Здесь образец четырехглавой мышцы берется у свиньи, находящейся под наркозом, и митохондрии изолируются дифференциальным центрифугированием. Затем с помощью респирометрии высокого разрешения определяют частоту дыхания комплексов митохондриальных дыхательных цепей I, II и IV.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение неповрежденном Митохондрии из скелетных мышц с помощью дифференциального центрифугирования для измерения респирометрии высокого разрешения
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Митохондрии участвуют в клеточном энергетическом метаболизме и используют кислород для производства энергии в форме аденозинтрифосфата (АТФ). Дифференциальное центрифугирование на низких и высоких скоростях обычно используется для выделения митохондрий из тканей и культивируемых клеток. Сырые митохондриальные фракции, полученные методом дифференциального центрифугирования, используются для респирометрических измерений. Метод дифференциального центрифугирования основан на разделении органелл в соответствии с их размером и скоростью осаждения. Выделение митохондрий проводится сразу после забора тканей. Ткань погружают в ледяную гомогенизирующую среду, измельчают ножницами и гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе с помощью неплотно прилегающего пестика. Метод дифференциального центрифугирования является эффективным, быстрым и недорогим, а митохондрии, полученные при дифференциальном центрифугировании, достаточно чисты для проведения респирометрических анализов. Некоторые ограничения и недостатки изолированных митохондрий, основанных на дифференциальном центрифугировании, заключаются в том, что митохондрии могут быть повреждены во время процедуры гомогенизации и выделения, а также в том, что для выделения митохондрий требуется большое количество биопсии ткани или культивируемых клеток.
Введение
Митохондриальные биоэнергетика и дыхательные способности могут быть изучены не только в проницаемыми клеток или волокон, но и в изолированных митохондриях. В настоящем исследовании мы опишем протокол, чтобы изолировать неповрежденных скелетных мышц митохондрии с помощью дифференциального центрифугирования для измерения респирометрии с высокой разрешающей способностью.
Чтобы изолировать интактные митохондрии для респирометрии, ткань гомогенизируют и митохондрии изолированы с помощью обычного метода дифференциального центрифугирования. Метод дифференциального центрифугирования основан на последовательном центрифугировани (в серии увеличения....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Четырехглавой мышцы биопсия взята из анестезированной свиньи, из которой митохондрии выделяют дифференциального центрифугирования. Свинья используется впоследствии для другого эксперимента. Исследование проводится в соответствии с национальными институтами здоровья руководящих принципов по уходу и использованию экспериментальных животных и с одобрения Animal Care комитета кантона Берн, Швейцария.
1. скелетных мышц Гомогенизация и Митохондриальная Изоляция
- Акцизный 5-10 г четырехглавой мышцы образец из анестезированной в свинью. В данном анализе используют свиную скелетных мышц. Этот протокол также может быть использован....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Комплекс I-зависимого дыхания
Изолированные митохондриальные сложные частота дыхания I-зависимых состояний (2, 3 и 4) определяются с использованием высокого разрешения респирометрии (рисунок 1, представитель диаграмма). Митохондриальные сложные субстраты I, глутамат и малат, добавляются с последующим добавлением АДФ. Состояние 2 относится к потреблению кислорода в присутствии одних субстратов........
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В настоящем исследовании мы опишем протокол для изоляции высокого качества, нетронутыми и тесно связанных скелетных мышц митохондрии с помощью дифференциального центрифугирования, которые могут быть использованы для функциональных исследований, таких как высокого разрешения респирометрии.
Для того, чтобы изолировать неповрежденных и плотно соединенных митохондрии, есть некоторые критические точки, которые необходимо учитывать в рамках настоящего протокола. После сбора скелетной ткани, она до.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Это исследование было поддержано Швейцарским национальным научным фондом (грант 32003B_127619).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma | A 4386 | Химический |
| антимицин A | Sigma | A 8674 | Химический, растворяемый в этаноле |
| Аскорбат | Merck | 1.00127 | Химический |
| АТФ | Sigma | A 7699 | Химический |
| BSA | Sigma | A 6003 | Химический |
| EGTA | fluka | 3779 | Химический |
| Глутамат | Sigma,G | 1626 | Химический |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Химический |
| KCl | Merck | 1.04936 | Химический |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Химический |
| K-лактобионат | Sigma | L 2398 | Химический |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Химический |
| морфолинопропансульфоновая кислота (MOPS) | Merck | 1.06129 | Химический |
| O2k-ядро: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | Прибор для респирометрии высокого разрешения |
| Протеиназа, бактериальная | Sigma | P 8038 | Химический |
| азид натрия | Sigma | S2002 | Химический |
| ротенон | Sigma | R 8875 | Химический, растворенный в этаноле |
| Сукцинат | Sigma | S 2378 | Химический |
| Schuett гомоген-плюс полуавтоматический гомогенизатор | schuett-biotec GmbH | 3.201 011 | Гомогенизатор тканей Таурин |
| Sigma | T 8691 | Химический | |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Химический |
Ссылки
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).
- Sims, N. R.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
