Последние результаты показывают, что бактериальные жгутиковые моторы воспринимают различные сигналы окружающей среды и ремоделируются в ответ. Ожидается, что обсуждаемые здесь анализы гранул помогут объяснить роль ремоделирования в клеточной адаптации к стрессовым факторам окружающей среды.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Биофизический Характеристика функций флагеллярный Motor
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Роль жгутиковых моторов в бактериальной подвижности и хемотаксисе хорошо изучена. Недавние открытия свидетельствуют о том, что жгутиковые моторы способны реконструироваться в ответ на различные раздражители окружающей среды и являются одними из триггеров поверхностной колонизации и инфекций. Точные механизмы, с помощью которых моторы ремоделируются и способствуют клеточной адаптации, вероятно, зависят от ключевых моторных характеристик. Представленный здесь метод отслеживания бусин на основе фотоумножителя позволяет точно определять биофизические характеристики двигательных функций, включая адаптацию скоростей мотора и динамики переключения. Такой подход дает преимущество отслеживания в режиме реального времени и возможность исследовать поведение моторики в течение длительного времени. Обсуждаемые протоколы могут быть легко расширены для изучения жгутиковых моторов у различных видов бактерий.
Введение
Флагеллярный моторы позволяют клеткам плавать путем вращения спиральных внеклеточные нити. Величина крутящего момента двигателя может генерировать для заданной длины жгутика (т.е. вязкое нагрузки) определяет скорость плавания. С другой стороны, его способность переключать направление вращения контролирует миграцию клеток в ответ на химические вещества, процесс, известный как хемотаксис. Хемотаксиса и моторику быть факторов вирулентности 1-3, жгутиковые моторы были хорошо охарактеризованный в течение многих лет 4. Монтаж доказательств в настоящее время предполагает , что двигатель работает как mechanosensor - механически обнаруживает при....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка сотового
- Расти в течение ночи культуры желательного штамма , несущего липкую FLIC аллель 15,22 в триптонового Broth (туберкулез, 1% пептона, 0,5% NaCl) с последующей прививкой при разведении 1: 100 в 10 мл свежего туберкулеза. Расти культуры при 33 ° C в шейкере инкубаторе до OD 600 = 0,5.
- Гранул клеток при 1500 мкг в течение 5 - 7 мин , и повторное диспергирование осадка энергично в 10 мл стерилизованной ультрафильтрацией буфера моторики (MB, 10 мМ фосфатный буфер: 0,05-0,06 М NaCl, 10 -4 М ЭДТА, 1 мкМ метионин, рН 7,0).
- Повторите шаг 1,2 еще два раза и вновь разогнать конечный ос....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Установка ФЭУ показана на рисунке 1А. Важно, что ФЭУ имеют высокую чувствительность в диапазоне длин волн, рассеянных бусинок, представляющих интерес. ФЭУ, используемые здесь работают в видимом и ближнем инфракрасном диапазонах, и были в состоянии обнаружить рассеивание света шариков, освещаемых источником света галогенов. Оптимальные условия освещения и напряжения питания будет варьироваться от одной установки к другой. Для установки , используемой в данной работе возни.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Для того чтобы облегчить привязанный шарик-отслеживание и правильную оценку моторных крутящих моментов, следующая информация должна быть пересмотрена. При выполнении этих измерений с помощью жгутиковых клеток, отрезные является важным шагом. Стрижка уменьшает флагеллярной нить к простому заглушкой, тем самым гарантируя , что вязкое нагрузка на двигатель является преимущественно из - за борта и может быть оценена в пределах 10% погрешности 16. Стрижка также повышает шансы найти круговые траектории с плотно рас.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы выражают признательность Говарду Бергу за подарок в виде микроскопа/фотоумножителя для слежения за бусинами и за средства, предоставленную Техасской инженерной экспериментальной станцией A&M.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Раствор поли-L-лизина (0,1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 мл шприц со скользящим наконечником Luer | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-го калибра | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| полиэтиленовые трубки | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Фотоумножитель Трубки | Hamamatsu | R7400U-20 | Спектральный диапазон отклика от 300 до 920 нм, Пиковая длина волны 630 нм, время отклика 0,78 нс http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3 x 1 мм прецизионные щели | Edmund Optics | NT39-908 | 2 щели, установленные под прямым углом друг к другу на фотоумножителях |
| Осциллограф | Tektronix | TBS 1032B | Приемлемы альтернативные бренды. Цифровой осциллограф, серия TBS 1000B, 2 аналоговых, 30 МГц, 500 MSPS, 2,5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8-полюсный фильтр LP/HP | Krohn-Hite | 3384 | Альтернативные бренды приемлемы. Рекомендуется диапазон частот от 0,1 Гц до 200 кГц. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Микроскоп Optiphot Nikon | NA | Можно использовать любой вертикальный или инвертированный фазовый микроскоп. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 | |
| 50:50 (R:T) Кубический светоделитель | ThorLabs | BS013 |
Ссылки
- Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
- Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
