Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение функции нервно-Джанкшен

18K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55227

⸱

6 августа 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Sapienza University of Rome, 2Institute Pasteur Cenci-Bolognetti, DAHFMO-Unit of Histology and Medical Embryology, Sapienza University of Rome, 3Center for Life Nano Science@Sapienza, Istituto Italiano di Tecnologia

В этой статье

Краткое содержание

Функциональной оценки нервно-Джанкшен (NMJ) может обеспечить важную информацию о связи между мышц и нервов. Здесь мы описываем протокол всесторонне оценить функциональность NMJ и мышц, с использованием двух различных мышц нерва препаратов, т.е. камбаловидной седалищного нерва и диафрагма диафрагмального.

Аннотация

Функциональность нервно-Джанкшен (NMJ) играет решающую роль при изучении заболеваний, в которых связь между двигательного нейрона и мышечные нарушения, такие, как старение и боковой амиотрофический склероз (ALS). Здесь мы описываем экспериментальный протокол, который может использоваться для измерения NMJ функциональность путем объединения двух видов электрической стимуляции: прямой стимуляции мышц мембраны и стимуляции через нерв. Сравнение мышцы реакции на эти два разных стимуляцию могут помочь определить, на функциональном уровне, потенциальные изменения в NMJ, которые приводят к функциональной сокращение мышц.

Ex vivo препараты подходят для хорошо контролируемых исследований. Здесь мы описываем интенсивного протокол измерения несколько параметров мышц и NMJ функциональность для подготовки камбаловидной седалищного нерва и для подготовки диафрагма диафрагмального нерва. Протокол длится около 60 минут и проводится непрерывно с помощью заказной программного обеспечения, который измеряет дергаться кинетики свойства, отношения силы частоты для стимуляции мышц и нервов и двух параметров, специфичных для NMJ функциональность, т.е. отказ синапсах и intratetanic усталость. Эта методология была использована для выявления повреждений в подготовке нерва мышц камбаловидной и диафрагмы с помощью SOD1G93A трансгенные мыши, Экспериментальная модель ALS, что повсеместно overexpresses мутант антиоксидант фермента супероксиддисмутаза 1 (SOD1).

Введение

Нервно-Джанкшен (NMJ) является химический СИНАПС формируется связь между мотор концевую мышечные волокна и аксон мотонейрона терминала. Было показано, что NMJ играть решающую роль, когда связь между мышц и нервов нарушается, как происходит старение или боковой амиотрофический склероз (ALS). Как мышцы и нервные общаться в двунаправленный путь1,2, возможность измерения дефектов NMJ отдельно от мышечные дефекты может обеспечить новое понимание их взаимосвязи выкидышей. Действительно эта функциональная оценка может помочь оценить ли Морфологические и биохимические изменения уменьшить синапсах, сигнализации функциональности.

Сравнение мышц сократительной ответ вызвал стимуляции нерва и ответ же мышцы, вызываемые прямой стимуляции ее мембраны было предложено как косвенное измерение NMJ функциональности. Действительно начиная с мембраны стимуляции путем пропуска синапсах сигнализации, любые различия в двух сократительных реакций можно объяснить изменения в NMJ. Такой подход широко предложил для крыс3,4,5,6,7и также используется для сбора информации о мыши модели8,9,10,,1112.

Здесь мы подробно описать процедуру акцизный и протестировать две мышцы нерва препараты, т. е. камбаловидной седалищного нерва и диафрагма диафрагмального препаратов. С помощью заказной программного обеспечения, мы разработали непрерывного тестирования протокол, который сочетает в себе измерение нескольких параметров, которые характеризуют NMJ и мышц функциональность, тем самым давая всеобъемлющую оценку ущерба NMJ отдельно от этого мышцы. В частности Протокол измеряет силу дергаться, кинетики мышц, кривая силы частот для прямого и нерва стимуляции, отказ синапсах13 для стрельбы и столбнячной частот и intratetanic усталость7.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных были одобрены комитетом по этике Римского университета Сапиенца (Unit of Histology and Medical Embryology) и проведены в соответствии с действующей редакцией Закона Италии о защите животных.

1. Экспериментальная установка

  1. Подготовьте экспериментальную систему, состоящую из 1 актуатора/преобразователя, 2 стимуляторов, 1 установки для исследований мышц in-vitro, 1 подготовительной тканевой ванны, 1 вакуумного электрода, 1 цифрового осциллографа, 1 стереомикроскопа, 1 источника холодного света, 1 платы сбора данных, 1 соединительного блока и персонального компьютера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данной работе управляющее программное обеспечение было разработано в LabView и спроектировано для обеспечения высокой гибкости, точности и повторяемости стимуляции. Для каждого сеанса стимуляции пользователь может выбрать длительность импульса, частоту, продолжительность, а также определить, подается ли сигнал непосредственно на мембрану или через нерв. Пользователь также может задать длительность периода отдыха перед каждой стимуляцией.

2. Оценка сократительных свойств НМС камбаловидной мышцы и диафрагмы

  1. Разминка системы
    1. Приготовьте буфер Кребса-Рингера14, налейте его в ванну монтажного устройства и в подготовительную ванну для тканей. Поместите в подготовительную ванну для тканей чашку диаметром 60 мм, заполненную 4 мл силикона.
    2. Включите циркуляционный водяной термостат и установите температуру 30 °C для камбаловидной мышцы и 27 °C для диафрагмы.
    3. Подайте смесь 95% O2 - 5% CO2 в обе ванны.
    4. Включите актуатор/преобразователь и два импульсных стимулятора; установите значения тока 300 mA для стимуляции мембраны и 5 mA для стимуляции нерва.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ранее было показано, что значение тока 300 mA не вызывает значимого сокращения нервных ветвей при добавлении в раствор D-тубокурарина15. Значение тока 5 mA соответствует силе тока, необходимой для стимуляции мышцы через нерв без перекрытия с мембранной стимуляцией, вызванной раствором. Поскольку расстояние между вакуумным электродом и мышцей зависит от длины нерва, это значение тока необходимо тщательно настраивать перед каждым экспериментом, как описано ниже.
  2. Дизсекция камбаловидной мышцы и диафрагмы
    1. Пожертвуйте мышь путем подвывиха шейных позвонков, чтобы свести страдания к минимуму, и немедленно извлеките мышцы для тестирования следующим образом.
    2. Приготовление, диссекция и установка препарата «камбаловидная мышца — седалищный нерв»
      1. Опрыскайте ногу мыши 70% этанолом и снимите кожу с ноги. С помощью ножниц сделайте разрез в верхней части ноги, затем плотно оттяните кожу. Изолируйте ахиллово сухожилие от большеберцовой кости, после чего перережьте ахиллово сухожилие ножницами.
      2. Плотно зажмите сухожилие пинцетом и аккуратно потяните икроножную мышцу вместе с камбаловидной. Как только проксимальное сухожилие камбаловидной мышцы станет доступным, перережьте всю голень ножницами, продолжая удерживать ахиллово сухожилие. Немедленно поместите образец ткани в подготовительную ванну.
      3. Поместите подготовительную ванну под стереомикроскоп и закрепите голень в силиконовой чашке с помощью стальных штифтов диаметром 0,20 мм. С помощью пинцета зажмите проксимальное сухожилие камбаловидной мышцы и осторожно потяните его, чтобы обнажить седалищную иннервацию.
      4. После обнажения иннервации (Рисунок 1) осторожно удалите окружающие ткани, чтобы освободить около 5 мм нерва. Используйте тонкие ножницы, чтобы перерезать нерв. Плотно зажав проксимальное сухожилие камбаловидной мышцы пинцетом, снова потяните его и извлеките мышцу, перерезав ахиллово сухожилие ножницами.
      5. Пропустите нейлоновую нить через отверстие рычага актуатора/преобразователя. Сделайте петлю на конце нити, захватите ахиллово сухожилие и потяните нить обратно, пока мышца не достигнет ванны монтажного устройства. Зафиксируйте проксимальное сухожилие в неподвижном зажиме и привяжите нейлоновую нить к рычагу. Дайте мышце уравновеситься в растворе.
      6. Определите начальную оптимальную длину (L0).
        1. Сначала растяните мышцу, чтобы создать предварительную нагрузку 10 mN (это значение обеспечивает максимальную силу одиночного сокращения, исходя из опыта). Затем осторожно растягивайте мышцу, меняя предварительную нагрузку, и стимулируйте ее серией одиночных импульсов. Оптимальная длина достигается при измерении максимальной силы одиночного сокращения.
    3. Приготовление, диссекция и установка препарата «диафрагма — диафрагмальный нерв»
      1. Опрыскайте кожу мыши 70% этанолом. Снимите кожу, покрывающую диафрагму, сделав разрез над грудиной ножницами и плотно оттянув кожу.
      2. С помощью ножниц сделайте горизонтальный разрез брюшной полости ниже грудины и аккуратно удалите кишечник и органы пинцетом. Используйте массивные ножницы, чтобы перерезать позвоночник.
      3. Перережьте ребра примерно в 1 см над грудиной, двигаясь горизонтально. Аккуратно удалите внешние органы пинцетом и перережьте позвоночник, чтобы получить кольцо ребер, содержащее диафрагму.
      4. Промойте препарат в чашке с буфером Кребса-Рингера, затем поместите его в силиконовую чашку внутри подготовительной ванны для тканей верхней стороной вверх, грудиной вперед.
      5. С помощью стереомикроскопа осторожно удалите легкие и остальные органы; диафрагмальный нерв будет виден с правой стороны (Рисунок 2A).
      6. Обрежьте ребра так, чтобы вдоль всей диафрагмы осталось кольцо шириной около 2 мм.
      7. С помощью пинцета зафиксируйте один стальной штифт диаметром 0,20 мм на центральном сухожилии диафрагмы в точке, соответствующей иннервации диафрагмального нерва, и другой штифт на ребрах по той же оси, чтобы определить интересующую полоску диафрагмы.
      8. Зафиксируйте два дополнительных штифта на центральном сухожилии и еще два штифта на ребрах по обе стороны от выбранной полоски, чтобы расправить диафрагму. При необходимости очистите диафрагмальный нерв от окружающей соединительной ткани с помощью пинцета.
      9. С помощью изогнутого лезвия сделайте надрезы диафрагмы по обе стороны от места иннервации, чтобы выделить полоску «сухожилие-мышца-ребро», как показано на Рисунке 2B.
      10. Пропустите нейлоновую нить через отверстие рычага актуатора/преобразователя. Сделайте петлю на конце нити, захватите сухожилие и потяните нить обратно, пока мышца не достигнет ванны монтажного устройства.
      11. Зафиксируйте ребра в неподвижном зажиме и привяжите нейлоновую нить к рычагу.
      12. Дайте мышце уравновеситься в растворе и определите начальную оптимальную длину (L0).
        1. Растяните мышцу, чтобы создать предварительную нагрузку 5 mN. Осторожно растягивайте мышцу, меняя предварительную нагрузку, и стимулируйте ее серией одиночных импульсов. Оптимальная длина достигается при измерении максимальной силы одиночного сокращения.

Диссекция ткани под микроскопом; манипуляции с образцом с помощью пинцета; метод микроскопии; образовательное использование.
Рисунок 1 - Препарат камбаловидной мышцы и седалищного нерва. Камбаловидная мышца и седалищный нерв во время хирургической операции для проведения функциональных тестов. Седалищный нерв обнажен с помощью пинцета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Микрофотография препарированной ткани, сравнивающая окрашенные и неокрашенные образцы для структурного анализа.
Рисунок 2 - Препарат «диафрагма — диафрагмальный нерв». На снимках показаны этап иссечения препарата «диафрагма — диафрагмальный нерв» (A) и полоска ткани, предназначенная для установки в систему функциональных тестов (B). Нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в большем размере.

  1. Измерение свойств НМС независимо от сократимости мышц
    1. Установите оптимальную интенсивность тока для стимуляции через нерв и убедитесь, что импульсы тока, подаваемые через вакуумный электрод, не вызывают сокращения мышц вследствие растекания тока в ванне.
      1. Поместите вакуумный электрод рядом с мышцей и втяните нерв. Осторожно увеличивая интенсивность тока (начиная с 5 mA), стимулируйте мышцу серией одиночных импульсов. Оптимальное значение тока определяется по достижению максимальной силы сокращения.
      2. Вытолкните нерв из электрода и подайте несколько одиночных импульсов. Убедитесь, что мышца не сокращается из-за перекрытия со стимуляцией мембраны через раствор. Снова втяните нерв.
    2. Запустите программу и выберите входной файл для выполнения требуемого протокола тестирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Входной файл содержит все параметры стимуляции, необходимые для реализации всего протокола. Несмотря на то, что для обеих мышц используется одна и та же структура протокола, параметры стимуляции различаются в зависимости от того, относится ли протокол к камбаловидной мышце или диафрагме.
      1. Стимуляция камбаловидной мышцы — седалищного нерва (см. Таблицу 1)
        1. Для всех видов электрической стимуляции используйте следующие длительности импульса: 1.4 ms для стимуляции седалищного нерва и 0.1 ms для прямой стимуляции камбаловидной мышцы. Полный протокол занимает примерно 65 min.
      2. Стимуляция диафрагмы — диафрагмального нерва (см. Таблицу 2)
        1. Для всех видов электрической стимуляции используйте следующие длительности импульса: 1.8 ms для стимуляции диафрагмального нерва и 0.2 ms для прямой стимуляции диафрагмы. Полный протокол занимает примерно 55 min.
      3. По завершении экспериментального протокола измерьте длину и влажный вес мышцы, используя аналоговый штангенциркуль с точностью 0.05 mm и прецизионные весы с точностью 0.1 mg соответственно.
        1. Вычислите площадь поперечного сечения (CSA), разделив массу мышцы на произведение оптимальной длины волокна (Lf) и плотности скелетных мышц млекопитающих (1.06 mg/mm3)16.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Lf получают путем умножения L0 на отношение длины волокна к длине мышцы (0.71 для камбаловидной мышцы16 и 1 для диафрагмы17).
Тип экспериментаЧастотаПродолжительностьПовторностиСтимуляция мышц или нервовЦель
(Гц)(с)
ПодергиваниеОдиночный импульс1МышцаСила и кинетика одиночного сокращения
Отдых30
ПодергиваниеОдиночный импульс1Нерв
Отдых30
ПодергиваниеОдиночный импульс1Мышца
Отдых30
ТреморОдиночный импульс1Нерв
Отдых120
Нефузионный столбняк400.81НервКривые зависимости силы от частоты при стимуляции нервов и мышц
Отдых180
Неслитый столбняк600.81Мышца
Отдых180
Слитый столбняк800.81Нерв
Отдых180
Нефузионный столбняк200.81Мышца
Отдых180
Неслитый столбняк600.81Нерв
Отдых180
Слитый столбняк800.81Мышца
Отдых180
Неслитый столбняк200.81Нерв
Отдых180
Неслитый столбняк400.81Мышца
Отдых300
Парадигма утомления350.81 стимуляция мышцы, за которой следуют 14 стимуляций нерва с интервалом отдыха 1,2 с между каждой; цикл повторяется 20 разНарушение нейротрансмиссии (НН)
Отдых900
Парадигма утомления800.81 стимуляция мышцы, за которой следуют 14 стимуляций нерва с интервалом отдыха 1,2 с между каждой, повторенное 20 разНарушение нейротрансмиссии (НН) и интратетаническая усталость (ИУ)

Таблица 1 — Протокол стимуляции камбаловидной мышцы и седалищного нерва. В таблице приведена последовательность тестов, составляющих полный протокол исследования препаратов камбаловидной мышцы и седалищного нерва.

Тип экспериментаЧастотаПродолжительностьПовторностиСтимуляция мышц или нервовЦель
(Гц)(с)
ПодергиваниеОдиночный импульс1МышцаСила и кинетика одиночного сокращения
Отдых30
ТикОдиночный импульс1Нерв
Отдых30
ПодёргиваниеОдиночный импульс1Мышца
Отдых30
ПодергиваниеОдиночный импульс1Нерв
Отдых120
Неслитый столбнячный токсин600.51НервКривые зависимости силы от частоты при стимуляции нервов и мышц
Отдых120
Слитный столбняк1000.51Мышца
Отдых180
Нефузионный столбняк400.51Нерв
Отдых120
Несросшийся столбняк200.51Мышца
Отдых120
Неслитый столбняк800.51Нерв
Отдых150
Неслитый столбняк800.51Мышца
Отдых150
Неслитый столбняк200.51Нерв
Отдых120
Слитый столбняк1000.51Мышца
Отдых150
Слитный столбняк1000.51Нерв
Отдых180
Неслитый столбняк600.51Мышца
Отдых300
Парадигма утомления350.331 стимуляция мышцы, за которой следует 14 стимуляций нерва с интервалом отдыха 0,67 с каждая, повторяется 20 разНарушение нейропередачи (НП)
Отдых900
Парадигма утомления800.331 стимуляция мышцы с последующими 14 стимуляциями нерва с интервалом отдыха 0,67 с между каждой, повторить 20 разНарушение нейротрансмиссии (НН) и интратетаническая утомляемость (ИУ)

Таблица 2 — Протокол стимуляции диафрагмы и диафрагмального нерва.В таблице приведена последовательность тестов, составляющих полный протокол исследования препаратов диафрагмы и диафрагмального нерва.

3. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: В конце протокола рассчитайте все необходимые параметры следующим образом.

  1. На основе стимуляции одиночным импульсом
    1. Рассчитайте силу одиночного сокращения (mN; максимальная активная сила, развиваемая при сокращении) и удельную силу одиночного сокращения (mN/mm2). Рассчитайте её, вычтя значение начальной предварительной нагрузки из максимальной силы, развиваемой мышцей. Рассчитайте удельную силу одиночного сокращения как отношение силы одиночного сокращения к площади поперечного сечения (CSA) мышцы.
    2. Рассчитайте время до достижения пикового напряжения (TTP) (ms) как интервал времени от подачи импульса до развития силы одиночного сокращения.
    3. Рассчитайте время половины релаксации (1/2RT) (ms) как интервал времени от пика силы одиночного сокращения до снижения силы до 50% от максимальной.
    4. Рассчитайте dF/dt (mN/ms) как максимальное значение производной силы по времени в фазе сокращения.
    5. Рассчитайте -dF/dt (mN/ms) как максимальное значение производной силы по времени в фазе расслабления.
  2. На основе стимуляции сериями импульсов
    1. Рассчитайте несуммированную силу (mN) и удельную несуммированную силу (mN/mm2). Рассчитайте её, вычтя значение начальной предварительной нагрузки из максимальной силы, развиваемой мышцей. Рассчитайте удельную несуммированную силу как отношение несуммированной силы к CSA мышцы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несуммированная сила — это максимальная активная сила, развиваемая при подаче серии импульсов с частотой ниже тетанической частоты.
    2. Рассчитайте тетаническую силу (mN) и удельную тетаническую силу (mN/mm2); максимальная сила в данном случае — это максимальная активная сила, развиваемая при подаче серии импульсов с тетанической частотой. Рассчитайте её, вычтя значение начальной предварительной нагрузки из максимальной силы, развиваемой мышцей. Рассчитайте удельную тетаническую силу как отношение тетанической силы к CSA мышцы.
    3. Постройте кривую зависимости силы от частоты. Нанесите на график значения силы (или удельной силы), полученные при каждой стимуляции, в зависимости от возрастающей частоты стимуляции. Обычно график начинается со стимуляции одиночным импульсом и заканчивается тетанической частотой.
  3. На основе парадигм утомления
    1. Рассчитайте сбой нейротрансмиссии (NF) по формуле:
      Формула NF для расчета процента, уравнение для математического анализа и интерпретации данных.
      где MF — снижение силы после стимуляции мышцы, а F — снижение силы после стимуляции нерва, измеренное на первой серии импульсов после стимуляции мышцы.
    2. Рассчитайте внутритетаническое утомление (IF) по формуле:
      Формула статического равновесия, уравнение IF=Flp/Fm%, диаграмма для образовательного анализа.
      где Flp — сила, развиваемая мышцей при последнем импульсе стимуляции, а Fm — максимальная сила, развиваемая мышцей в течение той же серии импульсов. При стимуляции нерва рассчитайте внутритетаническое утомление по первой серии импульсов непосредственно после прямой стимуляции.

4. Статистический анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Модели статистического анализа должны выбираться в зависимости от того, сравнивается ли мышечный ответ на стимуляцию нерва и мембраны внутри одной и той же модели животного или между двумя разными моделями животных18,19.

  1. Используйте t-критерий Стьюдента для TTP, 1/2RT, dF/dt, -dF/dt, если сравниваются только ответы мышц на прямую и непрямую стимуляцию. Если сравниваются препараты мышц, полученные от двух разных линий мышей, используйте двухфакторный дисперсионный анализ (2-way ANOVA), где фиксированными факторами являются тип стимуляции и линия мышей. Если двухфакторный ANOVA дает статистически значимый результат, используйте тесты множественных сравнений для выявления статистических различий.
  2. Для кривой зависимости силы от частоты (при сравнении только ответов мышц на прямую и непрямую стимуляцию) используйте двухфакторный ANOVA, где фиксированными факторами являются тип стимуляции и частота стимуляции. При необходимости используйте тесты множественных сравнений.
    1. При сравнении препаратов мышц, полученных от двух разных линий мышей, используйте трехфакторный ANOVA, где фиксированными факторами являются тип стимуляции, частота стимуляции и линия мышей.
      1. Если трехфакторный ANOVA выявляет значимый эффект факторов линии животного и типа стимуляции, используйте двухфакторный ANOVA для определения значимых различий между двумя группами за один раз. Например, можно оценить различия в ответе мышц двух групп на мембранную стимуляцию или различия между ответами мышц на прямую и непрямую стимуляцию внутри одной группы.
  3. Интратетаническое утомление
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку протокол был разработан для индуцирования утомления в ответ на стимуляцию нерва даже у контрольных мышей, этот параметр можно использовать только для исследования различий между двумя линиями мышей; статистический анализ внутри одной группы всегда будет давать значимые различия.
    1. Для сравнения двух групп используйте трехфакторный ANOVA, где фиксированными факторами являются тип стимуляции, время и линия мышей. Если трехфакторный ANOVA выявляет значимый эффект факторов линии животного и типа стимуляции, используйте двухфакторный ANOVA для определения значимых различий между двумя группами за один раз, как и в случае с кривой зависимости силы от частоты.
  4. Для анализа нарушения нейротрансмиссии используйте двухфакторный ANOVA, где фиксированными факторами являются линия животного и время. При получении значимых результатов используйте тесты множественных сравнений для поиска статистических различий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку этот параметр дает только одно значение для каждой линии мышей, он позволяет сравнивать различные модели мышей.
  5. Для анализа массы, длины и площади поперечного сечения (CSA) мышц используйте t-критерий Стьюдента для выявления различий при сравнении препаратов «мышца-нерв» от разных моделей животных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Протокол, который мы описали содержит информацию о функциональных денервации в несколько нервно-мышечных заболеваний или старения саркопения. Этот протокол может использоваться для определения (и, если да, то на каком уровне) мышечные изменения, из-за избирательного изменения, которые происходят в мышцах, сам или в нервно-мышечной передачи. Данные, показанные ниже приведены результаты предыдущей работы нашей группы18, проведенных на SOD1G93A трансгенные ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Экспериментальный протокол, описанные выше обеспечивает идеальный способ измерения и дискриминацию любые функциональные изменения, которые произошли непосредственно в мышцы или косвенно на уровне нервно-Джанкшен. Так как эта техника основана на косвенные измерения NMJ функциональность, не может использоваться для создания, если неисправность связана морфологические изменения или биохимические изменения. Наоборот она предоставляют эффективный способ определения ли Морфологические и биохимические изменения сократили синапс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Работа в лаборатории авторов было поддержано Fondazione рома и "Телетон" (Грант нет. GGP14066).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Двухрежимная рычажная система Аврора Сайентиал Инк.Привод/преобразователь300B
Мощный двухфазный стимулятор Аврора Сайентиал Инк.701BПульсовый стимулятор (нерв)
Мощный двухфазный стимулятор Аврора Сайентиал Инк.701CПульсовый стимулятор (мышцы)
Мышечный аппарат in vitro Аврора Сайентиал Инк.800А
Подготовительная тканевая ваннаRadnoti158400
Монополярный всасывающий электродА-М Системы573000с самодельным артикулом 
Осциллограф TektronixTDS2014
СтереомикроскопNikonSMZ 800
Осветитель холодного света Фотонная оптикаPL 3000
Плата сбора данныхNational InstrumentsNI PCIe-6353
Блок разъемовNational InstrumentsNI 2110
Персональный компьютерAMD Phenom II x4 970Процессор 3,50 ГГц с Windows 7
LabView 2012 программное обеспечениеNational Instruments
Krebs-Ringer Bicarbonate Буфер Сигма-ОлдричК4002 физиологический буфер
Бикарбонат натрияSigma-AldrichS5761 
Хлорид кальция CaCl2Sigma-AldrichC4901безводный, порошкообразный, ≥ 97%
Буфер HEPESSigma-AldrichH3375≥ 99,5% (титрование)
Посуда 60 мм x 15 ммFalcon353004полистирол
силиконSylgard 184 Силикон Набор эластомеров  0,5 кг.
ТермостатDennerleDigitalDuomat 1200
НасосNewa MiniMN 606для аквариума
Термостойкость ТермокабельLucky Reptile61403-150/60 Гц 50 Вт
Ведролюбое 10 литровПолипропилен
O2 + 5% CO2siadMix gas
#5 ЩипцыИнструменты для тонкой науки11252-202 предмета
Пружинные ножницы - 8 мм ЛезвияИнструменты для тонкой науки15024-10Иссечение нерва
Острые ножницы Инструменты для изобразительной науки 14059-11Удаление мышц
Деликатные ножницыВагнера02.06.32наружная часть животного
Студент Ручка скальпеля #3Fine Science Tools 91003-12 
Лезвия для скальпеля # 10Fine Science Tools 10010-00
Лезвия скальпеля # 11Инструменты для тонкой науки 10011-00
нейлоновая проволока & Oslash; 0,16 ммлюбой

Ссылки

  1. Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
  2. Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
  3. Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
  4. Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
  5. Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
  6. Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
  7. Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
  8. Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
  9. Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
  10. Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871(2008).
  11. Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
  12. Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
  13. Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
  14. Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
  15. Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
  16. Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
  17. Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
  18. Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
  19. Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
  20. Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

SOD1 G93A
Измерение функции нервно-Джанкшен
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.