Методическая статья
Расширение педиатрических пищеводных эпителиальных клеток человека с использованием условного перепрограммирование обеспечивает исследователей с населением конкретного пациента клеток, которые могут быть использованы для проектирования пищеводные конструкции для аутогенной имплантации для лечения дефектов или травм, и служить в качестве резервуара для терапевтических методов скрининга.
Идентификация и расширение специфических для пациента клеток в культуре для использования в тканевой инженерии и исследовании заболеваний может быть очень сложной задачей. Использование различных типов стволовых клеток для получения интересующих типов клеток часто является дорогостоящим, трудоемким и крайне неэффективным. Кроме того, нежелательные типы клеток должны быть удалены перед использованием этого источника клеток, что требует еще одного этапа процесса. Для того, чтобы получить достаточное количество эпителиальных клеток пищевода для создания просвета пищеводной конструкции или для скрининга терапевтических подходов к лечению заболеваний пищевода, нативные эпителиальные клетки пищевода должны быть расширены без изменения их экспрессии генов или фенотипа. Условное перепрограммирование эпителиальной ткани пищевода предлагает многообещающий подход к расширению эпителиальных клеток пищевода, специфичных для пациента. Кроме того, эти клетки не нуждаются в сортировке или очищении и возвращаются в зрелое эпителиальное состояние после удаления их из культуры условного перепрограммирования. Этот метод был описан во многих исследованиях скрининга рака и позволяет бесконечно расширять эти клетки по нескольким проходам. Возможность проведения скрининговых анализов пищевода поможет революционизировать лечение детских заболеваний пищевода, таких как эозинофильный эзофагит, путем выявления триггерного механизма, вызывающего симптомы у пациента. Для тех пациентов, которые страдают от врожденного дефекта, заболевания или травмы пищевода, этот источник клеток может быть использован в качестве средства для создания синтетической конструкции для имплантации с целью восстановления или замены пораженной области.
инженерия пищеводного ткани и эозинофильный эзофагит (EoE) были в центре внимания исследований во многих лабораториях за последнее десятилетие. Врожденные дефекты, такие как атрезия пищевода, наблюдаются примерно в 1 в 4000 родившихся живыми, что приводит к неполному развитию пищевода , приводящей к невозможности съесть 1. Заболеваемость и распространенность Eoe были на подъеме с тех пор определение сущности болезни в 1993 году заболеваемость Eoe колебалась от 0,7 до 10/100000 на человеко-год , а распространенность колебалась от 0,2 до 43 / 100,000 2. Новый привлекательный хирургический подход к лечению длительного пере....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Пищеводу биопсии были получены после того, как было получено информированное согласие от родителей / опекунов педиатрических пациентов и в соответствии с этическими комитетами (IRB # 13-094).
1. стерилизуя Приборы и желатиновый раствор
2. Нанесение покрытий Пластины тканевой культуры
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Краткое изложение основных шагов в выделении пищевода эпителиальных клеток из биопсий пациентов приводится на рисунке 1. Колонии эпителиальных клеток будет формироваться в примерно 4-5 дней и будут окружены фидерных фибробласты (рис 2А). Поскольку эти колонии расширения они будут сливаться с другими колониями, образуя большие колонии (рис 2В). После того , как культуры стали 70% сливающиеся, они должны быть расширены (рис 2C).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Наиболее важные шаги для того, чтобы изолировать и расширить пищеводу эпителиальные клетки из биопсий пациентов являются: 1) адекватно отделяя биопсии ткани с минимальной клеточной гибели; 2) обеспечить ингибитор ROCK добавляют в среду для культивирования клеток при каждом изменении среды; 3) Не используйте больше фидерных клеток, чем рекомендуется; 4) поддерживать чистую асептическую культуру; и 5) прохождение клетки только до достижения слияния.
Из-за различий связанных с пациентом в образ.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Мы хотели бы выразить признательность Фонду стратегических исследований Детского медицинского центра Коннектикута за поддержку этой работы.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Примоцин | InVivogen | ant-pm2 | |
| изопентан | Sigma Aldrich | 277258-1L | |
| желатин из свиной кожи | Sigma Aldrich | G1890-100G | |
| DMEM Thermofisher Scientific | 11965092 | ||
| Cryomold | TissueTek | 4565 | |
| Cryomatrix OCT | Thermofisher Scientific | ||
| 15 мл конические пробирки | Denville Scientific | C1017-P | |
| полная кератиноцитарная сыворотка свободная среда | Thermofisher Scientific | 10724011 | |
| пенициллин стрептомицин | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| глутамакс | thermofisher Scientific | 35050061 | |
| раствор инсулина | Sigma Aldrich | I9278-5мл | |
| Эпидермальный фактор роста человека (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| ROCK Ингибитор (Y-27632) | Fisher Scientific | 125410 | |
| F-12 Medium | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота | Denville Scientific | FB5001 | |
| Dispase | Thermofisher Scientific | 17105041 | |
| 0,05% Трипсин-ЭДТА | Thermofisher Scientific | 25300062 | |
| 0,25% Трипсин-ЭДТА | Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| 100 мм Посуда | Denville Scientific | T1110-20 | |
| Посуда 150 мм | Denville Scientific | T1115 | |
| 50 мл коническая | Denville Scientific | С1062-9 | |
| Фосфатно-солевые буферные таблетки | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| 5 мл пипетки | Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 мл пипетки | Fisher Scientific | 1367811E | |
| 25 мл пипетки | Fisher Scientific | 1367811 | |
| 9" Пастеровские пипетки | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| NIH 3T3 Клетки | ATCC | CRL1658 |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение