Представлена стратегия генерации мутаций в генах гистонов в их эндогенном расположении у Saccharomyces cerevisiae.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мы описываем систему, основанную на ПЦР и гомологичной рекомбинации, для генерации целевых мутаций в генах гистонов в почковающихся дрожжевых клетках. Полученные мутантные аллели находятся в своих эндогенных геномных сайтах, и после процедуры в геноме не остается экзогенных последовательностей ДНК. Поскольку в гаплоидных дрожжевых клетках каждый из четырех основных белков гистонов кодируется двумя неаллельными генами с высокогомологично открытыми рамками считывания (ORF), нацеливание мутагенеза конкретно на один из двух генов, кодирующих конкретный белок гистонов, может быть проблематичным. Стратегия, которую мы описываем здесь, обходит эту проблему, используя последовательности снаружи, а не внутри ORF генов-мишеней для этапа гомологичной рекомбинации. Еще одна особенность этой системы заключается в том, что участки ДНК, управляющие гомологичными этапами рекомбинации, могут быть очень обширными, что увеличивает вероятность успешных интеграционных событий. Эти особенности делают эту стратегию особенно подходящей для мутагенеза гена гистонов, но также может быть адаптирована для мутагенеза других генов в геноме дрожжей.
Введение
Четыре основных белков гистонов H2A, H2B, H3, H4 и играют центральную роль в уплотнению, организации и функции эукариотических хромосом. Два комплекта каждого из этих гистонов образуют гистонов октамером, молекулярный катушку , которая направляет оборачивание ~ 147 пар оснований ДНК вокруг себя, в конечном счете , приводит к образованию нуклеосом 1. Нуклеосомы являются активными участниками различных процессов хромосом на основе, например, регуляции транскрипции генов и формирования эухроматином и гетерохроматина через хромосом, и как таковые были в центре внимания интенсивных исследований в течение последних нескольких десятилетий. Ряд механи....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: Экспериментальная стратегия направлена на месте гена гистона мутагенеза включает в себя несколько этапов (показаны на рисунке 1). Эти шаги включают в себя: (1) замена гена мишени гистона с геном URA3, (2) Производство и очистка продуктов ПЦР , соответствующих двум частично перекрывающихся фрагментов гена гистона - мишени с использованием праймеров , несущих желаемую мутацию (и), (3 ) Fusion ПЦР из двух частично перекрывающихся фрагментов, чтобы получить полный размер PCR продуктов для интеграции, (4) совместное преобразование полного размера продуктов ПЦР и магистральную плазмидой, и выделение для маркера на плазмиде, (5....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Описана генерация hht2 аллеля , выражающей мутантный белок гистона H3 укрывают замещение в положении 53 из аргинином к глутаминовой кислоты (Н3-R53E мутант) в качестве типичного примера целевой стратегии Situ мутагенеза.
Мы создали штамм , в котором вся ORF из HHT2 заменен геном URA3 (см шаг 1 протокола). Этот штамм, yAAD156, также таит в себе аллель his3Δ200, который заставляет кле.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Высокий уровень гомологии последовательностей между двумя неаллельных генов , которые кодируют для каждого из четырех основных белков гистонов в клетках гаплоидных S.cerevisiae , может представлять собой проблему для исследователей , которые хотят конкретно адресовано одному из двух генов для мутагенеза. Ранее описанные методики дрожжевые мутагенеза, в том числе Delitto Perfetto, сайт-специфической геномной (SSG) мутагенеза и клонированию свободных методов замены аллеля на основе ПЦР .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Мы благодарим Рейне Протасио за полезные комментарии во время подготовки этой рукописи. Выражаем благодарность Национальному научному фонду (гранты No 1243680 и 1613754) и программе «Одиссея колледжа Хендрикса» за финансовую поддержку.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1 kb Лестница ДНК (стандарты ДНК) | New England BioLabs | N3232L | |
| Agarose | Sigma | A5093-100G | |
| Борная кислота | Sigma | B0394-500G | |
| смесь dNTP (10 мМ каждая) | ThermoFisher Scientific | R0192 | |
| ЭДТА раствор (0,5 М, pH 8,0) | AmericanBio | AB00502-01000 | |
| Этанол (200 пруф) | Fisher Scientific | 16-100-824 | |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота дигидрат динатриевой соли (ЭДТА)) | Sigma | E4884-500G | |
| Дигидрат ацетата лития | Sigma | L6883-250G | |
| MyCycler Thermal Cycler | BioRad | 170-9703 | |
| Поли(этиленгликоль) (ПЭГ) | Sigma | P3640-1KG | |
| PrimeSTAR HS ДНК-ПОЛИМЕРАЗА (высокоточная ДНК-полимераза) и 5-кратный буфер | Fisher Scientific | 50-443-960 | |
| Раствор ДНК спермы лосося | ThermoFisher Scientific | 15632-011 | |
| Sigma 7-9 (трис-основание, порошковая форма) | Sigma | T1378-1KG | |
| Тригидрат ацетата натрия | Sigma | 236500-500G | |
| Supra Sieve GPG Agarose (низкая температура агарозы) | AmericanBio | AB00985-00100 | |
| Taq Polymerase и 10x Buffer | New England BioLabs | M0273X | |
| Зубочистки | Fisher Scientific | S67859 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | AmericanBio | AB14043-01000 | |
| A-D(+)-глюкоза | Fisher Scientific | AC170080025 | для дрожжевых сред |
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | для дрожжевых сред |
| Peptone | Fisher Scientific | DF0118-07-2 | для среды YPD Экстракт |
| дрожжей | Fisher Scientific | DF0127-17-9 | для среды YPD |
| 4-аминобензойная кислота | Sigma | A9878-100G | для полного минимального выпадения среды |
| Аденин | Sigma | A8626-100G | для полного минимального выпадения среды |
| Глицина гидрохлорид | Sigma | G2879-100G | для полного минимального выпадения среды |
| L-аланин | Sigma | A7627-100G | для полного минимального выпадения среды |
| L-аргинин моногидрохлорид | Sigma | A5131-100G | для полной минимальной выпадения среды |
| L-аспарагина моногидрат | Sigma | A8381-100G | для полного минимального выпадения среды |
| L-аспарагиновая кислота моногидрат натриевой соли | Sigma | A6683-100G | для полного минимального выпадения среды |
| L-цистеина гидрохлорида моногидрат | Sigma | C7880-100G | для полной минимальной выпадения среды |
| L-глутаминовая кислота гидрохлорид | Sigma | G2128-100G | для полной минимальной выпадения среды |
| L-глютамин | Sigma | G3126-100G | для полного минимального выпадения среды |
| L-гистидина моногидрохлорида моногидрат | Sigma | H8125-100G | для полного минимального выпадения среды |
| L-изолейцин | Sigma | I2752-100G | для полного минимального выпадения среды |
| L-лейцин | Sigma | L8000-100G | для полного минимального отсева среды |
| L-лизина моногидрохлорид | Sigma | L5626-100G | для полного минимального выпадения среды |
| L-метионин | Sigma | M9625-100G | для полного минимального выпадения среды |
| L-фенилаланин | Sigma | P2126-100G | для полного минимального выпадения среды |
| L-Proline | Sigma | P0380-100G | для полного минимального выпадения среды |
| L-Serine | Sigma | S4500-100G | для полного минимального выпадения среды |
| L-треонин | Sigma | T8625-100G | для полного минимального выпадения среды |
| L-триптофан | Sigma | T0254-100G | для полного минимального выпадения среды |
| L-тирозин | Sigma | T3754-100G | для полного минимального выпадения среды |
| L-Valine | Sigma | V0500-100G | для полного минимального выпадения среды |
| myo-Inositol | Sigma | I5125-100G | для полного минимального выпадения среды |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | для полного минимального выпадения среды |
| Сульфат аммония | Fisher Scientific | A702-500 | для полного минимального выпадения среды |
| Дрожжевое азотное основание | Fisher Scientific | DF0919-07-3 | для полного минимального отсева среды |
| 5-Фтороротовая кислота (5-FOA) | AmericanBio | AB04067-00005 | для Среда 5-FOA |
Ссылки
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
- Rand....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
