Условный Перепрограммирование педиатрический человеческого пищеводного эпителиальных клеток для использования в тканевой инженерии и профилактике заболеваний Исследование

Краткое содержание

Расширение педиатрических пищеводных эпителиальных клеток человека с использованием условного перепрограммирование обеспечивает исследователей с населением конкретного пациента клеток, которые могут быть использованы для проектирования пищеводные конструкции для аутогенной имплантации для лечения дефектов или травм, и служить в качестве резервуара для терапевтических методов скрининга.

Аннотация

Идентификация и расширение специфических для пациента клеток в культуре для использования в тканевой инженерии и исследовании заболеваний может быть очень сложной задачей. Использование различных типов стволовых клеток для получения интересующих типов клеток часто является дорогостоящим, трудоемким и крайне неэффективным. Кроме того, нежелательные типы клеток должны быть удалены перед использованием этого источника клеток, что требует еще одного этапа процесса. Для того, чтобы получить достаточное количество эпителиальных клеток пищевода для создания просвета пищеводной конструкции или для скрининга терапевтических подходов к лечению заболеваний пищевода, нативные эпителиальные клетки пищевода должны быть расширены без изменения их экспрессии генов или фенотипа. Условное перепрограммирование эпителиальной ткани пищевода предлагает многообещающий подход к расширению эпителиальных клеток пищевода, специфичных для пациента. Кроме того, эти клетки не нуждаются в сортировке или очищении и возвращаются в зрелое эпителиальное состояние после удаления их из культуры условного перепрограммирования. Этот метод был описан во многих исследованиях скрининга рака и позволяет бесконечно расширять эти клетки по нескольким проходам. Возможность проведения скрининговых анализов пищевода поможет революционизировать лечение детских заболеваний пищевода, таких как эозинофильный эзофагит, путем выявления триггерного механизма, вызывающего симптомы у пациента. Для тех пациентов, которые страдают от врожденного дефекта, заболевания или травмы пищевода, этот источник клеток может быть использован в качестве средства для создания синтетической конструкции для имплантации с целью восстановления или замены пораженной области.

Введение

инженерия пищеводного ткани и эозинофильный эзофагит (EoE) были в центре внимания исследований во многих лабораториях за последнее десятилетие. Врожденные дефекты, такие как атрезия пищевода, наблюдаются примерно в 1 в 4000 родившихся живыми, что приводит к неполному развитию пищевода , приводящей к невозможности съесть ^1. Заболеваемость и распространенность Eoe были на подъеме с тех пор определение сущности болезни в 1993 году заболеваемость Eoe колебалась от 0,7 до 10/100000 на человеко-год , а распространенность колебалась от 0,2 до 43 / 100,000 ^2. Новый привлекательный хирургический подход к лечению длительного перерыва атрезия пищевода состоит в создании конструкции ткани для имплантации с использованием собственных клеток пациента. Эти клетки в сочетании с синтетическим подмостей произведет аутологичной конструкцию, которая не требует иммуносупрессии. Некоторые группы уже начали исследовать насе стволовых клеток, как для тканевой инженерии пищеводного ^3, а также использование местных эпителиальных клеток пищевода заселить слизистую оболочку ^{4 - 7.} Болезни, которые присутствуют в пищевод педиатрических пациентов часто трудно диагностировать или изучать без вмешательства. Кроме того, использование модели на животных или в пробирке увековечены модели клеточной линии для педиатрических заболеваний , как Eoe не охватывают точную патогенез заболевания или пациента специфические различия ^8. Таким образом, способность изучать процесс болезни пациента в пробирке с целью выявления конкретных заболеваний вызывая антигены, оценить основные механизмы и исследования лекарственной терапии было бы новым и предоставить врачам информацию , которая может помочь в лечении пациента.

Там было много аутологичных или пациент-специфические типы клеток, которые были предложены для использования в Tissuэлектронной инженерии и изучения патогенеза заболеваний человека. Тем не менее, некоторые из этих типов клеток ограничены в их способности генерировать достаточное количество клеток специфического фенотипа семян большой помост или выполнить высокую пропускную способность в пробирке исследования. Использование плюрипотентных или мультипотентных стволовых клеток была темой многих исследований , обсуждения, однако, ограничения и недостатки использования этих клеток были хорошо описаны ^9. Использование человеческих эмбриональных стволовых клеток широко обсуждаемого и представляет множество этических проблем. Самое главное, что эти клетки образуют тератомы, которые похожи на опухоли, если они не отличаются от их плюрипотентных состояния перед подачей их в живом хозяине ^10. Кроме того, использование эмбриональных стволовых клеток , не было бы специфическая для пациента и может вызвать реакцию аллогенных и необходимость подавления иммунитета ^10. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) являются плюрипотентные клетки, которые могутбыть получены из собственных клеток пациента. Соматические клетки, такие как клетки кожи, могут быть вызваны в плюрипотентное состояние, используя различные интегративные и не интегративные методов. Эти клетки затем служат в качестве пациента специфических клеточных источников для тканевой инженерии или расследования заболеваний. Интеграция нежелательного генетического материала в этих клетках вызывает озабоченность многие из них описаны и даже если последовательности полностью удаляются иПСК появляются , чтобы сохранить эпигенетическую "память" по отношению к типу клеток , из которых они были получены ^11. Эти клетки также будут образовывать тератомы в естественных условиях , если не дифференцируются до трансплантации ^11. Многие протоколы дифференцировки, сосредоточенные на эпителиальных родословных ^{12, 13, 14,} тем не менее, очень важно отметить , что типы клеток , в результате в конце дифференцировки не однородны и Oолько обладают фракцию типа клеток, представляющих интерес. Это приводит к низкой производительности и необходимость очистить желаемый тип клеток. Хотя иПСК являются потенциальным пациентом конкретный источник клеток, процесс получения типа клеток, представляющих интерес для обеих тканевой инженерии или расследования болезней очень неэффективно.

Человеческие эпителиальные клетки были успешно выделены из различных обоих больных и не пораженных тканей в организме человека в том числе: ¹⁵ легких, рака молочной железы ^16, тонкой кишки, толстой кишки ^{17 18,} мочевого пузыря ¹⁹ и пищевода ^20. Важно отметить , что первичные клетки человека имеют конечное число проходов , в которых фенотип поддерживается ^{21, 22.} К сожалению, это означает, что число клеток, необходимых для исследования болезни или для высева сконструированным помостдля имплантации может быть не достигнута. Таким образом, новые технологии необходимы для расширения клетки пациента, сохраняя при этом эпителиального фенотипа. Условный перепрограммирование нормальных и раковых эпителиальных клеток с использованием фидерные клетки и ингибитор ROCK был описан в 2012 году Лю и др. ^{2 3.} Эта методика была использована для расширения раковыми эпителиальные клетки, полученные из биопсии простаты и рака молочной железы с использованием облученные фидерные клетки, ингибитор ROCK и условно перепрограммирование среды. Цель состояла в том, чтобы генерировать достаточное количество клеток для анализов в пробирке , таких как скрининг наркотиков. Этот метод способен расширяться эпителиальные клетки на неопределенное время "перепрограммирования" этих клеток к стержню или прародитель, как государство, которое является весьма пролиферативного. Было показано , что эти клетки не являются онкогенными и не обладают способностью образовывать тератомы ^{23, 24.} Кроме того, нетхромосомные аномалии или генетических манипуляций присутствовали после пересева этих клеток в культуре с помощью этой техники ^{23, 24.} Самое главное, что эти клетки только способны дифференцироваться в собственный тип клеток, представляющих интерес. Таким образом, эта методика предлагает большой резервуар конкретного пациента эпителиальных клеток для исследования болезни или тканевой инженерии без необходимости в иммортализации.

Получение эпителиальной ткани от конкретного органа с целью изучения процессов болезни часто ограничена и не всегда возможно из-за риска пациента. Для тех пациентов, страдающих от болезни пищевода или дефектов, извлечение эндоскопическая биопсия является минимально инвазивной подход для получения эпителиальной ткани, которая может быть отделено и условно перепрограммировать, чтобы обеспечить неопределенный источник клеток, который является специфическим для слизистой оболочки пищевода, который пациента. Затем это позволяет для исследований в пробиркеэпителиальных клеток для оценки процессов, заболеваний и экран для потенциальных терапевтических средств. Один процесс болезни , которые могли бы извлечь большую пользу от этого подхода является то, эозинофильный эзофагит, которая была описана как аллергическое заболевание пищевода ^8. Тесты аллергии, а также терапевтические подходы могут быть оценены в пробирке , используя собственные эпителиальные клетки пациента , и эти данные затем могут быть переданы на лечащего врача для разработки индивидуальных планов лечения. Методика условного перепрограммирования в сочетании с получением эндоскопических биопсий из педиатрической предлагает возможность расширить нормальные эпителиальные клетки пищевода на неопределенное время из любого пациента. Таким образом, этот источник клеток может быть совместно вместе с натуральным или синтетическим подмостей для обеспечения конкретного пациента хирургической манипуляции на наличие дефектов, болезни или травмы. Имея неограниченное число клеток поможет спроектировать пищеводу конструкции, которые обладают совершенно пересевалилюмена с пищеводной эпителиальными клетками, с тем чтобы помочь облегчить регенерацию остальных типов клеток.

Протокол

Пищеводу биопсии были получены после того, как было получено информированное согласие от родителей / опекунов педиатрических пациентов и в соответствии с этическими комитетами (IRB # 13-094).

1. стерилизуя Приборы и желатиновый раствор

1. Автоклавы щипцы, лезвия бритвы и ножницы перед началом работы ткани, чтобы предотвратить загрязнение.
2. Для того, чтобы 200 мл 0,1% раствора желатина, смешайте 200 мл дистиллированной воды с добавлением 0,2 г желатина. Автоклав и прохладный перед использованием.

2. Нанесение покрытий Пластины тканевой культуры

1. Примерно 2 ч до выделения клеток, добавляют достаточное количество 0,1% желатина, чтобы покрыть блюдо культуры ткани (100 мм) и инкубировать при 37 ° С в инкубаторе для клеточных культур.
   Примечание: Эти пластины могут также быть сделаны заранее и держали в инкубаторе перед использованием.

3. Создание ферментного решение для Разобщения

1. Примерно за 30 минут до выделения клеток, отвесить10 единиц диспаза на балансе на основе единиц концентрации миллиграмм на флаконе. Поместите порошок в 15 мл коническую пробирку с 10 мл Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), и поместите в водяной бане 37 ° C.

4. Создание среды для культивирования клеток

1. Для того, чтобы 50 мл условного перепрограммирования среды, смешивают следующие ингредиенты в стерильную коническую пробирку: 35 мл F12 (Хэма Medium), 11,5 мл DMEM, 0,5 мл L-глутамина, 0,5 мл 100х пенициллина / стрептомицина, 2,5 мл эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 250 мкг человеческого инсулина, 500 нг человеческого эпидермального фактора роста (EGF).
2. Для того, чтобы 500 мл среды 3Т3, смешайте 50 мл ФБС, 5 мл 100x пенициллина / стрептомицина и 5 мл L-глутамина с помощью 500 мл DMEM.
3. Для того, чтобы 500 мл кератиноцитов бессывороточной среде, оттаивать EGF и бычий гипофизарный экстракт (BPE) добавки (при условии со средствами массовой информации). Добавьте добавки в мл бутылку базовой среды 500 и добавить 5 мл 100x пенициллин / стрептомицин

5. Культивирование и облучая 3Т3 в качестве фидера Источник

1. Подготовьте 3Т3 среду, содержащую DMEM, 10% FBS, 1x пенициллина / стрептомицина и 2 мМ L-глутамина.
2. Культура 3T3 клетки в ткани обработанных Т-75 колб , по крайней мере за 3 дня до прибытия образцов пациентов.
   1. Незадолго до прибытия образцов пациентов, Trypsinize 3Т3 с использованием 5 мл 0,25% трипсин-ЭДТА в колбу и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 5 мин или до большинства клеток являются плавающими
3. Добавляют 5 мл 3Т3 среды, чтобы остановить реакцию. Аспирируйте клеточной суспензии и переносят в 15 мл коническую трубку. Спин в течение 5 мин при 300 х г.
4. Аспирируйте среду и клетки вновь суспендируют в определенном объеме трипанового синего для подсчета клеток. Смешайте 10 мкл клеток с 10 мкл трипанового синего, чтобы исключить мертвые клетки. Нагрузка 10 мкл этого раствора на гемоцитометра для подсчета клеток.
   Примечание: Для этого протоCol, плотность посева для облученных 3T3 клеток 10,900 клеток на см ^2, которая равна 600000 клеток на мм пластины 100.
5. Алиготе количество клеток, необходимых для пластины размерами 100 мм пластины каждого образца пациента и ресуспендируют в 25 мл среды 3T3 в 50 мл коническую пробирку и облучать с 3000 рад.
6. После облучения спиновые клетки в течение 5 мин при 300 х г и ресуспендируют в условной перепрограммирования среде при 5 мл на 100 мм пластины.
7. Установите трубку в сторону, пока покрытие из клеток пациента не происходит позже в протоколе (см шаг 7.6).

6. Получение, сохранение и транспортировка педиатрических к пищеводу биопсий

1. Добавьте 5 мл полной кератиноцитов бессывороточной среде с 100 мкг / мл primocin до 15 мл конические пробирки и довести его до медицинского учреждения на льду.
   Примечание: Эти трубки среды можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 2-х месяцев.
2. Получают около 8 пищеводу биопсию на ТИмне эндоскопии и отдельно следующим образом:
   1. Поместите шесть биопсий в 15 мл коническую, содержащей полный кератиноцитов безсывороточную среду 100 мкг / мл primocin и помещают на влажный лед.
   2. Поместите одну биопсию в 5 мл забуференного формалина и помещают на влажный лед.
   3. Положите одну биопсию в небольшой биопсии cryomold с оптимальным соединением температуры резки.
      1. Сразу уронить эту форму в стакан изопентана помещенных в жидкий азот. После того, как замороженный, поместите cryomold в образце мешок и хранить на сухом льду в контейнере из пенополистирола.
3. Поместите пробирки с биопсий в среде или формалином внутри запечатанный пакет, а затем в транспортную коробку, содержащую влажный лед. Печать и пометить коробку с этикеткой и биологической опасности его транспортировки в лабораторию.
   Примечание: Контейнер, содержащий сухой лед и замораживают биопсия также запечатаны и маркированы с этикеткой биологической опасности.

7. ОбработкаТкань пациента вниз по течению культуры и анализа

1. По прибытии в лабораторию, передать замороженные биопсию на сухом льду до -80 ° C морозилку вниз по течению секционирования или экстракции РНК. Поместите образец в формалин. Хранить в 4 ° C холодильнике и позволяют фиксировать в течение ночи.
2. Спин оставшиеся биопсий вниз на 300 мкг, и аспирата среду. Добавьте 10 мл диспаза раствора в конической трубе, уплотнение и позволить ему инкубировать при 37 ° С в водяной бане в течение 15 мин.
3. После инкубации, спина биопсий вниз при 300 х г. Аспирация средних и ресуспендируют биопсий в 5 мл 0,05% трипсин-ЭДТА.
4. Передача 5 мл трипсин-ЭДТА, содержащего биопсий стерильно пластины 100 мм и пропустить через мясорубку биопсии с использованием 2 стерилизованные лезвия бритвы, как хорошо, как это возможно.
5. Переносят 5 мл трипсин-ЭДТА, содержащего фарша биопсий к новой 15 мл коническую. Промыть пластину дважды с дополнительным 5 мл 0,05% трипсин-ЭДТА и добавить к коническойтрубка. Инкубируйте пробирку в течение 10 мин в C водяной бане при 37 °.
6. После инкубации отжимать вниз биопсий при 300 х г (1,4 оборотов в минуту) в течение 5 мин и аспирата среду. Добавьте 5 мл условного перепрограммирования среды в конической трубе, а также 5 мл условного перепрограммирования среды, содержащей фидерные клетки, облученные (этап 5.7).
7. Добавить ингибитор ROCK (1 мкл / мл) в 10 мл суспензии клеток и пластины после того, как аспирационных желатина из тканевой культуры блюдо. Инкубируют при 37 ° С.

8. Культивирование и расширяющихся клетки

1. Примерно через 5 дней культивирования, аспирация исходную среду, содержащую кусочки фарша биопсии и прополоскать блюду 2-3 раза 5 мл стерильной PBS. Добавить новую среду к пластине, включая ингибитор ROCK при 10 мкМ.
2. При достижении 70% слитности, расширить клетки. Добавить 5 мл 0,05% трипсин-ЭДТА к пластине и инкубировать в 37 ° C инкубаторе не более 2,5 мин для удаления тысе фидерные клетки. После этой инкубации, аспирация трипсин-ЭДТА и промыть пластины с 5 мл PBS.
3. Аспирируйте PBS и добавляют 5 мл 0,25% трипсин-ЭДТА к пластине и инкубировать в течение 5-10 мин или пока клетки свободны от пластины. Добавить равное количество среды к пластине, чтобы остановить реакцию, и передача всей текучей среды в 50 мл коническую пробирку и спином вниз со скоростью 300 мкг в течение 5 мин.
4. Ресуспендируют клеток в определенном объеме условного перепрограммирования среды и смешивают 10 мкл суспензии с 10 мкл трипанового синего. Рассчитывать на гемоцитометра, чтобы определить общее количество клеток.
5. Для расширения клетки, добавляют 1 миллион клеток человека к пищеводу до 150 мм пластины в вместе с 1200000 облученный 3Т3 в общем объеме 15 мл. Добавить ингибитор свежий ROCK на 10 мкм и добавить клеточной суспензии в желатин покрытием 150 мм блюдо.

9. замораживания и хранения человеческого пищеводного эпителиальные клетки

1. Для того, чтобы замораживании среду, добавьте 10%ДМСО условной перепрограммирования среде. После того, как trypsinizing и подсчета, Аликвотировать клетки замораживать в новый 50 мл коническую пробирку и спином вниз со скоростью 300 мкг в течение 5 мин.
2. Аспирируйте среды и добавить замораживании среду в объеме 2 мл на криопробирку. После того, как клеточная суспензия однородна, аликвоты 10 ⁶ клеток в предварительно меченных cyrovials. Поместить в контейнер замораживанием при -80 ° С в течение, по крайней мере за 24 ч до перемещения ампул к длительному хранению жидкого азота.

Результаты

Краткое изложение основных шагов в выделении пищевода эпителиальных клеток из биопсий пациентов приводится на рисунке 1. Колонии эпителиальных клеток будет формироваться в примерно 4-5 дней и будут окружены фидерных фибробласты (рис 2А). Поскольку эти колонии расширения они будут сливаться с другими колониями, образуя большие колонии (рис 2В). После того , как культуры стали 70% сливающиеся, они должны быть расширены (рис 2C).

Обсуждение

Наиболее важные шаги для того, чтобы изолировать и расширить пищеводу эпителиальные клетки из биопсий пациентов являются: 1) адекватно отделяя биопсии ткани с минимальной клеточной гибели; 2) обеспечить ингибитор ROCK добавляют в среду для культивирования клеток при каждом изменении среды; 3) Не используйте больше фидерных клеток, чем рекомендуется; 4) поддерживать чистую асептическую культуру; и 5) прохождение клетки только до достижения слияния.

Из-за различий связанных с пациентом в образ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Примоцин	InVivogen	ant-pm2
изопентан	Sigma Aldrich	277258-1L
желатин из свиной кожи	Sigma Aldrich	G1890-100G
	DMEM Thermofisher Scientific	11965092
Cryomold	TissueTek	4565
Cryomatrix OCT	Thermofisher Scientific
15 мл конические пробирки	Denville Scientific	C1017-P
полная кератиноцитарная сыворотка свободная среда	Thermofisher Scientific	10724011
пенициллин стрептомицин	Thermofisher Scientific	15140122
глутамакс	thermofisher Scientific	35050061
раствор инсулина	Sigma Aldrich	I9278-5мл
Эпидермальный фактор роста человека (EGF)	Peprotech	AF-100-15
ROCK Ингибитор (Y-27632)	Fisher Scientific	125410
F-12 Medium	Thermofisher Scientific	11765054
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота	Denville Scientific	FB5001
Dispase	Thermofisher Scientific	17105041
0,05% Трипсин-ЭДТА	Thermofisher Scientific	25300062
0,25% Трипсин-ЭДТА	Thermofisher Scientific	25200072
100 мм Посуда	Denville Scientific	T1110-20
Посуда 150 мм	Denville Scientific	T1115
50 мл коническая	Denville Scientific	С1062-9
Фосфатно-солевые буферные таблетки	Fisher Scientific	BP2944-100
5 мл пипетки	Fisher Scientific	1367811D
10 мл пипетки	Fisher Scientific	1367811E
25 мл пипетки	Fisher Scientific	1367811
9" Пастеровские пипетки	Fisher Scientific	13-678-20D
NIH 3T3 Клетки	ATCC	CRL1658