Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Биофизический Характеристика функций флагеллярный Motor

7.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55240

⸱

18 января 2017 г.

 ,  , 
1Artie McFerrin Department of Chemical Engineering, Texas A&M University

В этой статье

Краткое содержание

Последние результаты показывают, что бактериальные жгутиковые моторы воспринимают различные сигналы окружающей среды и ремоделируются в ответ. Ожидается, что обсуждаемые здесь анализы гранул помогут объяснить роль ремоделирования в клеточной адаптации к стрессовым факторам окружающей среды.

Аннотация

Роль жгутиковых моторов в бактериальной подвижности и хемотаксисе хорошо изучена. Недавние открытия свидетельствуют о том, что жгутиковые моторы способны реконструироваться в ответ на различные раздражители окружающей среды и являются одними из триггеров поверхностной колонизации и инфекций. Точные механизмы, с помощью которых моторы ремоделируются и способствуют клеточной адаптации, вероятно, зависят от ключевых моторных характеристик. Представленный здесь метод отслеживания бусин на основе фотоумножителя позволяет точно определять биофизические характеристики двигательных функций, включая адаптацию скоростей мотора и динамики переключения. Такой подход дает преимущество отслеживания в режиме реального времени и возможность исследовать поведение моторики в течение длительного времени. Обсуждаемые протоколы могут быть легко расширены для изучения жгутиковых моторов у различных видов бактерий.

Введение

Флагеллярный моторы позволяют клеткам плавать путем вращения спиральных внеклеточные нити. Величина крутящего момента двигателя может генерировать для заданной длины жгутика (т.е. вязкое нагрузки) определяет скорость плавания. С другой стороны, его способность переключать направление вращения контролирует миграцию клеток в ответ на химические вещества, процесс, известный как хемотаксис. Хемотаксиса и моторику быть факторов вирулентности 1-3, жгутиковые моторы были хорошо охарактеризованный в течение многих лет 4. Монтаж доказательств в настоящее время предполагает , что двигатель работает как mechanosensor - механически обнаруживает присутствие твердых субстратов 5,6. Эта способность , вероятно , помогает в инициировании поверхности колонизации и инфекции 5,7. В результате, механизмы , посредством чего двигатель органов чувств поверхности и инициирует передачу сигналов имеют значение 8,9.

Флагеллярный двигатель может быть легко изучена привязывать к flagellмкм на подложку, и наблюдая вращение клеток. Такое прикрепление впервые была достигнута Silverman и Саймона, который работал с polyhook мутанта в E.coli и успешно прикрепленными крючками на стеклянных подложках с анти-крючками антител 10. Анализ привязанный-клеток позволило исследователям изучить ответы мотор-переключателя на различные химические раздражители. Например, Сегалл и сотрудниками химически стимулировали привязных клеток с помощью ионофореза пипеток. Соответствующие изменения в CW смещения (доли времени двигателей вращаются по часовой стрелке, CW) позволило им измерить кинетики адаптации в хемотаксиса сети 11,12. В то время как анализ привязи клеток был эффективен при изучении ответов переключателя, он был только в состоянии дать представление о автомехаников в ограниченном диапазоне нагрузок вязких 13. Чтобы преодолеть эту проблему, Рю и его сотрудники привязных сферических латексных бисером нити накала заглушек на клетки, застрявших на поверхности. Шарикизатем отслеживается с помощью обратного фокусного интерферометрии со слабыми оптическими ловушками 14. Работая с бисером разных размеров, исследователи смогли изучить двигатель в гораздо более широком диапазоне нагрузок. Этот анализ был позже улучшен Юань и Берг, который разработал ФЭУ на основе методики шарика слежения в сочетании с лазерной темнопольной освещения. Их метод позволил трекинга привязных золота nanobeads , которые были настолько малы (~ 60 нм) , что внешние вязкие сопротивления были ниже по сравнению с внутренними вязкими сопротивлений вращения 15,16. Это привело к измерениям максимально достижимой скорости в E.coli (~ 300 Гц). В В. alginolyticus, подобные бусинки анализы позволили измерения скорости прядения при промежуточных вязких нагрузках (~ 700 Гц) 17. Обеспечивая измерения двигательных реакций во всем возможном диапазоне вязких нагрузок (от нулевой нагрузки до ближайшей кабинке), шарик-анализы обеспечили важный биофизический инструмент, чтобы понять тПроцесс Orque поколения 18,19.

Недавно мы изменили анализ Юань-Берг включают в себя оптические пинцеты , которые позволили нам применить точные механические стимулы для отдельных двигателей 6. Используя эту технику, мы показали, что силовые генераторы, которые вращают двигатель являются динамическими механосенсоров - они реконструируют в ответ на изменения в вязких нагрузок. Возможно, что такие нагрузки зондирования вызывает дифференцировку клеток в роящимися бактерий, хотя механизмы остаются неясными. Также вероятно , что жгутиковые моторы у других видов также являются механочувствительных 20, хотя прямых доказательств не хватает. Здесь мы рассмотрим фотоумножителя на основе (ФЭУ) подход для отслеживания вращения латексными шариками привязанных к жгутиковых нитей 15. По сравнению с трекинг с сверхбыстрых камерами, ФЭУ-установки является предпочтительным, так как оно является относительно простым для отслеживания одиночных бусин в режиме реального времени, и в течение длительного ТМОции. Это особенно полезно при изучении давний ремоделирования в жгутиковых двигательных комплексов за счет внешних стимулов 21. Хотя мы и протоколы подробно конкретно в отношении E.coli, они могут быть легко адаптированы для изучения жгутиковых моторов у других видов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка сотового

  1. Расти в течение ночи культуры желательного штамма , несущего липкую FLIC аллель 15,22 в триптонового Broth (туберкулез, 1% пептона, 0,5% NaCl) с последующей прививкой при разведении 1: 100 в 10 мл свежего туберкулеза. Расти культуры при 33 ° C в шейкере инкубаторе до OD 600 = 0,5.
  2. Гранул клеток при 1500 мкг в течение 5 - 7 мин , и повторное диспергирование осадка энергично в 10 мл стерилизованной ультрафильтрацией буфера моторики (MB, 10 мМ фосфатный буфер: 0,05-0,06 М NaCl, 10 -4 М ЭДТА, 1 мкМ метионин, рН 7,0).
  3. Повторите шаг 1,2 еще два раза и вновь разогнать конечный осадок в 1 мл МБ.
  4. Shear суспензии путем пропускания назад и вперед ~ 75 раз между двумя шприцами с 21 до 23 калибровочных адаптеров, соединенных полиэтиленовых труб (7 - длиной 12 см, 0,58 мм внутренний диаметр). Ограничить общее время для стрижки 30 - 45 сек.
  5. Центрифуга стриженого клетки при 1500 мкг в течение 5-7 мин и вновь разогнатьОсадок в 100 - 500 мкл МБ.

2. Подготовка слайдов

  1. Подготовьте камеру формирования изображения с помощью двух прослаивая двусторонней клейкой ленты между покровным стеклом и предметное стекло. Для хемотаксиса, используют любую микрожидкостных камеру, которая дает возможность обмена МБ и химических стимуляторов.
  2. Добавить 0,01% поли-L-лизина в камере и через 5 мин осторожно промойте поверхности с МБ (80 - 100 мкл).
  3. Добавьте 40 мкл клеточной суспензии в камеру и обеспечить достаточное время для прикрепления к поверхности стекла (7 - 8 мин). Растекаемость отклеили клетки путем добавления 100 мкл MB на одной стороне камеры, в то время как затекания раствора с фильтровальной бумагой с другой стороны.
  4. Добавить 10 - 15 мкл латексных шариков в камеру и дайте бусин достаточное время, чтобы обосноваться и прикрепляться к клеткам (7 - 8 мин). Осторожно промыть 100 мкл MB, как описано в пункте 2.3, чтобы удалить неприклеенный бусинки. Использование диапазона бисерной-сиZES для экспериментов так долго, как хороший контраст доступен.

3. Шарик слежения

  1. Поместите образец на предметный столик микроскопа и сканировать поверхность для бусинок, прикрепленных к моторам. Использование цели с 40X фазы для наблюдений, хотя фазовая микроскопия не является необходимым. В качестве альтернативы, используют томографию светлого поля до тех пор, достаточный контраст сохраняется, чтобы четко различать яркий шарик на темном фоне.
  2. После того, как шарик был выбран, перемещать сцену в боковом направлении, чтобы поместить шарик в заранее заданный угол , как показано на фигуре 1В. Позиция бус на тот же угол, чтобы гарантировать, что направление вращения шарика правильно известно. Идеальная траектория шарика приблизительно круговой траектории, но эллиптические допустимы.
  3. Поддерживать частота дискретизации выше, чем в два раза частоты вращения двигателя, чтобы избежать ошибок, связанных с совмещением имен. В этой работе, использовать двигатель, который вращается со скоростью50 Гц и выборка на частотах, которые были в 10 раз выше (500 Гц), для получения гладкой сигнала.

Анализ 4. Данные

  1. Центр и масштабировать выходные напряжения ФЭУ и правильную эллиптичность в траектории с аффинных преобразований при необходимости 23. С помощью анализа спектра мощности для определения скорости вращения 17.
  2. Определение полярных углов, θ (т) = ATAN (у (т) / х (т)). Определить изменения в скоростях двигателя и переключение с течением времени путем вычисления Q, figure-protocol-1 14.
  3. Наймите медианный фильтр для сглаживания данных скорости двигателя. Окно фильтра в течение двух полных оборотов рекомендуется 23,24.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Установка ФЭУ показана на рисунке 1А. Важно, что ФЭУ имеют высокую чувствительность в диапазоне длин волн, рассеянных бусинок, представляющих интерес. ФЭУ, используемые здесь работают в видимом и ближнем инфракрасном диапазонах, и были в состоянии обнаружить рассеивание света шариков, освещаемых источником света галогенов. Оптимальные условия освещения и напряжения питания будет варьироваться от одной установки к другой. Для установки , используемой в данной работе возни...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для того чтобы облегчить привязанный шарик-отслеживание и правильную оценку моторных крутящих моментов, следующая информация должна быть пересмотрена. При выполнении этих измерений с помощью жгутиковых клеток, отрезные является важным шагом. Стрижка уменьшает флагеллярной нить к простому заглушкой, тем самым гарантируя , что вязкое нагрузка на двигатель является преимущественно из - за борта и может быть оценена в пределах 10% погрешности 16. Стрижка также повышает шансы найти круговые траектории с плотно рас...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы выражают признательность Говарду Бергу за подарок в виде микроскопа/фотоумножителя для слежения за бусинами и за средства, предоставленную Техасской инженерной экспериментальной станцией A&M.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Раствор поли-L-лизина (0,1%)Sigma-AldrichP8920http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US
Polybead MicrospheresPolysciences, Inc.7307http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US
1 мл шприц со скользящим наконечником LuerExel Int.26048http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php
Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-го калибраBecton, Dickinson and Company427565http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp
полиэтиленовые трубкиHarvard Apparatus59-8325http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html
Фотоумножитель ТрубкиHamamatsuR7400U-20Спектральный диапазон отклика от 300 до 920 нм, Пиковая длина волны 630 нм, время отклика 0,78 нс 
http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html
3 x 1 мм прецизионные щелиEdmund OpticsNT39-9082 щели, установленные под прямым углом друг к другу на фотоумножителях
ОсциллографTektronixTBS 1032BПриемлемы альтернативные бренды. Цифровой осциллограф, серия TBS 1000B, 2 аналоговых, 30 МГц, 500 MSPS, 2,5 kpts 
http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope
8-полюсный фильтр LP/HPKrohn-Hite3384Альтернативные бренды приемлемы. Рекомендуется диапазон частот от 0,1 Гц до 200 кГц.    
http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf
Микроскоп Optiphot NikonNAМожно использовать любой вертикальный или инвертированный фазовый микроскоп.
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754
50:50 (R:T) Кубический светоделительThorLabsBS013

Ссылки

  1. Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
  2. Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).
  3. Kao, C. Y., et al. The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).
  4. Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).
  5. McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
  6. Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).
  7. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
  8. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
  9. Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).
  10. Silverman, M., Simon, M. Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility. Nature. 249, 73-74 (1974).
  11. Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation Kinetics in Bacterial Chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
  12. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).
  13. Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
  14. Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio. Nature. 403, 444-447 (2000).
  15. Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
  16. Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).
  17. Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus. J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).
  18. Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
  19. Meacci, G., Tu, Y. Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).
  20. Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards. Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).
  21. Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. Response thresholds in bacterial chemotaxis. Sci Adv. 1 (9), e1500299(2015).
  22. Berg, H. C., Turner, L. Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli. Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).
  23. Bai, F., et al. Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch. Science. 327, 685-689 (2010).
  24. Reid, S. W., et al. The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).
  25. Chen, X., Berg, H. C. Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli. Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).
  26. Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor. Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Биофизический Характеристика функций флагеллярный Motor
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.