Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Быстрое удаление продукта в грибах через

9.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55239

⸱

12 июня 2017 г.

 ,  ,  , 
1Toxicology and Mycotoxin Research Unit, NPRC, USDA-ARS, 2Hazera Seeds LTD, Brurim, 3Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea “La Mayora” - Universidad de Málaga - Consejo Superior de Investigaciones Científicas (IHSM-UMA-CSIC), Estación Experimental “La Mayora”

В этой статье

Краткое содержание

Мутанты делеции генов, продуцируемые посредством гомологичной рекомбинации, являются золотым стандартом для исследований функций генов. Описан метод OSCAR (одноступенчатое построение Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) для быстрой генерации делеционных конструкций. Последующая трансформация, связанная с Agrobacterium. Наконец, представлен метод подтверждения на основе ПЦР делеции генов в трансформантах грибов.

Аннотация

Точное удаление интересующего гена (генов), оставляя остальную часть генома неизменным, обеспечивает идеальный продукт для определения функции конкретного гена в живом организме. В этом протоколе описан метод OSCAR точной и быстрой делеционной плазмидной конструкции. OSCAR опирается на систему клонирования, в которой проводится одна реакция рекомбиназы, содержащая очищенные ПЦР-амплифицированные 5 'и 3' фланки представляющего интерес гена и две плазмиды, pA-Hyg OSCAR (вектор маркера) и pOSCAR (сборка вектор). Подтверждение правильно собранного вектора удаления осуществляется путем преобразования рестрикционного переваривания с последующим секвенированием. Agrobacterium tumefaciens затем используют для опосредования введения делеционной конструкции в грибковые споры (называемые ATMT). Наконец, описан ПЦР-анализ, чтобы определить, включена ли делеционная конструкция, объединенная гомологичной или негомологичной рекомбинацией, указывая удаление гена илиЭктопическая интеграция, соответственно. Этот подход был успешно использован для делеции многочисленных генов в Verticillium dahliae и в Fusarium verticillioides среди других видов.

Введение

Генетическая диссекция является мощной методологией для определения функциональной значимости отдельных или комбинаций генов. Стандартный подход к пониманию роли конкретных генов - это производство мутантов с одним геном, неизмененных в любом другом геном. Самым мощным и наименее потенциально запутанным подходом является полное и точное удаление открытой рамки считывания гена (GOI ORF) без повреждения любой другой функции гена.

Поскольку стандартные подходы к лигированию для образования делеционной плазмиды требуют нескольких этапов, рациональное для OSCAR 1 должно было обеспечить более быстрый подход in vitro . На рисунке 1 показан процесс сборки в подходе OSCAR. Описанный здесь способ имеет преимущество сочетания быстрой конструирования отдельных векторов делеции генов в одной множественной реакции в сочетании с последующим агробактерием tumefaciens, опосредованным transfo(ATMT). OSCAR очень быстрый и хорошо сравнивается с другими стратегиями, такими как использование сборки Gibson в дрожжах 2 . Метод OSCAR успешно использовался с несколькими видами грибов Ascomycota. Эти виды включают: Fusarium verticillioides (неопубликованные), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. зр. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 и Dothistroma septosporum 9 и Sarocladium zeae (неопубликованные) .

Этот протокол обеспечивает пошаговую инструкцию для метода, включающего в себя схему праймера, фланковую ПЦР-амплификацию, реакцию OSCAR BP, подтверждение структуры конструкции удаления, трансформациюИон Agrobacterium с конструкцией, за которой следует перенос делеционной конструкции на ATMT в грибковые клетки, и, наконец, дифференцировать мутанты делеции грибов от тех, которые имеют эктопически интегрированные делеционные конструкции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Принцип праймера для ПЦР-амплификации генных флангов

  1. Загрузите в файл обработки слов геномную область интересующего гена (GOI), включая открытую рамку считывания (ORF) и по меньшей мере 2 kb, фланкируя ген с каждой стороны от FungiDB или другого ресурса геномных данных.
  2. Выделите ORF, предназначенную для удаления и кодонов запуска и остановки метки.
  3. Определите и выделите соседние ORF в загруженной последовательности.
  4. Используйте 2 КБ 5'-конец ORI GOI и инструмент для создания грунтовки (см. Список материалов) для разработки пары праймеров ПЦР O1 и O2 для получения продукта минимального размера 1 кб. Следите за тем, чтобы не воздействовать на соседние ORF.
    1. Вставьте бок 2 kb 5 'в окно «Последовательность ввода». Нажмите «Показать пользовательские параметры». Введите следующие настраиваемые параметры дизайна: праймер TM 58 (мин), 60 (опт) и 62 (макс.); Грунтовка GC 40 (мин), 50 (опт) и 60 (макс); Размер праймера 22 (мин), 24 (опт) и 26(Максимум); Ампликон Размер 1250 (мин), 1500 (опт) и 2000 (макс.).
    2. Выберите результат, который помещает обратный праймер (O2) ближе всего к ORF. Захватите экранный снимок анализов и скопируйте и вставьте последовательности праймеров в документ обработки текста.
    3. Повторите процесс для 3'-фланков для создания праймеров O3 и O4, на этот раз выберите результат, поместив передний праймер (O3) ближе всего к целевой ORF.
  5. Добавьте соответствующие сайты прикрепления к 5'-концу праймеров с 1 по 4 (см. Таблицу 1 ).
  6. Также спроектируйте и закажите специфические праймеры ORF, которые будут использоваться для подтверждения удаления в разделе 4 ниже. Параметры должны быть такими же, как на этапе 1.4.1, за исключением использования Amplicon Size 500 (min), 750 (opt) и 1000 (макс.) Для регулировки длины ORF, если необходимо. Наконец, для подтверждения гомологичных рекомбинантов, выведите 5'-и 3'-праймеры, обнаруженные только за пределами флангов внутри хромосомы. Эти «внешние» праймеры будут использоваться сHygR (210) и hygF (850) соответственно ( рис. 2 ).
  7. Заказать праймеры.

2. Производство конструкций OSCAR

  1. Используя hi-верность Taq, выполняйте две реакции: по одному для 5 'и 3' боков, используя праймеры (100 мкМ) O1 и O2 в одной реакции и праймеры O3 и O4 во втором. Реакционная смесь содержит следующее: 29,5 мкл стерильной дистиллированной воды (SDW), 5 мкл 10 × LA ПЦР-буфера, 8 мкл 2,5 мМ смеси dNTP, 5 мкл 25 мМ MgCl 2 , 1 мкл (50 нг / мкл), 0,5 мкл hi- Верность Taq , 0,5 мкл Primer O1 и 0,5 мкл Primer O2 для 5'-фланков (или 0,5 мкл Primer O3 и 0,5 мкл Primer O4 для 3'-фланка). Условия реакции следующие: 94 ° C в течение 1 минуты, затем 30 циклов 94 ° С в течение 30 с, 60 ° С в течение 30 с, 72 ° С в течение 2 мин, затем конечные стадии 72 ° С в течение 5 мин и затем неограниченно сохраняют при 10 ° С.
  2. Запустите 0,8%Агарозу 1x TAE (40 мМ Трисацетат, pH 8,3, 1 мМ ЭДТА), гель-электрофорез для приблизительно 125 Вт в стандартном мини-аппарате для определения размера продукта и относительной концентрации. Пост окрашивает гель с неэтидиевым пятном в соответствии с инструкциями производителя. Визуализируйте на УФ-осветителе.
  3. Если 5 'и 3' боковые продукты находятся в примерно ровной концентрации, объедините их и используйте комплект аффинной колонки (или ПЭГ-осаждение 90 мкл комбинированных продуктов ПЦР, 240 мкл ТЕ буфера, рН 7,5, 160 мкл 30% полиэтиленгликоля PEG8000 30 мМ MgCl 2 ) совместно очищать продукты ПЦР в соответствии с протоколом изготовителя. Если они не имеют одинаковой концентрации, объедините все продукты с низкой концентрацией с приблизительно равным количеством продукта из реакции с более высоким выходом.
  4. Используйте спектрофотометр для измерения концентрации очищенной ДНК.
  5. Проведите реакцию BP путем смешивания следующего: 1 мкл 60 нг / мкл pOSCAR, 2 мкл 60 нг /ΜL pA-Hyg-OSCAR, 1 мкл комбинированных боков в 60 нг / мкл, 1 мкл клоназы. Инкубируйте в течение 16 ч при 25 ° С. Прекратите реакцию, добавив 0,5 мкл протеиназы K и инкубируйте в течение 10 минут при 37 ° C.
  6. Преобразование высокой компетентности E. Coli . Как коммерчески доступные компетентные клетки, так и самодельные компетентные клетки DH5α CaCl 2 успешно использовались в качестве реципиентов, как описано в инструкциях производителя. Пластина на низком натриевом (0,5 г / л NaCl) LB, содержащем 100 мкг / мл спектиномицина (Spec).
  7. Определите правильную конструкцию, выполнив минипипсы ДНК 10 колоний, сгенерированных выше. Выполните двойное переваривание с помощью Hin dIII и Kpn I следующим образом: пипеткой 5 мкл ДНК, 2 U каждого фермента, 2 мкл подходящего 10-кратного буфера с SDW до общего объема 20 мкл. Это высвобождает вставку (приблизительно 4,5 кб с фланцами гена 1,5 кб) из вектора ( около 7 кб) и разрезает любые сайты вФланки, которые могут давать предсказуемые размеры полос.
  8. Последовательность 11 выбирает клоны, показывающие соответствующий шаблон группировки.

3. Agrobacterium tumefaciens опосредованная трансформация (ATMT) грибов

  1. Трансформация Agrobacterium tumefaciens штамма AGL1 с помощью функции удаления OSCAR 12 .
  2. Трансформируйте гриб с AGL1, содержащий плазмиду делеции GOI OSCAR. Для этого выполните следующие действия:
    1. Подготовьте суспензию спор гриба со стерильной водой по 2 × 10 6 спор / мл. Определите количество споров на гемоцитометре или автоматическом счетчике клеток. Поместите 500 мкл этого в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. Эта настройка предназначена для 4 пластин преобразования.
    2. Используйте синюю стерильную одноразовую петлю, чтобы добавить легко видимый росток (должен покрывать около 20% диаметра петли) делеционной плазмиды, содержащей AGL1, из среды 2-3 дня LB-Spec 100 (см. MAterials Список композиции), содержащие планшеты, и перемешать в суспензию спор. Вихрь до бактериальных клеток хорошо диспергирован ( около 5 мин средней скорости).
    3. Внесите 100 мкл суспензии конидий-Агро в центр мембранного фильтра целлюлозы, помещенного на каждую из четырех чашек Петри 6 см, содержащих среду для совместной культивирования 12 .
    4. Распределите суспензию стерильными стеклянными шариками (около 4), чтобы покрыть всю поверхность мембранного фильтра. Альтернативно раскладывайте подвеску, используя традиционный инструмент для разбрасывателя. Дайте фильтровальному фильтру высохнуть в капюшоне в течение приблизительно 10 минут, оберните его парафиновой пленкой. Повторите шаги 3.2.2 и 3.2.3, чтобы настроить несколько преобразований.
    5. Инкубируйте планшет в течение 2 дней при комнатной температуре, перевернутый.
    6. Перенесите мембранный фильтр на 6 см. Среднюю среду для выделения Aspergillus 12 пластинок, содержащих гигромицин B (Hyg) 150 мкг / мл, 200 мМ цефотаксима и 100 мкг / млмоксалакты. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 5-7 дней перед тем, как изолировать устойчивые к глюкозе колонии.
    7. С помощью стерильных зубочисток переносите предполагаемые трансформанты на пластинки из 6 грамм картофельного декстроза (PDA), содержащие 150 мкг / мл Hyg, 100 мкг / мл канамицина.

4. Идентификация мутантного удаления с помощью ПЦР

  1. Экстракция ДНК для ПЦР из трансформантов путем термолиза 13 .
    1. Когда трансформанты образуют колонии на КПК с шага 3.2.7, используйте стерильную зубочистку для переноса небольшого количества (2 мм х 2 мм) мицелия или дрожжевых клеток из колонии в 100 мкл раствора для лизиса (50 мМ фосфата натрия, pH 7,4, 1 мМ ЭДТА, 5% глицерина) в микроцентрифужной пробирке.
    2. Инкубируйте смесь при 85-90 ° С в течение 20-30 мин. Храните сырой экстракт, содержащий геномную ДНК, при -20 ° C до использования на стадии 4.2.
  2. Проведите 4 реакции ПЦР на трансформант, по одному на dEtym гомологичная рекомбинация 5 'и 3' боков, соответственно, одна для селектируемого маркера (в этом случае гигромицинфосфотрансфераза) и одна для ORF GOI.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Обычно мы используем недорогие низкочастотные Taq для этих реакций. Условия реакции такие же, как описано на стадии 2.1 выше, и содержат SDW 20 мкл, 10x Taq-буфер 2,5 мкл, dNTPS (10 мМ) 0,5 мкл, домашний Taq 14 , 0,5 мкл, праймер A (100 мкМ) 0,5 мкл, праймер B (100 мкМ ) 0,5 мкл, образец 0,5 мкл. Более низкие концентрации праймеров (10 мкМ) можно использовать одинаково хорошо.
  3. Запустите агарозный гель ( например, 0,8%) продуктов ПЦР. Мутанты делетирования будут продуцировать группу Hyg, но не продукт ORF. Эктопические интеграторы покажут обе полосы. Дикий тип будет генерировать только полосу ORF.
  4. Надолго сохраняйте мутанты удаления (и эктопический трансформант или два для элементов управления) для будущего использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 15% глицерина используется дляДолгое время растягивали наши штаммы при -80 ° C.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Метод OSCAR в одной реакции генерирует плазмиду, содержащую фланки гена-мишени, подлежащие удалению, окружающие селектируемую маркерную кассету. Производство делеционных конструкций с использованием OSCAR очень эффективно. Однако система может создавать частичные конструкции, содержащие некоторые, но не все три фрагмента (две грани флага и выбираемый маркер). Как правило, большинство трансформантов E. coli содержат правильную конструкцию OSCAR. Например, на рисунке 2

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Одноступенчатое конструирование плазмид Agrobacterium-Recombination-ready-PLASID (OSCAR) было успешно использовано с постоянно растущим числом грибов Ascomycota. Этот метод также может быть легко применим к Basidiomycota и видам из других грибковых фил (с соответствующими промоторами, управляющими селектируемыми маркерными генами), предполагая , что возможна трансформация, обусловленная Agrobacterium, и гомологичная рекомбинация. Дополнительные маркерные векторы были созданы для диверсификации...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят следующих студентов и старшеклассников за их работу по созданию мутантов OSCAR в Fusarium verticillioiodes : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez , Эшли Крепсак, Джефф Деланг, Христианский король, Джи Чжон, Мария Беллинг, Кристи Берре, Даниэль О'Мира, Лорен (Виктория) Кук, Джейк Гудман, Самприти Де, Оге Окой, Алисса Бекстед, Гарретт Хиббс, Ник Гольдштейн, Кэролайн Твайм , Крис Бенсон, Луис Стокс, Ханна Ителл, Джейн Хьюлс, Джасим Мохаммед, Джеймс Логгинс, Келли Рассел, Грениша Джонс, Кристин Шеффер, Мариам Хаммади, Ава Уилсон, Катрина Баземоре, Тони Харпер, Карлин МакГи, Мохмед Момин, Рима Момин , Thi Ngoc Le и Angel Pham.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
FungiDBDatabase/ http://fungidb.org/fungidb/
IDT PrimerQuestIDTPrimer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
Работа с файламиMicrosoft Word
Low Na LB Spec 100 mediumE. coli трансформантная селекция, состав: 1% триптон, 0,05% NaCl, 0,5% экстракт дрожжей, 1,5% агар если для твердой среды
Совместное культивирование средаиндукция трансформации ATMT (Ссылка 12)
Aspergillus минимальная среда с гигромициномГрибной трансформант селекции
PDA средаAcumedia7149AОдна спора наклонная трубка
PDA-Hyg-Kan mediumВыделение грибного рансформанта, PDA, содержащий 150 мкм; г/мл гигромицина В и 100 мкм; г/мл Канамицин
Стеклянные бусиныGenlantisC400100Пластина для разбрасывания
Нитроцеллюлозные фильтры (47 мм)Fisher09-719-555Совместное культивирование для ATMT
Различные сантифугальные пробиркимногократные препы
Пластины Петри (различные)Культивирование бактерий и грибков
pA-Hyg OSCARAddgene29640Выбираемый маркерный вектор
pOSCARAddgene29639Сборочный вектор
DH5α One Shot Компетентный E. coli cellsLife Technologies 12297-016Реакция BP трансформация
ccdB выживание клеток E. coliLife Technologies A10460Техническое обслуживание pOSCAR
Деревянные палочкиКолонии
Зубочистки
МикроцентрифугаГранулирование бактерий и т.д.
Препаративная центрифугаСбор грибковых спор
микроскоп Микроскоп выделение спор
Автоматизированный счетчикРасчет суспензии спор
Составной микроскопГемоцитометр подсчет клеток
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen28104ПЦР очистка флангового продукта
TaKaRa LA Taq Takara Bio СШАRR002AHi Fidelity taq полимераза для бокового поколения OSCAR
Гигромицин BInvivoGenant-hg-5
SpectinomycinSigma22189-32-8
ЦефотаксимTCI AmericaC2224
Канамицин11815032
МоксалактамSigma-Aldrich43963
GelRed  Phenix Research ProductsRGB-4103Агарозные гели после окрашивания
Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (кат. No 28104) 
(OneShot_ Mach1TM T1R или One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R от Invitrogen) Thermo Fisher ScientificC862003
Gateway BP Clonase II Смесь ферментовThermo Fisher Scientific11789020Используется для сборки делеционной конструкции в pOSAR
Sequence для переноса для сбора колоний Препаративный для препарирования клеток

Ссылки

  1. Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).
  2. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  3. Klosterman, S. J., et al. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens. PLoS Pathog. 7 (7), (2011).
  4. Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Phytopathology. 103 (6), 641-647 (2013).
  5. Xu, C., et al. A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii. PloS One. 9 (9), (2014).
  6. Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Microbiology. 161, 875-883 (2015).
  7. Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora. Ann Microbiol. 65 (4), 2151-2160 (2015).
  8. Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration. PloS One. 10 (5), e0125960(2015).
  9. Chettri, P. Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand . , Massey University. Manawatu, New Zealand. (2014).
  10. Chen Zhou,, Yujun Yang,, Jong, A. Y. Mini-prep in ten minutes. Biotechniques. 8 (2), 172(1990).
  11. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. P Natl Acad SciUSA. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  12. Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). Agrobacterium Protocols. Wang, K. an 2, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 403-420 (2007).
  13. Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains. Lett Appl Microbiol. 51 (1), 114-118 (2010).
  14. Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21 (20), 4850-4851 (1993).
  15. McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , Springer International Publishing. 361-384 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Делеция генаконструирование плазмидыспоры грибовПЦР-анализрестрикционный анализгомологичная рекомбинацияэктопическая интеграцияустойчивость к гигромицинуметод OSCAR
Быстрое удаление продукта в грибах через
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.