Здесь мы опишем протокол 4 этапа к дифференцировке эмбриональных стволовых клеток человека к NKX6-1 + панкреатических клеток - предшественников в пробирке. Этот протокол может быть применен к различным плюрипотентных стволовых клеточных линий человека.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Эффективное Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток к NKX6-1
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Плюрипотентные стволовые клетки обладают способностью самостоятельно возобновлять и дифференцироваться в нескольких родословных, что делает их привлекательным источником для генерации панкреатических клеток-предшественников, которые могут быть использованы для изучения и дальнейшего лечения сахарного диабета. В данной статье рассматривается протокол дифференциации четыре этапа, предназначенный для создания панкреатических клеток-предшественников из человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). Этот протокол может быть применен к ряду человеческого плюрипотентных стволовых клеток (HPSC) линий. Подход, используемый для создания панкреатических клеток-предшественников, чтобы дифференцировать ЭСК точно моделировать основные этапы развития поджелудочной железы. Это начинается с индукцией окончательного эндодермы, что достигается посредством культивирования клеток в присутствии активин A, базовый фактор роста фибробластов (bFGF) и CHIR990210. Дальнейшая дифференциация и структурирование с фактор роста фибробластов 10 (Fgf10) и Dorsomorphin формирует клетки, напоминающие задней кишки. Добавление Сетчаткаовая кислота, башка, САНТ-1 и FGF10 различает клетки задней передней кишки в клетки поджелудочной железы, характерных энтодермы. И, наконец, сочетание эпидермального фактора роста (EGF), никотинамид и Noggin приводит к эффективной генерации Pdx1 + / NKX6-1 + клеток. Проточная цитометрия проводится для подтверждения экспрессии специфических маркеров на ключевых этапах развития поджелудочной железы. В Pdx1 + / NKX6-1 + панкреатические клетки - предшественники в конце 4 -й стадии, способные генерировать зрелые бета - клеток при трансплантации в иммунодефицитных мышей и может быть дополнительно дифференцированы , чтобы генерировать инсулин-продуцирующие клетки в пробирке. Таким образом, эффективная генерация Pdx1 + / NKX6-1 + панкреатические клетки - предшественники, как показано в этом протоколе, имеет большое значение , поскольку она обеспечивает платформу для изучения развития поджелудочной железы человека в пробирке и обеспечивает источник клеток с потенциалом дифференциации в -клетки, которые могли бы Э.В.entually использоваться для лечения сахарного диабета.
Введение
Распространенность сахарного диабета возрастает , и в соответствии с Канадской ассоциации диабета, по оценкам, более 11 миллионов человек , в Канаде являются диабетическая или prediabetic, 5-10% этих лиц , имеющих сахарный диабет 1 типа (СД1) 1. СД1 является аутоиммунным заболеванием, которое вызывается разрушением продуцирующих инсулин бета-клеток, которые расположены в островках Лангерганса. В настоящее время, люди , живущие с СД1 требуют экзогенных источников инсулина 2. Несмотря на успехи в инсулинотерапии, у пациентов СД1 продолжают иметь трудное время регулируя уровень глюкозы в крови и продолжают страдать как гипо- и гипергликемии. Перспективной формой лечения для восстановления нормогликемии в СД1 является использование человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), которые могут быть использованы для создания неограниченный запас инсулина производства бета - клеток , как в естественных условиях и в пробирке 3, 4, 5, 6, 7. Дифференциация ЭСК к бета-подобные клетки могли бы сделать возможным изучение диабета в пробирке, что позволяет для идентификации новых терапевтических мишеней для лечения диабета 2 типа и обеспечивают клетки для трансплантации пациентам СД1.
Самая успешная попытка генерации продуцирующих инсулин клеток из ЭСК в пробирке является резюмировать эмбриональных события , которые происходят во время развития поджелудочной железы 4, 5. Это включает в себя манипуляции различных сигнальных путей, чтобы точно моделировать основные этапы развивающейся поджелудочной железе. Поджелудочной развития начинается с индукцией окончательного энтодермы, которая характеризуется выражением CXCR4 и CD117 (c-KIT) 8, 9. Точное регулирование definitАйв организация энтодермы необходим для формирования кишечной трубки, который затем подвергается передне-к-задней и вентральной-дорсального кучность стрельбы. Спинной и брюшные панкреатические почки выходят из области задней кишки, выражающего поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки гомеобоксный ген (Pdx1), который необходим для развития поджелудочной железы 10. Спинной и брюшные почки предохранителей , чтобы сформировать поджелудочную железу, которая затем подвергается интенсивному эпителиальной ремоделирования и расширение 11. Стремление к эндокринную и экзокринной линии сопровождается поколением мультипотентных клеток - предшественников (ПДК) , которые выражают, среди прочего, транскрипционные факторы Pdx1, Nkx6.1 и Ptf1a 12, 13. ПДКп , которые станут эндокринные и протоковой клетки продолжают выражать Nkx6-1 при одновременном снижении экспрессии Ptf1a. В противоположность этому, клетки линии преемственности экзокринных потеряет expressioп Nkx6-1 и поддерживать Ptf1a выражение 12.
Фактор транскрипции Nkx6-1 играет ключевую роль в развитии рака поджелудочной, в частности , во время дифференцировки эндокринных клеток - предшественников к бета - клеток. Как было описано выше, удаление результатов Nkx6-1 в нарушенного формирования бета - клеток поджелудочной железы в процессе развития 14. Поэтому, создавая производящие инсулин бета - клеток в пробирке и в естественных условиях требует эффективной индукции Nkx6-1.
Недавно мы разработали протокол , чтобы эффективно генерировать Pdx1 + / NKX6-1 + панкреатических клеток - предшественников из hPSCs. Эти HPSC полученные из панкреатических прародителей образованием зрелых бета - клеток при трансплантации в иммунодефицитных мышей 3. Протокол дифференциации можно разделить на 4 этапа характеристику: 1) окончательной индукции энтодермы, 2) задняя передняя кишка структурирование, 3) поджелудочная спецификации и 4) NKX6-1 индукции. Здесь мы приводим подробное описание каждого шага направленной дифференцировки.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Приготовление растворов и средств массовой информации
Примечание: Подготовьте все средства массовой информации для культивирования клеток в стерильной среде. СМИ должны быть сделаны и использованы немедленно. Детали Реагент представлены в таблице материалов.
- Дифференциация СМИ
- Приготовьте день 0 Дифференциация Носитель: RPMI среде с 1% глутамина, 2 мкМ CHIR 99021, 100 нг / мл активин А, 10 4 M MTG.
- Подготовка День 1-2: дифференцировки RPMI среде с 1% глутамина, 100 нг / мл активин A, 10 4 M MTG, 5 нг / мл bFGF, 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты.
- Подготовка День 3-5: дифференцировки RPMI среде с 1% глутамина, 1% B27, 10 4 M MTG, 0,75 мкМ Dorsomorphin, 50 нг / мл FGF10.
- Подготовьте 6-7 сут дифференцировки: DMEM с 1% глутамина, 1% B27, 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты, 50 нг / мл FGF10, 0,25 мкМ SANT-1, 2 мкМ ретиноевой кислоты, 50 нг / мл Noggin.
Примечание: ретиноевойКислота должна быть добавлена в средствах массовой информации в последний раз, и средства массовой информации должны быть защищены от света для предотвращения окислительной деструкции 15. - Готовят день 8-12 дифференцировки: DMEM с 1% глутамина, 1% B27, 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты, 50 нг / мл Noggin, 100 нг / мл hEGF, 10 мМ никотинамид.
- Подготовка FACS буфера: 10% FBS в PBS, минус кальция и магния.
2. дифференцировке ЭСК
Примечание: HESC оттаивают, пассированные и расширена на облученный мышиных эмбриональных фибробластов в присутствии KOSR сред на основе дополненной bFGF 16. ЭСК готовы к дифференциации, когда клетки достигают 80-95% слитности. В это время колонии должны быть большими с определенными границами и 'купольного' структуры (Рис . 1А) Вся культура клеток выполняется в плоскодонных, культуры тканей обрабатывали планшеты, покрытые 0,1% желатином. Как правило, клетки выращивают в 6 или12-луночные планшеты, в объемах средств по 2 мл или 1 мл.
- В день 0 начинают дифференцировку путем замены KOSR на основе средств массовой информации с дня 0 Дифференциация Media.
- В дни 1 и 2, осторожно встряхните пластину, чтобы удалить мертвые клетки из монослоя до того аспирационных. Заменить на день 1-2 Дифференциация Media.
- На 3-й день, урожай клеток для проточной цитометрии. Если клетки экспрессируют более чем на 90% CXCR4 + / CD117 +, перейдите к шагу 2.4.
- В те дни, 3 и 5, осторожно встряхните пластину, чтобы удалить мертвые клетки из монослоя до аспирационных. Заменить День 3-5 Дифференциация Media.
- В дни 6 и 7, заменить День 6-7 Дифференциация СМИ.
- В дни 8, 10 и 12, заменить День 8-12 Дифференциация СМИ.
- На 13-й день, урожай клеток для проточной цитометрии для определения Pdx1 и NKX6-1 выражение.
3. Сбор клеток для анализа потока цитометрии
- Диссоциируют клетки с1x раствор коммерческий трипсин в соответствии с протоколом производителя и инкубировать при 37 ° С в течение 3 мин.
- Удалить коммерческое решение трипсина и ресуспендируют отдельных клеток в 1000 мкл FACS буфера с 30 мкл ДНКазы I.
- Фильтрующие элементы с использованием 35 мкм нейлоновый сетчатый фильтр клеток и перенос в микроцентрифужных трубки.
- Центрифуга клетки при 455 мкг в течение 5 мин. Подготовка клетки для живого или любой фиксированной окраски.
4. Окрашивание для проточной цитометрии
- Расход препарата для живого окрашивания на 3 -й день
- Ресуспендируют клеток в 1000 мкл FACS буфера. Передача 200 мкл (приблизительно 1-3 × 10 5 клеток) на две лунки 96-луночного планшета (для обоих неокрашенных и окрашенных образцов).
- Центрифуга пластину на 931. х г в течение 2 мин. Удалить супернатант опрокидыванием планшета.
- Пятно с первичными конъюгированные с антителами, CXCR4: APC и CD117: PE (см M aterials таблицу) для 30 мин при комнатной температуре в защищенном от света.
- Центрифуга пластину на 931. х г в течение 2 мин. Удалить супернатант опрокидыванием планшета.
- Образцы Ресуспендируют в 100 мкл FACS буфера.
- Центрифуга пластину на 931. х г в течение 2 мин. Удалить супернатант опрокидыванием планшета.
- Ресуспендируют каждого образца и перенос в общем объеме 300-500 мкл FACS буфера для 1 мл микропробирок или 5 мл с круглым дном пробирки.
- Выполнить образцов на проточном цитометре 17. Если образцы не могут быть запущены сразу же, хранят при температуре 4 ° С в защищенном от света.
- Расход препарата для фиксированного окрашивания на 13 -й день
- Ресуспендируют осадок клеток в коммерческом растворе фиксации / пермеабилизации в течение 24 ч при температуре 4 ° С.
- Центрифуга образца при 455 х г в течение 5 мин. Ресуспендируют в 400 мкл раствора Пермь / промывочного.
- Передача 200 мкл образца (приблизительно 0,5-1 × 10 6 клеток) к ТВтO лунки 96-луночного планшета (для IgG контроля и Pdx1 / NKX6-1 окрашивания). Центрифуга при 931 мкг в течение 2 мин.
- Ресуспендируют гранул клеток в 100 мкл раствора Пермь / промывочного содержащего анти-Pdx1 и анти-NKX6-1 антитела первичного или изотипа контроля (см Материалы таблицу). Инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С.
- Центрифуга пластину на 931. х г в течение 2 мин. Удалить супернатант опрокидыванием планшета. Образцы Ресуспендируют в 100 мкл раствора Пермь / промывочного.
- Центрифуга пластину на 931. х г в течение 2 мин. Удалить супернатант опрокидыванием планшета.
- Ресуспендируют образцы в 100 мкл / Пермь Wash, содержащие вторичные антитела, при комнатной температуре в течение 1 ч, защищенном от света месте.
- Центрифуга пластину на 931. х г в течение 2 мин. Удалить супернатант опрокидыванием планшета.
- Образцы Ресуспендируют в 100 мкл Пермского / промывочного раствора.
- Центрифуга пластину на 931. х г в течение 2 мин. Удалить супернатант опрокидыванием планшета.
- репседят шаг 4.2.9 и 4.2.10.
- Ресуспендируют каждого образца и перенос в общем объеме 300-500 мкл FACS буфера для 1 мл микропробирок или 5 мл с круглым дном пробирки.
- Выполнить образцов на проточном цитометре 17. Если образцы не могут быть запущены сразу же, хранят при температуре 4 ° С в защищенном от света.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Эффективная генерация панкреатических клеток - предшественников опирается на правильный рост и поддержание недифференцированных клеток с последующим точным добавлением специфических сигнальных молекул во время протокола дифференцировки, как показано на схеме на рисунке 1А. В день 0, недифференцированные клетки должны быть на 80-95% сплошности и колонии должны иметь определенные края (Фигура 1А). Во время стадии 1, СМИ, скорее всего, появится облачно, так...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Успешно генерации NKX6-1 + панкреатических клеток - предшественников из hPSCs в пробирке основана на использовании высоких культур качества hPSCs и направленной дифференцировки , включающих точное регулирование конкретных сигнальных путей , которые регулируют основные этапы развития в процессе развития поджелудочной железы. Хотя этот протокол может быть использован , чтобы вызвать устойчивую экспрессию NKX6-1 через множество HPSC линий , как показано ранее 3, для обеспечения э...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Эта рукопись была поддержана финансирование из Торонто общего и Западного Фонда и Высшей премии Бантинг и Лучший Диабет Центр-университет сеть здравоохранения.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильная>среда и цитокины | |||
| 1-тиоглицерин (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R& D | 338-AC/CF | |
| Аскорбиновая кислота | Sigma | A4544 | |
| B-27 Дополнение | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R& D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco' s Модифицированная среда Eagle (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| ДНКаза I | VWR | 80510-412 | |
| Дорсоморфин | Sigma | P5499 | |
| ЭФР | R& D | 236-EG | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R& D | 345-FG | |
| Желатин из свиной кожи | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Никотинамид | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R& D | 3344-NG | |
| Пенициллин/стрептомицин | Life Technologies | 15070-063 | |
| Ретиноевая кислота | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), фенол красный | Life Technologies | 12605-010 | |
| Name< | strong>Company | >Номер в каталоге | >Комментарии |
| Антитела для проточной цитометрии (рабочие разведения) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), конъюгат Alexa Fluor 647 (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Джексон Иммуноисследовательские лаборатории Инк. | 705-546-147 | |
| Мышь с контролем изотипа IgG | Джексон Иммуноисследовательские лаборатории Инк. | 015-000-003 | |
| Контроль изотипа коз IgG | R& D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2,000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R& Д | АФ2419 |
Ссылки
- Canadian Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes (2016).
- Cogger, K., Nostro, M. C. Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes. Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2014).
- Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Gouon-Evans, V., et al. BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm. Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Pan, F. C., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).
- Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors. Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).
- Zhou, Q., et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis. Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
- Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. Retinoic acid stability in stem cell cultures. Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).
- Korytnikov, R., Nostro, M. C. Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells. Methods. , 56-64 (2016).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
- Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7 (5), e37004(2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
