Swann-Morton No 11	Swann-Morton	# REF0203	Для изоляции поясничной области спинного мозга; Другого производителя/типа могут быть использованы
ножницы, прямые, тип 3, режущая кромка 25 мм	Bochem	# 4070	Для изоляции позвоночника; Другой производитель/тип может быть использован
Ножницы, режущая кромка 130 мм	Hounisen	# 1902.0130	Для изоляции спинного мозга (взрослая крыса)
Пружинные ножницы, прямые, режущая кромка 8 мм	F.S.C. (Fine Science Tools)	# 15009-08	Для разрезания позвоночника перед выделением DRG (щенок) и для изоляции DRG (взрослая мышь, взрослая крыса, щенок); Другими производителями могут быть использованы
стандартные шприцы, 2,5 мл, 5 мл, 10 мл	Terumo	# SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1	Для гидравлической экструзии; Другой производитель может быть использован
Стереомикроскоп MZ12.5 с объективом 1X и окуляром 10X	Leica	# 10446370	Другой производитель/тип может быть использован
Стерильный PBS	GIBCO	# 10010-015	Для гидравлической экструзии; Также может быть изготовлен по стандартным протоколам
Игла шприца 23 G x 1", 0,6 x 25 мм	Terumo Neolus	# NN-2325R	Для гидравлической экструзии у щенков; Другой производитель/тип может быть использован
Игла для шприца 18 G x 1 1/2, 1,2 x 40 мм	Terumo Neolus	# NN-1838S	Альтернатива наконечнику для пипетки для гидравлической экструзии у взрослых мышей; Другой производитель может быть использован
Tissue-Tek	Sakura	# 4583	Tssue встраиваемый материал для последующей криосекции
TNE-лизиса буфера	VWR химикаты	# 10128-582	Для лизиса тканей перед вестерн-блоттингом; Может быть использован другой производитель; Также может быть изготовлен по стандартным протоколам

;

Ссылки

Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).
Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Res Notes. 9, 82(2016).
Kennedy, H. S., Jones, C. 3rd, Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. J Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).
Meikle, A. D., Martin, A. H. A rapid method for removal of the spinal cord. Stain Technol. 56 (4), 235-237 (1981).
JoVE Science Education Database. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
Ogrean, C., Jackson, B., Covino, J. Quantitative real-time PCR using the thermo scientific Solaris qPCR assay. J Vis Exp. (40), (2010).
Crosby, K., et al. Immunohistochemistry Protocol for Parraffin-embedded Tissue Sections - ADVERTISEMENT. , JoVE. Cambridge, MA. https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections (2014).
Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. The Mouse Nervous System. , 1st edition, Academic Press, Elsevier. 424-426 (2012).
Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
Green, E. L. Genetic and non-genetic factors which influence the type of the skeleton in an inbred strain of mice. Genetics. 26 (2), 192-222 (1941).
Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal cord electrophysiology. J Vis Exp. (35), (2010).
Ciglieri, E., Ferrini, F., Boggio, E., Salio, C. An improved method for in vitro morphofunctional analysis of mouse dorsal root ganglia. Ann Anat. , 62-67 (2016).
Peeraer, E., et al. Pharmacological evaluation of rat dorsal root ganglion neurons as an in vitro model for diabetic neuropathy. J Pain Res. 4, 55-65 (2011).

Гидравлический экструзионный спинного мозга и выделение спинальных ганглиях в Грызуны

В этой статье

Краткое содержание

Аннотация

Введение

Протокол

Результаты

Обсуждение

Раскрытие информации

Благодарности

Материалы

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Теги