Методическая статья

Внутриклеточные Окрашивание и проточной цитометрии для идентификации субпопуляций лимфоцитов в пределах мышиной аорте, почек и лимфатических узлов в модели артериальной гипертензии

DOI:

10.3791/55266

⸱

28 января 2017 г.

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 3Department of Pharmacology and Toxicology, Faculty of Pharmacy, Mansoura University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье приводится подробная методика для идентификации и количественного определения функциональных подмножеств Т-лимфоцитов, присутствующих в мышиной почек, аорты и лимфатических узлов с помощью внутриклеточного окрашивания и проточной цитометрии. была выбрана модель ангиотензина II, индуцированной гипертонии объяснить, шаг за шагом, процедуры и основополагающие принципы проточной цитометрии и внутриклеточного окрашивания.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящее время хорошо известно, что Т-лимфоциты играют решающую роль в развитии нескольких сердечно-сосудистых заболеваний1,2,3,4,5. Например, исследования нашей группы показали, что гипертония связана с чрезмерным накоплением Т-клеток в сосудах и почках при развитии экспериментальной гипертензии6. Попадая в эти ткани, Т-клетки вырабатывают несколько цитокинов, которые влияют как на сосудистую, так и на почечную функцию, что приводит к сужению сосудов и задержке натрия и воды1,2. Чтобы полностью понять, как Т-клетки вызывают сердечно-сосудистые и почечные заболевания, важно иметь возможность идентифицировать и количественно оценить конкретные субпопуляции Т-клеток, присутствующие в этих тканях. Субпопуляции Т-клеток определяются комбинацией поверхностных маркеров, цитокинов, которые они секретируют, и факторов транскрипции, которые они экспрессируют. Сложность популяции Т-клеток делает проточную цитометрию и внутриклеточное окрашивание бесценным методом для анализа фенотипов лимфоцитов, присутствующих в тканях. Здесь мы предоставляем подробный протокол для идентификации поверхностных и внутриклеточных маркеров (цитокинов и факторов транскрипции) в Т-клетках, выделенных из мышиной почки, аорты и дренирующих лимфатических узлов аорты в модели ангиотензина II, индуцированной гипертензией. Подробно описаны следующие этапы: выделение тканей, получение одиночных клеточных суспензий, стимуляция ex vivo, фиксация, пермеабилизация и окрашивание. Кроме того, обсуждаются несколько фундаментальных принципов проточного цитометрического анализа, включая выбор надлежащих элементов управления и соответствующих стратегий стробирования.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Последние данные свидетельствуют о том, что адаптивная иммунная система, в частности , Т - лимфоциты, играют решающую роль в развитии ряда сердечно - сосудистых заболеваний 1,2,3,4,5. Например, в модели ангиотензина II , индуцированной гипертонии, накопление Т - клеток в сосудах и почках мышей было описано 6. Накопление сосудистой преимущественно в адвентиции и периваскулярные жира. В почках, Т-клетки накапливаются в обоих мозговом веществе и корковом веществе почек. В зависимости от того, какое подмножество участвует, эти Т - клетки вызывают различные цитокины , которые могут влиять на сосудистую и функцию почек и приводят к развитию патологии (обзор McMaster и др. 6).

CD4 + Т - хелперные лимфоциты могут быть разделены на несколько подмножеств: Т - хелперов 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, Th22, Т - регуляторные (Treg клетки), и Т фолликулярная хелперные (TFH) клеток на основе их функций и подписи цитоkines 7. Точно так же, CD8 + , цитотоксические Т - клетки могут быть классифицированы как ТС1 Tc2, Tc17 или Tc9 8. Существуют также двойные негативные Т - клетки (например , клетки , которые не экспрессируют CD4 или CD8 Т - маркеров клетки). Часть этих клеток обладают альтернативный гамма-дельта-Т-клеточный рецептор (вместо классического альфа- и бета-рецепторы), и поэтому они упоминаются как гамма-дельта Т-клеток. Анализ многопараметрической проточной цитометрии поверхностным маркером, цитокина и фактора транскрипции представляет собой наилучший подход для идентификации этих клеток. Хотя этот метод широко используется в области иммунологии, он менее хорошо описаны в солидных органов и в условиях сердечно-сосудистых заболеваний.

Исторически сложилось так, идентификация лимфоцитов в тканях было ограничено иммуногистохимии или ОТ-ПЦР подходов. Хотя иммуногистохимии и иммунофлуоресценции мощные методы для определения распределения ткани антигена Interest, они недостаточны для того чтобы определить фенотипически подмножества участвующих. Кроме того, в то время как анализ ОТ-ПЦР является полезным для выявления экспрессии мРНК антигенов, как цитокины или факторы транскрипции, он не позволяет обнаруживать нескольких белков одновременно на уровне отдельных клеток.

Появление проточной цитометрии, особенно в сочетании с внутриклеточным окрашиванием для выявления цитокинов и факторов транскрипции, обеспечивает исследователей с мощной техникой, что позволяет идентифицировать и количественно определять на уровне одной клетки подмножеств иммунных клеток в солидных органов. Мы оптимизировали внутриклеточный анализ окрашивания для идентификации с помощью проточной цитометрии основных Т-клеточных подмножеств, присутствующих в мышиной почке, аорты и аортального дренирующих лимфатических узлов в модели ангиотензина II, индуцированной гипертонии. Оптимизация каждого шага: ткани пищеварения, исключая виво активации, пермеабилизации, и поверхностные и внутриклеточные результаты окрашивания в высоко повторнопроизводимое анализа, которые могут быть применены к другим сердечно-сосудистых и почечных моделей заболеваний.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Institutional Animal Care и использование комитет Университета Вандербильта утвердило процедуры, описанные в настоящем документе. Мыши размещены и уход в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (Национальные академии прессы. Revised 2010).

1. Выделение аортального Слив лимфоузлах, почки и аорте мышей

  1. Эвтаназии мышей CO 2 ингаляции. Спрей груди с 70% этанолом и осторожно откройте кожу и стенки грудной клетки с ножницами, чтобы разоблачить сердце.
  2. Для того, чтобы заливать сосудистую сеть, выполнить небольшой надрез в правое предсердие и устойчиво вводят по меньшей мере, 10 мл холодного PBS (приблизительно 1 мл / сек), в верхушке левого желудочка с использованием 21 или 23 G иглу. Заливать пока все органы не бланшируют. Сердце бледнеет в первую очередь. Побледнение печени указывает на то, что перфузия была хорошо выполнена.
  3. Используя небольшие щипцы и тонких ножниц, аккуратно срезана и вытащить кишечник,желудка, селезенки, поджелудочной железы и печени, чтобы лучше визуализировать аорту.
    Примечание: Этот шаг должен быть сделан очень точно, как повреждения желудочно-кишечного тракта может вызвать загрязнение.
  4. Вырезать и удалить каждое легкое с помощью ножниц. Промыть грудную полость фосфатно-солевым буфером (PBS) с использованием безыгольного шприца. Удалите излишки крови и жидкости с использованием стерильной марлей.
  5. Удалите брюшной аорты дренирующих лимфатических узлов с использованием тонких препаровальный пинцет. Убедитесь в том, чтобы не привести к разрыву капсулы. Удалите остатки жира на поверхности каждого лимфатического узла с рассекает щипцов. Вырежьте две почки с тонкими ножницами.
  6. Проанализируйте всю аорту (грудной и брюшной аорты) с тонкими изогнутыми ножницами. Старт на уровне сердца и тщательно отсечь от пищевода и позвонков вниз до уровня подвздошной бифуркацией, убедившись, что держать окружающий периваскулярное жир, присоединенный к аорте.
    Примечание: Дальнейшее рассечение аорты к удаливе окружающих структур может быть сделано под микроскопом. В частности, удалить артериальных ветвей (сонные артерии, подключичной артерии, целиакией, брыжеечных и почечных артерий) и лимфатических узлов. Держите последовательный слой периваскулярного жира вокруг каждой аорты, так как это место, где многие воспалительные клетки находятся в условиях гипертензии. Поместите каждую ткань в отдельные пробирки, содержащие холодной PBS.

2. Генерация одноклеточных суспензий из каждой ткани

  1. почки
    Примечание: Почки могут быть диссоциированы в суспензии отдельных клеток путем сочетания механической диссоциации плюс ферментативное переваривание.
    1. Приготовьте раствор почек пищеварение путем добавления коллагеназы D (2 мг / мл) и ДНКазы I (100 мкг / мл) в среде RPMI 1640 (с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS)). Приготовьте 10 мл на пробу почек.
    2. Используйте пинцет, чтобы передать две почки в диссоциации пробирку, содержащую 10 мл почки переваритьраствор ионов.
    3. Выполните механическую диссоциацию с использованием полуавтоматического диссоциатора устройство в соответствии с инструкциями изготовителя.
    4. После механической диссоциации, отсоединить трубку от устройства и выполнять ферментативного пищеварения. Инкубируйте образцы в течение 20 мин при 37 ° С при непрерывном вращении. Немедленно остановить ферментативное переваривание путем добавления холодной среде RPMI 1640, дополненной 5% FBS.
    5. Переносят раствор пипеткой в ​​50 мл коническую пробирку, после фильтрации через сито 40 мкм. Задразните оставшиеся ткани друг от друга, нажимая с плунжерный шприц емкостью 1 мл. Гранул клетки (500 XG, 8 мин, 4 ° C).
    6. Ресуспендируют осадок в 3 мл 36% центрифугирование в градиенте плотности сред. Передача суспензии в коническую пробирку на 15 мл. Осторожно добавьте 3 мл 72% центрифугирование в градиенте плотности сред под суспензии 3 мл 36% клеток без какого-либо нарушения. Центрифуга (1000 XG без тормоза, 20 мин, 4 ° С).
    7. Иммунные клетки будут расположены на границе раздела. Снимите верхний желтоватый слой, содержащий клеточный мусор, а затем довести объем до 15 мл с использованием холодного PBS. хорошо взболтать к пробою градиент. Спин клетки (300 XG, 8 мин, 4 ° С) и ресуспендируют осадок в 3 мл среды RPMI с 5% FBS. Подсчитайте количество живых клеток на гемоцитометра с использованием трипанового синего.
  2. аорта
    1. Готовят раствор аорта пищеварение путем добавления коллагеназы А (1 мг / мл), коллагеназы В (1 мг / мл), и ДНКазы I (100 мкг / мл) в среде RPMI 1640 (с добавлением 5% FBS).
    2. Использование тонких щипцов, передать аорту в 2 мл пробирку, содержащую 1 мл раствора аорта пищеварения. Фарш всю аорту на очень мелкие кусочки с мелкими ножницами в растворе пищеварения 1 мл. Держите на льду. Инкубируйте образцы в течение 30 мин при температуре 37 ° С при непрерывном вращении.
    3. Переносят раствор в блюдо культуры ткани и остановить enzymaкрестики пищеварение путем добавления 5-кратного объема холодной RPMI с 5% FBS.
    4. Переносят раствор пипеткой в ​​50 мл коническую пробирку, после фильтрации через сито 40 мкм. Задразните оставшиеся ткани друг от друга в одной клеточной суспензии путем прессования с плунжерный шприц емкостью 1 мл. Промойте фильтр грубой очистки и осаждения клеток (300 XG, 8 мин, 4 ° С).
    5. Промывают осадок добавлением 10 мл RPMI с 5% FBS. Спин клетки (300 XG, 8 мин, 4 ° С) и ресуспендируют осадок в 3 мл среды RPMI с 5% FBS. Подсчитайте количество живых клеток на гемоцитометра с использованием трипанового синего.
  3. В аортальный осушение лимфатических узлов
    1. Поместите сетчатый фильтр 40 мкм в тканевой культуральной чашке (60 мм х 15 мм). Поместите лимфатические узлы на сетчатого фильтра и дразнить их друг от друга в одной клеточной суспензии путем прессования с плунжерный шприц емкостью 1 мл. Промыть сетчатый фильтр с 2 мл RPMI с 5% FBS. Собирают клетки в чашке.
    2. Переводклетки в сокола пробирку 15 мл и окатышей клетки (300 XG, 8 мин, 4 ° С). Ресуспендируют осадок в 500 мкл RPMI с 5% FBS. Подсчитайте количество живых клеток на гемоцитометра с использованием трипанового синего.

3. Ex Vivo Стимуляция для обнаружения цитокина с помощью проточной цитометрии

  1. Подготовка среды для культивирования клеток: RPMI с 5% FBS, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 50 мкМ -меркаптоэтанол и 1% пенициллина / стрептомицина.
  2. Центрифуга каждой клеточной суспензии, полученный из почек, аорты и лимфатических узлов (300 XG, 8 мин, 4 ° С). Ресуспендируют каждую гранулу с клеточной культуральной среде при концентрации 1 × 10 6 клеток на мл.
  3. Стимулируют клетки путем добавления 2 мкл коктейля клеточной активации (содержащей форболовыми 12-миристат-13-ацетатом (РМА), Ионофор кальция Ionomycin и ингибитора Гольджи брефелдин А) на каждый 1 мл клеточной культуры.
    Примечание: конечная концентрацияс каждого компонента: 81 нМ РМА, 1,33 мкМ иономицина и 5 мкг / мл брефелдин A. Лечение ФМА и иономицином активирует клетки продуцировать цитокины. Цитокины секретируемые белки, которые должны быть пойманы в ловушку в клетках, чтобы обнаружить. Брефелдин А вызывает накопление обычно секретируемых белков в эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи. Таким образом, способ, описанный здесь, усиливает детектируемость цитокинпродуцирующей лимфоцитов с помощью проточной цитометрии.
  4. Пластина 1 до 2 миллионов клеток в 12-луночного (аорте или почек) или 24-луночного (лимфатических узлов) с низким уровнем приверженности пластин. Поместите пластинку в 37 ° C увлажненном CO 2 инкубаторе в течение 3 часов.
    Примечание: Число посеянных клеток может быть ниже, в лимфатических узлах от контрольных мышей. Кроме того, время стимуляции должна быть определена эмпирически для каждой популяции клеток и цитокин изученной. В случае Т-клеток, выделенных из аорты, почечных или лимфатических узлов, мы рекомендуем стимулирующее течение от 3 до 4 часов. Более длинная стимуляция шбольным не увеличивает секрецию цитокинов и будет стимулировать дальнейшее понижающей регуляции нескольких маркеров клеточной поверхности Т как CD3, CD4 и CD8. (Обратите внимание, что даже стимуляция 3-4 часа будет вызывать некоторую понижающей регуляции этих маркеров.)

4. Поверхность Окрашивание

  1. Перенести клетки в полистирола FACS пробирку и центрифугируют (300 XG, 8 мин, 4 ° С). Вымойте клетки дважды буфером FACS (Ca 2+ и Mg + свободный PBS , содержащий 4% FBS и 2 мМ ЭДТА) и разделить клеточную суспензию в равной степени в различных трубах FACS на основе количества панелей антител желательных и количество трубок , необходимых контрольных ( Смотри ниже).
  2. Для выполнения компенсации для каждой панели, подготовить неокрашенные трубки управления и одиночные прокуренные трубки для каждого типа ткани и панели антител. Кроме того, готовят флуоресценция минус один (FMO) контрольных трубок для каждой панели антител, добавляя все, кроме одного из антител.
  3. Отрегулируйте громкость каждой трубки до 2 мл FACSБуфер. Центрифуга клеточной суспензии (300 мкг, 8 мин, 4 ° С), удалить супернатант и блок Fc рецепторов путем инкубации клеток с 0,5 мкг анти-CD16 / CD32 антител на миллион клеток в течение 10 мин на льду.
    Примечание: CD16 является низким сродством IgG Fc-рецептор III (FcR III) и CD32 является FcR II. CD16 / CD32 экспрессируются на гранулоциты, тучные клетки, моноциты / макрофаги, естественных киллеров, В-клетки, дендритные клетки и некоторые активированных зрелых Т-клеток.
  4. Выполните жизнеспособность окрашивания: Промывают клетки с 1x PBS, центрифугируют (300 XG, 8 мин, 4 ° С) и ресуспендируют в 1000 мкл 1х PBS. Добавить 1 мкл клеток-impermeant амин-реактивным красителя (жизнеспособность пятно). Инкубировать в течение 15 мин при 4 ° С в защищенном от света месте.
  5. Во время инкубации, готовят коктейль из антител (для поверхностного окрашивания) в соответствующем объеме буфера FACS. Вымойте клетки дважды с 1-2 мл буфера FACS, центрифуга (300 XG, 8 мин, 4 ° С) и ресуспендируют каждую гранулу со 100 мклсмеси антител. Инкубировать в течение 30 мин при 4 ° С в защищенном от света месте.
    Примечание: Для каждого потока цитометрии антитела, полезно, чтобы определить оптимальное количество антител, необходимых при выполнении кривой титрования дозы.
  6. Вымойте клетки дважды с 2 мл буфера FACS и осадка клеток (300 XG, 8 мин, 4 ° С).

5. Закрепление, пермеабилизирующего и внутриклеточное Окрашивание

  1. Выполните внутриклеточное окрашивание с фиксирующей и пермеабилизации набор, содержащий соответствующие буферы, следуя инструкциям производителя. Закрепить и клетки проницаемыми путем ресуспендирования их в соответствующем буфере. Инкубируйте образцы в течение 40 мин при 4 ° С в защищенном от света месте.
  2. Добавьте 1 мл 1x и пермеабилизации промывочного буфера непосредственно к неподвижным и проницаемыми клетками. Центрифуга (500 XG, 8 мин, 4 ° С) и удалить супернатант. Ресуспендируют осадок с помощью 2 мл 1х промывочного буфера.
  3. Готовят смеси Антибodies (только для внутриклеточного окрашивания) в соответствующем объеме 1х промывочного буфера (обычно 100 мкл на пробирку).
    Примечание: Как указано выше, оптимальная концентрация антител должно быть определено для каждого антитела на панели. Например, на наличие антител к IL-17A или IL-17F, мы используем коэффициент разбавления 1:30, но на наличие антител к IFN & gamma; и Т-бет, мы используем коэффициент разбавления 1: 100.
  4. Центрифуга клетки (500 XG, 8 мин, 4 ° С) и ресуспендируют каждую гранулу с помощью 100 мкл смеси антител. Инкубировать в течение 40 мин при 4 ° C в защищенном от света месте.
  5. Вымойте клетки дважды с помощью 2 мл 1х промывочного буфера и осадка клеток (500 XG, 8 мин, 4 ° С). Ресуспендируют осадок 300 мкл 1х промывочного буфера и анализируют на проточном цитометре с соответствующими фильтрами.
  6. Для количественного определения общего количества клеток на образце ткани, используют счетных бус. До приобретения, добавьте рекомендуемый объем / количество подсчета бусинки в каждую пробирку.

6. Компенсация, стробирования, нормализацию и советы

  1. Компенсация и стробирования
    1. Запуск неокрашенные и одиночные запятнанные контрольные трубки для компенсации для корректировки спектрального перекрытия.
      Примечание: Использование компенсационных бусинок, а не клеточных элементов управления на основе компенсации необходимо в тех случаях, когда представляющий интерес антиген или популяции клеток в образце присутствует в таких малых количествах, что компенсация с использованием клеток будет трудно. Следует также отметить, при использовании тандемных красителей, рекомендуется подготовить компенсации для каждого эксперимента, поскольку тандемные красители варьируются от партии к партии, и с каждым днем.
    2. Запуск флуоресценции минус один контроль (лесозаготовительных предприятий) для всех флуорофоров в панели при запуске нового многоцветной эксперимента.
      Примечание: Элементы управления ФМО образцы, содержащие все антитела в панели кроме одного. Эти элементы управления позволяют точное дискриминацию положительных и отрицательных сигналов для опущенного антитела правильно регулировки оборотовт ворота. Эти элементы управления особенно важны, когда уровни экспрессии являются низкими или когда разделение целевой популяции бедна (например, когда мишень представляет собой цитокин или фактор транскрипции). Хотя это и не всегда необходимо, в некоторых случаях, контроль изотипа может быть предпочтительным вместо Предприятию управления, поскольку они обеспечивают надлежащую компенсацию за изотипа антитела и флуорофора конъюгат без специфичности антигена.
    3. Настройка основного ворота: регулировка рассеяния вперед Area (FSC-A) и боковое рассеивание (SSC Area-A) напряжение для того, чтобы обнаружить популяцию лейкоцитов.
    4. Исключить мертвые клетки.
      Примечание: Жизнеспособность пятно реагирует со свободными аминами присутствует как на поверхности и внутри клеток. В отличие от живых клеток, мертвые клетки (с ослабленной мембран) позволяют красителю войти в цитоплазму, увеличивая количество мечения белков. Таким образом, мертвые клетки будут ярче, чем живые клетки, позволяя легко дискриминации. Ворота на живойклетки.
      Примечание: Жизнеспособность клеточных суспензий из аорты и почек, может быть ниже, чем жизнеспособность клеточных суспензий из лимфатических узлов из-за дополнительной стадии пищеварения.
    5. Участок Forward Scatter Area (FSC-A) [Y-ось] и вперед Scatter Высота (FSC-H) [ось х]. Фуфайки появляются как диагональ на этом участке дот. Ворота на этой диагонали, чтобы исключить дублеты. Затем участок SSC-A [Y-ось] и CD45 [ось х].
    6. CD45 + лейкоциты населения могут быть легко идентифицированы. Ворота на этой группе населения. Последующие популяции могут быть идентифицированы из этой группы населения.
  2. Нормализация кровяных клеток
    1. Счетные гранулы обладают характеристиками, которые приводят к низкой FSC и высокой SSC. Например, если 50000 гранулы добавляют в 300 мкл суспензии отдельных клеток, уравнение для вычисления абсолютного числа любого дают тип клеток на пробирку выглядит следующим образом:
      Количество ячеек рэр труба = (50000 / количество шариков, подсчитанных с помощью проточной цитометрии) х количество подсчитанных клеток.
      Используя этот расчет, абсолютное число любого данного типа клеток на пробирку может быть определена. На основании того, сколько трубок были получены от каждого органа, число клеток на орган можно рассчитать.
      Примечание: Храните все клетки и реагенты при температуре 4 ° С в течение протокола. Избегайте энергичной вихревание, потому что это может привести к повреждению клеток. Используйте минимальные силы для осаждения клеток. Избегайте пузырьков в трубке FACS, поскольку она может провоцировать гибель клеток. Не позволяйте гранулы высохнуть в любое время.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, описанный позволяет идентифицировать поверхностных и внутриклеточных маркеров в Т-клетках, выделенных из мышиной почки, аорты и аортального дренирующих лимфатических узлов в модели ангиотензина II, индуцированной гипертонии. Типичные результаты представлены ниже.

Рисунок 1 демонстрирует стратегию стробирования , используемое для идентификации Т -системы иммунитета в суспензии отдельных клеток , приго...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный здесь протокол был оптимизирован для правильной идентификации субпопуляций Т-клеток, присутствующих в почках, аорте и лимфатических узлах мышей. Этот протокол может быть легко адаптирован для исследования других субпопуляций иммунных клеток, таких как В-лимфоциты и клетки врожденного иммунитета, и может быть модифицирован для включения других типов тканей. Этап пищеварения имеет решающее значение и должен быть модифицирован и оптимизирован для каждой ткани9. Длительная стадия пищеварения или использо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

МСМ поддерживается за счет гранта от Gilead сердечно-сосудистых наук.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана премии Американской кардиологической ассоциации стипендий (16POST29950007) в FL, учебный грант от Национального института здоровья (NIH T32 HL069765) к BLD, ассоциация стипендий премии American Heart (14POST20420025) М.А. Салеха и NIH K08 награду (HL121671) МСМ. МСМ также поддерживается исследовательский грант от Gilead Sciences, Inc.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Коллагеназа DROCHE11088882001
Коллагеназа AROCHE10103586001
Коллагеназа BROCHE11088815001
DnaseROCHE10104159001
1x Буфер для лизиса эритроцитовeBioscience00-4333-57
RPMI Medium 1614 1xGibco11835-030
DPBS без кальция и магнияGibco14190-144
PercollGE Healthcare17-5445-02Для центрифугирования градиента плотности
GentleMACS™ C tubeMiltenyi Biotec130-096-334
GentleMACS dissociator deviceMiltenyi Biotec130-093-235Используйте программу SPLEEN_04
Коктейль активации клеток (с Brefeldin A)Biolegend423303
анти-CD16/32eBioscience14-0161-81разбавить 1:100
LIVE/DEAD исправляемый фиолетовый набор для окрашивания мертвых клетокLife TechnologiesL34955
Набор буферных факторов транскрипцииBD Pharmingen562725
OneComp eBeads eBioscience01-1111-42
123 штуки eBeadseBioscience01-1234-42
CD45 AmCyan (клон 30-F11)BioLegend103138
CD3 PerCP-Cy5.5 (клон 17A2)BioLegend100218
IL-17A FITC (клон TC11-18H10.1)BioLegend506910
IL-17F APC (клон 9D3.1C8)BioLegend
CD4 APC-Cy7 (клон GK1.5)BD Biosciences560181
CD8 APC (клон 53-67)eBioscience17-0081-82
T-bet PE-Cy7 (клон 4B10)BioLegend644823
IFNγ FITC (клон XMG1.2)BD Biosciences557724
517004

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation. J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).
  2. Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55 (2), 500-507 (2010).
  3. Laroumanie, F., Douin-Echinard, V., Pozzo, J., et al. CD4+ T Cells Promote the Transition From Hypertrophy to Heart Failure During Chronic Pressure Overload. Circulation. 129 (21), 2111-2124 (2014).
  4. Guzik, T. J., Hoch, N. E., Brown, K. A., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).
  5. Ketelhuth, D. F. J., Hansson, G. K. Adaptive Response of T and B Cells in Atherosclerosis. Circ Res. 118 (4), 668-678 (2016).
  6. McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, Immunity, and Hypertensive End-Organ Damage. Circ Res. (6), 1022-1033 (2015).
  7. Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., et al. CD4+T Cells: Differentiation and Functions. Clin Dev Immunol. 2012, 1-12 (2012).
  8. Mittrücker, H. -W., Visekruna, A., Huber, M. Heterogeneity in the differentiation and function of CD8+ T cells. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 62 (6), 449-458 (2014).
  9. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
  10. Finak, G., Langweiler, M., Jaimes, M., et al. Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium. Sci Rep. 6, 20686(2016).
  11. Herzenberg, L. A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M., Herzenberg, L. A. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
  12. Hrvatin, S., Deng, F., O'Donnell, C. W., Gifford, D. K., Melton, D. A. MARIS: method for analyzing RNA following intracellular sorting. PLoS One. 9 (3), 89459(2014).
  13. Kalisky, T., Quake, S. R. Single-cell genomics. Nat Methods. 8 (4), 311-314 (2011).
  14. Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: Today's technology and tomorrow's horizons. Methods. 57 (3), 251-258 (2012).
  15. Jiang, L., Tixeira, R., Caruso, S., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nat Protoc. 11 (4), 655-663 (2016).
  16. Lemoine, S., Jaron, B., Tabka, S., et al. Dectin-1 activation unlocks IL12A expression and reveals the TH1 potency of neonatal dendritic cells. J Allergy Clin Immunol. 136 (5), 1355-1368 (2015).
  17. Gaublomme, J. T., Yosef, N., Lee, Y., et al. Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity. Cell. 163 (6), 1400-1412 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи