Эффективное Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток к NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; панкреатических Предшественники

Emily C. McGaugh; M. Cristina Nostro

doi:10.3791/55265

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Эффективное Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток к NKX6-1

7.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55265

⸱

7 марта 2017 г.

Emily C. McGaugh¹^,²^,³ , M. Cristina Nostro¹^,²^,³

¹Toronto General Research Institute, University Health Network, ²McEwen Centre for Regenerative Medicine, University Health Network, ³Department of Physiology, University of Toronto

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы опишем протокол 4 этапа к дифференцировке эмбриональных стволовых клеток человека к NKX6-1 ⁺ панкреатических клеток - предшественников в пробирке. Этот протокол может быть применен к различным плюрипотентных стволовых клеточных линий человека.

Аннотация

Плюрипотентные стволовые клетки обладают способностью самостоятельно возобновлять и дифференцироваться в нескольких родословных, что делает их привлекательным источником для генерации панкреатических клеток-предшественников, которые могут быть использованы для изучения и дальнейшего лечения сахарного диабета. В данной статье рассматривается протокол дифференциации четыре этапа, предназначенный для создания панкреатических клеток-предшественников из человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). Этот протокол может быть применен к ряду человеческого плюрипотентных стволовых клеток (HPSC) линий. Подход, используемый для создания панкреатических клеток-предшественников, чтобы дифференцировать ЭСК точно моделировать основные этапы развития поджелудочной железы. Это начинается с индукцией окончательного эндодермы, что достигается посредством культивирования клеток в присутствии активин A, базовый фактор роста фибробластов (bFGF) и CHIR990210. Дальнейшая дифференциация и структурирование с фактор роста фибробластов 10 (Fgf10) и Dorsomorphin формирует клетки, напоминающие задней кишки. Добавление Сетчаткаовая кислота, башка, САНТ-1 и FGF10 различает клетки задней передней кишки в клетки поджелудочной железы, характерных энтодермы. И, наконец, сочетание эпидермального фактора роста (EGF), никотинамид и Noggin приводит к эффективной генерации Pdx1 ⁺ / NKX6-1 ⁺ клеток. Проточная цитометрия проводится для подтверждения экспрессии специфических маркеров на ключевых этапах развития поджелудочной железы. В Pdx1 ⁺ / NKX6-1 ⁺ панкреатические клетки - предшественники в конце 4 -й стадии, способные генерировать зрелые бета - клеток при трансплантации в иммунодефицитных мышей и может быть дополнительно дифференцированы , чтобы генерировать инсулин-продуцирующие клетки в пробирке. Таким образом, эффективная генерация Pdx1 ⁺ / NKX6-1 ⁺ панкреатические клетки - предшественники, как показано в этом протоколе, имеет большое значение , поскольку она обеспечивает платформу для изучения развития поджелудочной железы человека в пробирке и обеспечивает источник клеток с потенциалом дифференциации в -клетки, которые могли бы Э.В.entually использоваться для лечения сахарного диабета.

Введение

Распространенность сахарного диабета возрастает , и в соответствии с Канадской ассоциации диабета, по оценкам, более 11 миллионов человек , в Канаде являются диабетическая или prediabetic, 5-10% этих лиц , имеющих сахарный диабет 1 типа (СД1) ^1. СД1 является аутоиммунным заболеванием, которое вызывается разрушением продуцирующих инсулин бета-клеток, которые расположены в островках Лангерганса. В настоящее время, люди , живущие с СД1 требуют экзогенных источников инсулина ^2. Несмотря на успехи в инсулинотерапии, у пациентов СД1 продолжают иметь трудное время регулируя уровень глюкозы в крови и продолжают страдать как гип....