Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мышиные лимфоцит Этикетировочное по

8.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55270

⸱

29 апреля 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Werner Siemens Imaging Center, Department of Preclinical Imaging and Radiopharmacy, Eberhard Karls University Tübingen, 2Department of Dermatology, Eberhard Karls University Tübingen

В этой статье

Краткое содержание

После получения 64 Сu-модифицированного моноклонального антитела связывания с рецептором Т - клеток трансгенного мышея, Т - клетками являются радиоактивно метили в естественных условиях, анализировали на жизнеспособность, функциональность, стабильность маркировки и апоптоз, и адаптивно переносили в мышей с дыхательными путями гиперчувствительности замедленного типа реакцию для неинвазивного изображений с помощью позитронно-эмиссионной томографии / компьютерной томографии (ПЭТ / КТ).

Аннотация

Этот протокол иллюстрирует получение 64 Cu и хелатор конъюгацию / радиоактивную моноклональное антитела (монАТ) с последующим мышиной культурой лимфоцитов клеток и 64 Cu-антитело рецептором ориентации клеток. В пробирке оценки мечена и неинвазивные в естественных условиях отслеживания клетки в животной модели с воздуховодной гиперчувствительности замедленного типа реакции (DTHR) с помощью ПЭТ / КТ описаны.

Более подробно, сопряжение с мАтом с хелатором 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислотой (DOTA) показано. После производства радиоактивного 64 Cu, радиомечения в DOTA-конъюгированных мАт описано. Далее, расширение куриного овальбумина (Cova) -специфические CD4 + интерферона (ИФН) -γ-продуцирующих Т - хелперы (Кова-TH1) и последующее введение радиоактивной клеток COVA-ТН1 изображены. Различные методы в пробирке представлены для оценки эфффекты из 64 Cu-радиомечения о клетках, таких как определение жизнеспособности клеток с помощью трипанового синих, окрашивания для апоптоза с аннексином V для проточной цитометрии, и оценка функциональности с помощью IFN-gamma иммуноферментного теста (ELISA) , Кроме того, определение радиоактивного поглощения в клетки и стабильность маркировки описаны в деталях. Этот протокол далее описывает, как выполнять исследование отслеживания клеток в животной модели для дыхательных путей DTHR и, следовательно, индукция COVA-индуцированных острого DHTR в дыхательных путях BALB / с мышеем включена. Наконец, надежная ПЭТ / КТ рабочего процесс, включая приобретение изображений, реконструкцию и анализ представлен.

64 Cu-антитело , воздействующий подход рецептора с последующей интернализацией рецепторов обеспечивает высокую специфичность и стабильность, снижение клеточной токсичность, а также низкие цены эффлюксных по сравнению с обычными ПЭТ-индикаторами для маркировки клеток, например , 64 Cu-pyruvaldehyde бис (N-4-methylthiosemicarbazone) (64 Cu-PTSM). И, наконец, наш подход позволяет неинвазивным в естественных условиях отслеживания клетки с помощью ПЭТ / КТ с оптимальным отношением сигнала к фону в течение 48 часов. Этот экспериментальный подход может быть переведен в различные моделях животных и типов клеток с мембраносвязанными рецепторами, которые усваиваются.

Введение

Неинвазивная отслеживания клеток является универсальным инструментом для мониторинга функции клеток, миграции и самонаведения в естественных условиях. Недавние исследования отслеживания клетки были сосредоточены на мезенхимальных 1, 2 или костного мозга стволовых клеток , полученных 3 в контексте регенеративной медицины, аутологичных периферических белых кровяных клеток в воспалении или Т - лимфоцитов в приемными терапии клеток против рака 3, 4. Выяснение мест действия и основных биологических принципов клеточной терапии имеет огромное значение. CD8 + цитотоксических Т - лимфоцитов, методами генной инженерии антиген химерный рецептор (CAR) Т - клетки или опухолевые-лимфоциты (Tīls) широко рассматривается как золотой стандарт. Тем не менее, ассоциированные с опухолью антиген-специфические Th1 клетки оказались эффективной альтернативой вариант лечения 4, </ SUP> 5, 6, 7.

В качестве ключевых игроков в воспалении, орган-специфический аутоиммунных заболеваний (например, ревматоидный артрит или бронхиальная астма), и клеток , представляющих особого интереса в иммунотерапии рака, важно , чтобы охарактеризовать временные закономерности распределения и самонаводящиеся Th1 - клетки. Неинвазивные в естественных изображения с помощью ПЭТ представляет собой количественный, высокочувствительный метод 8 для изучения моделей миграции клеток, в естественных условиях ГСНЫ, и сайты действия Т - клеток и ответы во время воспаления, аллергии, инфекций или отторжения опухоли 9, 10, 11.

Клинически, 111 В-Oxine используется для лейкоцитарной сцинтиграфии для дискриминации воспаления и инфекции 12, в то время как 2-дезокси-2- (18F) , фтор-D-глюкозы (18 F-ФДГ) обычно используется для отслеживания исследований клеток с помощью ПЭТ 3, 13. Одним из главных недостатков этого ПЭТ трассирующими, однако, короткий период полураспада радионуклида 18 F в 109,7 мин и низкой внутриклеточной стабильности , которая препятствует визуализации в более поздние моменты времени после усыновителя перенос клеток. Для более длительного срока в естественном условиях исследования отслеживания клеток путем ПЭТ, хотя и нестабильные в клетках, 64 Си-PTSM часто используются для обозначения неспецифический клетки 14, 15 с сведены к минимуму вредных воздействий на жизнеспособности Т - клеток и функции 16.

Этот протокол описывает способ для дальнейшего уменьшения невыгодных воздействие на жизнеспособность и функции клеток с помощью Т-клеточного рецептора (TCR) -специфический радиоактивно меченый Mab. Во- первых, производство радиоизотопных 64 Cu, конъюгации с монАТ KJ1-26 с гое хелаторы DOTA, и последующее 64 Cu-радиоактивное показаны. На втором этапе, выделение и расширение COVA-TH1 клеток мышей - доноров DO11.10 и радиоактивной с 64 Cu-нагруженной DOTA-конъюгированного монАТ KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) описаны подробно. Оценка поглощения ценностей и оттоком радиоактивности с дозой калибратора и гамма-подсчета, соответственно, а также оценка эффектов 64 Cu-радиомечения на жизнеспособность клеток с помощью трипанового синего и функциональности с IFN-gamma ELISA представлены , Для неинвазивной в естественных условиях отслеживания клетки, то извлечение из мышиной модели COVA-индуцированной острой DTHR дыхательных путей и изображений приобретения ПЭТ / КТ после приемных передачи клеток описаны.

Кроме того, этот подход маркировки может быть передан в различные модели заболеваний, мышиные Т-клетки с различным ТКРОМ или общими клетками, представляющего интереса с мембраносвязанными рецепторами или экспрессией MarKERS , лежащий в основе непрерывного мембраны челночного 17.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Меры предосторожности: При работе с радиоактивностью, хранить 64 Cu за 2 дюйма толщиной свинцовых кирпичей и использовать соответствующую защиту для всех судов , осуществляющих деятельность. Используйте соответствующие инструменты косвенно обращаться неэкранированных источников, чтобы избежать прямого контакта рук и свести к минимуму воздействие радиоактивного материала. Всегда носите радиационные знаки дозиметрический контроль и средства индивидуальной защиты и проверить себя и рабочая зона загрязнения немедленно ее решения. Откажитесь потенциально зараженным средства индивидуальной защиты перед тем, как покинуть зону, где используется радиоактивный материал. Хранить все радиоактивные отходы за свинцовой защиты до тех пор , радиоактивный 64 Cu не распадались 10 (приблизительно полужизни = 127 ч) , прежде чем адекватной утилизации.

1. 64 Cu Производство

Примечание: радиоизотопные 64 Cu производится через 64 Ni (р, п) 64 Cu ядерной реакции с использованием Пэттраса циклотронного в соответствии с модифицированным протоколом McCarthy и др. 18.

  1. Для производства 64 Cu, 64 облучить Ni, который гальваническим на платина / иридий пластины (90/10), с 30 мкА в течение 6 ч с пучком протонов 12,4 МэВ.
  2. Нагреть цель платина / иридий до 100 ° С в выделенный полиэфирэфиркетон (PEEK) и инкубируют в камере в 2 мл концентрированной HCl в течение 20 мин , чтобы растворить 64 Cu / 64 Ni.
  3. Добавить еще 1 мл концентрированной HCl и инкубируют в течение 10 мин.
  4. Упаривает HCl с использованием потока аргона и охлаждают камеру до комнатной температуры.
  5. Промыть камеру с 3 мл 4% 0,2 М HCl и 96% метанола (V / V) и передать этот раствор в качестве обменной колонки ионов, который был предварительно кондиционировал с 4% 0,2 М HCl в метаноле в течение по крайней мере 15 мин. Проточный может быть использован , чтобы переработать 64 Ni.
  6. Промыть 64 Cu сохраняется в колонке с 4% 0,2 М HCl ян метанола.
  7. Элюции 64 Cu 70% 1,3 М HCl / 30% изопропанола (об / об) в пробирку для сбора, выпаривают раствор в потоке аргона и пусть флакона остыть до комнатной температуры.
  8. Растворить 64 Cu в 140-210 мкл 0,1 М HCl.

2. Антитело Конъюгирование с DOTA и последующее 64 Cu-радиоактивной

Примечание: хелатор DOTA будет связан с функциональными аминогруппами мАта с помощью N-гидроксисукцинимида (NHS) в химии эфира и конъюгат будет впоследствии радиоактивно с 64 Cu 19.

  1. Регулировка концентрации KJ1-26-мАт до 8 мг / мл и Диафильтрат 1 мл раствора мАт против 0,1 М Na 2 HPO 4 , рН 7,5 , обрабатывали 1,2 г / л из ионообменной смолы с помощью хелатирующего иона с молекулярной массой отрезать ( MWCO 30 кД) центробежный блок фильтров. Применяют 3 последующих стадий промывки с 14 мл буфера. После последней стадии промывки,концентрации раствора снова до 1 мл. Количественно концентрации антител путем измерения оптической плотности 280 нм.
  2. Готовят раствор DOTA-NHS в сверхчистых или ПЦР-класса водой в концентрации 10 мг / мл, непосредственно перед использованием. Пусть флакон довести до комнатной температуры перед открытием, чтобы избежать конденсации воды, и тщательно удалить DOTA-NHS с помощью пластикового шпателя. Добавьте 216 мкл этого раствора DOTA-NHS до 8 мг раствора диафильтрации KJ1-26-мАт, тщательно перемешать, и инкубируют в течение 24 ч при 4 ° С на барабанном смесителе.
  3. Диафильтрат в DOTA-KJ1-26-моноклональное антитело против 0,25 М ацетата аммония, рН 7,0, обрабатывали 1,2 г / л в обменной смолы хелатирующего иона, используя молекулярную массу отрезать (MWCO 30 кДа) центробежного фильтра. Применение 7 стадий промывки. Концентрат ГПА до конечного объема 1 мл и снова измеряют концентрацию белка путем измерения OD 280 нм.
  4. Перед радиомечением, замены буфера в DOTA-KJ1-26-мАте в PBS с помощью размера-возбаlusion хроматографии с использованием колонки гель-фильтрации. Это также устраняет потенциальные примеси малых молекул.
  5. Подготовьте 100 МБк раствора 64 CuCl 2 в 10 мМ HCl и доведения рН до 6-7 с 10 - кратным PBS. Добавляют 200 мкг DOTA-KJ1-26-МКА. Инкубируют в течение 60 мин при 37 ° С.
  6. Для контроля качества, выполнения тонкослойной хроматографии с 0,1 М цитрат натрия (рН 5) в качестве подвижной фазы и анализируют с помощью авторадиографии. По крайней мере, 90% активности должны быть связаны с антителом и таким образом быть обнаружены в начальной точке. Несвязанная активность хелатный по цитрату на основе подвижной фазы и полосы на фронт растворителя. Для справки, использование 64 CuCl 2 рекомендуется.

3. Куриный Овальбумин конкретных TH1 (Кова-TH1) Выделение клеток и расширения

Примечание: Культура клеток Th1 описана в соответствии с ранее опубликованными исследованиями 16, 17,

  1. Изолировать селезенки и Экстраперитонеальные лимфатические узлы (LNS) от мышей DO11.10.
    1. Пожертвуйте мышь в соответствии с федеральными правилами. Дезинфекция животного с 70% -ный этанолом и зацикливается его с помощью клейкой ленты для удаления селезенки и лимфоузлов. Сделайте срединный разрез и отделить кожу от брюшины путем боков, потянув его на каждый участок.
    2. Расположить шейки матки, осевые, плечевые и паховые LNS. Удалите их с тупым пинцетом и поместить их в 1% фетальной сыворотке теленка (FCS) / PBS буфер.
    3. Откройте брюшины и найдите селезенку. Отдельная селезенку из поджелудочной железы и соединительной ткани, а поместить его в 1% буфере FCS / PBS. Для дальнейших указаний, ссылки см 20,21.
  2. Фарш селезенки и лимфоузлов через фильтр в 50 мл 40 мкм завинчивающейся трубу, используя поршень шприца. Промыть фильтр 10 мл 1% FCS / PBS-буфера.
  3. Центрифуга при 400 мкг в течение 5 мин и удалить супернатант. SubsequenTLY, производят лизис эритроцитов путем добавления аммония хлорид калия (ACK) буфера для лизиса (1,5 мл на одно животное) донора в течение 5 мин при комнатной температуре. Добавить 8,5 мл 1% FCS / PBS-буфер (за животное-донора).
  4. Центрифуга клетки при 400 мкг в течение 5 мин и удалить супернатант. Промывают клетки в 10 мл 1% FCS / PBS-буфера, центрифуге при 400 мкг в течение 5 мин и удалить супернатант.
  5. Для разделения магнитного клетки, клетки вновь суспендируют в 1% FCS / PBS-буфере и добавить CD4 + микрошарики. Обратитесь к инструкции изготовителя по объему буфера и количество CD4 + микрогранули для использования.
  6. Инкубируют в течение 20 мин при 4 & deg; С. Затем добавляют 1% FCS / PBS-буфера до 50 мл, центрифугировать клетки при 400 мкг в течение 5 мин и удалить супернатант.
  7. Продолжить с изоляцией CD4 + Т - клеток с использованием коммерческих колонок магнитной сепарации и соответствующий магнитом стенда в соответствии с протоколом производителя. Настройка элюированного CD4 + Т - клеток к шncentration из 10 6 клеток / мл в модифицированной среде Дульбекко Игла с 10% инактивированной нагреванием ФТС, 2,5% пенициллина / стрептомицина, 1% HEPES буфера, 1% MEM аминокислот, 1% пирувата натрия и 0,2% 2-меркаптоэтанола и магазин их при 4 ° С.
  8. Собирают разряд колонки в 50 мл завинчивающейся крышкой пробирку подготовить антиген-презентирующих клеток (АПК). Центрифуга разряда колонки при 400 мкг в течение 5 мин и удалить супернатант.
  9. Добавьте 10 мкг / мл анти-CD4 (клон: Gk1.5), 10 мкг / мл анти-CD8 (клон: 5367,2) и 10 мкг / мл анти-мыши крысы мАт (MAR18.5) и 1,5 мл кроличьего комплемента. Инкубируют в течение 45 мин при 37 ° С.
  10. Центрифуга клетки при 400 мкг в течение 5 мин, удалить супернатант и добавляют 3 мл среды. Облучать АРС на γ-лучи, или рентгеновский источник с 30 Гр в общей сложности. После этого отрегулировать АРС до концентрации 5 × 10 6 клеток / мл.
  11. Добавьте 100 мкл CD4 + Т - клеток и 100 мкл АРС на PLA 96-луночногот.е вместе с 10 мкг / Мл Кова 323-339-пептида, 10 мкг / мл анти-IL-4-мАт, 0,3 мкМ CPG1668-олигонуклеотидов и 5 Ед / мл IL-2.
  12. Добавить 50 Ед / мл IL-2 каждый второй день. Через 3 - 4 дней, передача клетки от 96-луночных планшетов с 24-луночными планшетами. Смешайте 3-5 скважин из 96-луночного планшета, в одной скважине 24 на-луночного планшета. Добавьте 100 Ед / мл IL-2, содержащий носитель в соотношении 1: 1.
  13. Еще через 2-3 дня, перенести клетки из 48-луночного планшета до 175 см 2 колбы для культивирования клеток (1 х 48-луночного планшета на колбу). Заполните со средой в соотношении 1: 1. Добавить 50 Ед / мл IL-2 каждый второй день.
  14. Разделение клеток в зависимости от плотности клеток и добавляют 50 Е / мл IL-2, каждый второй день. В этой моды, культуры клеток в течение еще 10 дней.

4. COVA-ТН1 клеток радиоактивной

Примечание: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-мАт будет применяться к культуре клеток COVA-ТН1 , чтобы позволить внутриклеточный радиоактивной метки.

  1. Для Кова-TH1 сеLL радиоактивные, рисовать 37 МОк меченного 64 Cu-DOTA-KJ1-26-мАта в шприце без мертвого объема с использованием дозой калибратора. Добавляют 1 мл физиологического раствора, чтобы получить раствор 37 МБк / мл.
  2. Приостановка клетки COVA-TH1 в среде при 2 × 10 6 клеток / мл и добавляют 0,5 мл клеточной суспензии в каждую лунку в 48-луночный планшет.
  3. Добавьте 20 мкл свежеприготовленного 37 МБк / мл 64 Cu-DOTA-KJ1-26-мАт раствора в каждую лунку 48-луночного планшета. Конечное соотношение для маркировки составляет 0,7 МБк на 10 6 клеток в объеме 520 мкл. Инкубируют при 37 ° С и 7,5% СО 2 в течение 30 мин.
  4. После инкубации, осторожно ресуспендируют клетки в в каждой лунке и передач клеточной суспензии из 48-луночного планшета в 50 мл завинчивающейся трубки. Для того, чтобы свести к минимуму потери клеток, промойте каждую лунку с предварительно нагретой средой.
  5. Центрифуга клеточной суспензии COVA-TH1 при 400 мкг в течение 5 мин, отбросить супернатант, и клетки вновь суспендируют в 10 мл PBS, предварительно нагретом. Удаление Aliquot клеточной суспензии для подсчета клеток. Повторите этап стирки.
  6. Количество жизнеспособных клеток COVA-TH1 в соответствующем разведении окрашивания трипановым синим.
  7. Регулировка концентрации клеток 5 × 10 7 клеток / мл для внутрибрюшинного (IP) введения 10 7 клеток в 200 мкл PBS.
  8. Повторите шаги 4.3-4.5 , чтобы радиометки клетки COVA-TH1 с увеличением количества активности, например, 1,4 или 2,1 МБк МБк на 10 6 клеток.
    1. Для того, чтобы радиометки клетки с 1,4 МБк на 10 6 клеток, используют 40 мкл 37 МБк / мл 64 раствора Cu-DOTA-KJ1-26-монАТ и 60 мкл для радиоактивной 2,1 МБк на 10 6 клеток. Выполните шаги 4.3-4.7 с 0,7 МБк, 1,4 МБк и 2,1 МБк 64 Cu-PTSM , но увеличивают время маркировки до 3 ч для сравнительных исследований 17.
    2. Перейдите к шагу 5, чтобы определить оптимальное количество активности.

5. In Vitro оценки влияния мечена на COVA-Th1 клетки

Примечание: Характеристика влияний радиоактивного на Th1 клетки осуществляются с помощью трипанового синего исключения для жизнеспособности, IFN-gamma ELISA для оценки функциональности и V окрашивания РЕ-аннексина для индукции апоптоза 16, 17. Определение внутриклеточного поглощения и отток радиоактивности также описано ниже. По сравнению, может быть также использована 64 клетка Cu-PTSM-меченого COVA-TH1.

  1. Влияние на жизнеспособность трипанового синего исключения
    1. Настройка по меньшей мере 18 × 10 6 COVA-Th1 клетки радиоактивно меченных с 0,7 МБк / 10 6 клеток, 1,4 МБк / 10 6 клеток и 2,1 МБк / 10 6 клеток , соответственно , до концентрации 2 × 10 6 клеток / мл и выполнить 5.1 шагов. 2-5.1.7 для каждой дозы активности. Использовать не radioactiве KJ1-26-мАт меченых клеток COVA-Th1 и немаркированные клетки COVA-TH1 в качестве контрольной группы.
    2. Пипеткой 1 мл раствора клеток в 9 лунки 24-луночного планшета.
    3. Собирает содержание 3 скважин в 3 отдельных 15 мл винтовой крышки трубку, через 3 часа после первоначального радиомечения.
    4. Промыть Теперь пустые лунки с предварительно нагретой средой, чтобы свести к минимуму потери клеток и добавить среду в соответствующие 15 мл винтовой крышки трубку с шага 5.1.3.
    5. Центрифуга 15 мл пробирки при 400 мкг в течение 5 минут и ресуспендируют в результате осадок клеток в 1 мл предварительно нагретой среды.
    6. Граф как жизнеспособные и мертвые клетки в трипановом синим отдельно для каждых 15 мл пробирки и вычислить процент жизнеспособных клеток.
    7. Повторите шаги 5.1.3-5.1.6 24 и 48 ч после 64 Cu-DOTA-KJ1-26-мАт радиоактивной.
  2. Воздействие на функциональность определяется IFN-gamma ELISA
    Примечание: Для того, чтобы оценить эффект 64 Cu-DOTA-KJ1 26-мАт радиоактивной на IFN-γ костюмноп в качестве маркеров функциональности, выполняет IFN-γ ELISA от коммерческого поставщика и ссылаться на ссылку 17 для получения дополнительной информации.
    1. Дисперсные 10 5 жизнеспособных клеток в 100 мкл среды на 96-луночный планшет, 3 ч после 64 Cu-DOTA-KJ1-26 радиоактивной клеток COVA-ТН1 с 0,7 МБк, 1,4 МБк или 2,1 МБк. Используйте немаркированные, нерадиоактивные KJ1-26-мАт-меченый или 64 Cu-PTSM-меченые клетки COVA-TH1 , как элементы управления.
    2. Стимулируют производство IFN-gamma 10 в 5 64 Cu-DOTA-KJ1-26-мАт-меченых клеток COVA-ТН1 в 100 мкл среды с 10 мкг / мл пептида COVA, 5 Ед / мл IL-2 и 5x10 5 АРС в 100 мкл среды в течение 24 ч при 37 ° С и 7,5% CO 2. Другие элементы управления могут быть другие условия без добавления пептида COVA.
    3. Анализ супернатантой ELISA в соответствии с инструкциями изготовителя.
    4. Повторите шаг 5.2.2. до 5.2.3. через 24 и 48 ч после процедуры маркировки.
  3. Индукция апоптоза определяется V окрашивания РЕ-аннексин для проточной цитометрии
    Примечание: Для оценки индукции апоптоза с помощью радиоактивного 64 Cu-DOTA-KJ1-26-мАта, использует коммерчески доступный набор для проточной цитометрии и подготовить образцы клеток в соответствии с инструкциями производителя перед окрашиванием аннексина V на фосфатидилсерину экспозицию на клеточной мембране ,
    1. На 3, 24 и 48 ч после 64-Cu-DOTA KJ1-26-мАт радиоактивных клеток COVA-TH1, пятно трехкратном повтора по меньшей мере , 10 6 64 Cu-ДОТ-KJ1-26-мАт-меченых клеток COVA-ТН1 с Аннексин V комплект в соответствии с инструкциями изготовителя и анализ в течение следующего часа. Используйте нерадиоактивные KJ1-26-мАт-меченые, 64 Cu-PTSM-меченных и немаркированные клетки COVA-TH1 в качестве контроля. Пожалуйста, обратитесь к 17 ссылке для получения более подробной информации.
  4. Усвоение и отлив
    Примечание: Поглощение 64 Cu-DOTA-KJ1-26-мАт в клетки измеряют в дозе калибратора и откачивающего радиоактивности измеряется в γ-счета анализа 0, 5, 24 и 48 ч после радиомечения.
    1. Подготовьте десять γ-счетных трубок каждый в течение 64 Cu-DOTA-KJ1-26-мАт-меченых клеток COVA-TH1, соответствующего супернатанта и стадии промывки.
    2. Передача 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26-моноклональное антитело-меченных COVA-TH1 клетки в 1 мл среды в каждой из десяти γ-счетных трубок непосредственно после мечени. Для каждой из точек времени 5, 24 и 48 ч после радиомечения, сохранить по крайней мере 10 7 64 Cu-DOTA-KJ1-26-мАт-меченых клеток COVA-TH1 в среде на 24-луночные планшеты для культивирования клеток в инкубаторе при 37 ° С и 7,5% СО 2.
    3. Центрифуга γ-счетных трубок при 400 мкг в течение 5 мин и перенести надосадочную жидкость в десять новых γ-счетных трубок.
    4. Промывают клетки один раз в 1 мл среды для удаления несвязанной фракции 64 Cu-DOTA-KJ1-26-мАт апаd собирают супернатант в десяти новых γ-счетных трубок.
    5. Добавляют 1 мл новую среду для клеток Кова-ТН1 и определить начальное значение поглощения в дозе калибратора. Трубки могут также храниться в инкубаторе при температуре 37 ° С и на 7,5% CO 2.
    6. Повторите шаги 5.4.2 до 5.4.5 через 5, 24 и 48 ч и измерить все пробирки в гамма-счетчике в соответствии с протоколом производителя. Для коррекции радиоактивного распада и для количественного анализа, использует стандарт с определенной дозой радиоактивности.

6. ОВА-индуцированной острой DTHR в дыхательных путях

Примечание: Динамика миграции ГСН и модели адаптивно переданных и радиоактивно меченный COVA-TH1 клеток к месту воспаления будет визуализировать и количественно в животной модели COVA-индуцированной дыхательных-DTHR 16, 17.

  1. Вводят-8 недель старых мышей BALB / с мышей внутрибрюшинно со смесью 150 мкл альuminum гель / 50 мкл COVA-раствор (10 мкг в 50 мкл PBS) для иммунизации мышей.
  2. Через две недели после иммунизации, анестезию мышей 100 мг / кг кетамина и 5 мг / кг ксилазина путем инъекции внутрибрюшинно. Поместите подопытный мышей на спине и медленно пипетка 100 мкг Ковы, растворенную в 50 мкл PBS в ноздри животных. Животные будут вдыхать падение раствора по каплям.
  3. Повторить через 24 часа. Для более сильных дыхательных путей DTHR индукций, повторите еще раз через 48 часов.
  4. Для того, чтобы проанализировать специфическую миграцию клеток, переданных COVA-ТН1, индуцируют в дыхательных путях-DTHR с индейкой или фазанов-OVA в качестве контроля. Поэтому, повторите шаги 6.1-6.3 с помощью соответствующего OVA-белка.

7. В визуализации in vivo с использованием ПЭТ / КТ

Примечание: В естественных изображениях 64 Cu-DOTA-KJ1-26-мАт-меченые клеток COVA-ТН1 в Кова-DTHR больные мыши и Однопометники управления демонстрируют специфический хоуминг и миДинамика Gration ячеек Кова-ТН1. Таким образом, получает статическое сканирование ПЭТ и КТ анатомической сканирует последовательно 3 24 и 48 ч после адоптивного переноса клеток.

  1. Непосредственно после того, как радиомечения, отрегулировать 64 Cu-DOTA-KJ1-26-мАт-меченых клеток COVA-TH1 до 5 × 10 7 клеток / мл для внутрибрюшинной инъекции 10 7 клеток в 200 мкл.
  2. С помощью 1 мл шприца и 30-иглы калибра с, рисовать 200 мкл 64 Cu-DOTA-KJ1-26-мАт-меченой клеточной суспензии COVA-TH1 и вводят клетки внутрибрюшинно в Кова-DTHR-больных животных между 4 й и 5 - й сосок. Для того, чтобы определить общее количество впрыскиваемого радиоактивности, измеряют шприц в дозе калибратора до и после инъекции.
  3. Обезболить мышей, 10 мин до желаемого времени поглощения, с 1,5% изофлуран в 100% кислорода (расход: 0,7 л / мин) в анестезии коробки с регулируемой температурой.
  4. В то же время, в целях содействия сотрудничеству в регистрацииПЭТ и КТ изображений во время анализа изображений, исправить стеклянные капилляры , содержащие 64 раствор Cu-DOTA-KJ1-26-Mab или свободное решение 64 CuCl 2 под кроватью мыши.
    1. Таким образом, приготовить раствор 0,37 МБк / мл и заполняют стеклянные капилляры с объемом 10 мкл этого раствора с. Так как клеточные полученные сигналы радиоактивности по своей природе слабы, не использует большое количество активности, чтобы убедиться, что маркеры не мешая клетки, полученные сигналы в мышах.
  5. После достижения хирургической толерантности, как показано потеря снятия педали рефлекса задней конечности, передать мышь к ПЭТ-КТ и совместимой мелкие животные постели, снабженная соответствующей системе труб для поддержания анестезии.
  6. Зафиксировать мыши на мелких животных кровати с помощью ватных тампонов и хирургическую ленту. Нанести глазную мазь, чтобы избежать высыхания глаз.
  7. Перенести кровать мыши к сканеру ПЭТ, центр поля зрения с FOCUы на легкие и приобретают 20 мин статической ПЭТ с окном энергии 350-650 кэВ.
  8. Перенести кровать мыши к сканеру КТ. Via скаутского зрения, центр поля зрения на легких. Приобретает плоскую КТ изображение с помощью 360 проекций при повороте на 360 ° в режиме «шаг и снимать» с временем экспозиции 350 мс и биннинга фактор 4.

Анализ 8. Изображение

  1. Восстанавливают данные списка режима ПЭТ с применением статистического итеративного упорядоченное подмножество ожидания максимизации (Osem) 2D алгоритм и КТ в 3D-изображение с размером пикселя 75 мкм.
  2. Для изображения совместной регистрации в качестве программного обеспечения соответствующего анализа изображений (например Inveon исследований на рабочем месте или ПМОД), используйте автоматический инструмент корегистрацию. Если это не удается, используйте стеклянные капилляры под кроватью мыши в качестве руководства для совместного зарегистрировать реконструированных ПЭТ и КТ изображений в пространственно-осевых, корональной и сагиттальной зрения.
  3. Исправьте изображения ПЭТдля радиоактивного распада с использованием радиоактивного распада закон и половину времени радионуклидного 64 Cu в 12,7 ч. Для нормализации изображения, выберите одно изображение (A) в качестве эталона и регулировать интенсивность отображения изображения в соответствующем программном обеспечении для анализа изображений.
    1. Используя значения только установленные для опорного изображения (А), впрыскиваются активность (А) и впрыскиваемая активность для других изображений (X), нормализуют другие изображения, используя следующее уравнение: (впрыскиваются активность (X) / впрыскиваемой активность ( А)) значение интенсивности х (А).
  4. Draw 3D объемы интерес (ВОИ) на нормализованного сигнала ПЭТ легочных и perithymic LNs.
  5. Определить процент инъецированной дозы на см 3 (% ID / см 3) , используя следующее уравнение: (среднее значение активности в ВОИ / общей активности у мышей) х 100. Для получения дополнительных указаний в отношении анализа изображений, ссылки см 22, 23.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 приведены маркировки COVA-TH1 клеток с 64 Cu-DOTA-KJ1-26-монАТом и опытно - конструкторской для в пробирке и в естественных условиях исследования описанного в данном протоколе.

figure-results-1
Рисунок 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-мАт Этикетировочного Процесс & Экспериментальный дизайн.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол представляет собой надежный и простой способ стабильно радиометки клетки для отслеживания ин виво с помощью ПЭТ. Используя этот метод, COVA-TH1 клетки, выделенные и расширена в пробирке от мышей - доноров, могут быть помечены радиоактивным изотопом 64 Cu-DOTA-KJ1-26-монАТ и их наведением отслеживалась в легочных и perithymic LNs как места COVA презентации в Кова-индуцированной острой DTHR дыхательных путей.

Модификация мАта с хелатором требует быстр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят доктора Джулию Mannheim, Уолтер Эрличманн, Рамона Штумма, FUNDA Cay, Дэниел Бакала, Марен ГАРАНТ, а также Натали Алтмайер за поддержку в ходе анализа экспериментов и данных. Эта работа была поддержана Вернер Сименс-Фонд, DFG через SFB685 (проект B6) и удачи (2309-0-0).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
HCl, SuprapurMerck, Дармштадт, Германия1.0031864Cu производство
метанола, SuprapurMerck, Дармштадт, Германия1.0600764Cu производство
изопропанола, SuprapurMerck, Дармштадт, Германия1.010464Cu
производство Pt/Ir (90/10) plateÖ gussaИзготовлено на заказ64Cu
производство PEEK камераWKLИзготовлено на заказ64Cu производство
64NiChemotrade64Cu производство
Polygram SIL G/UV 254 пластинаMacherey-Nagel80502164Cu производство
Ионный обмен колонкаBioRadAG1-X864Cu производство
Твердотельная мишенная система для PETtraceWKLcostum made64Cu production
64Cu модуль обработкиWKLcostum made64Cu производство
Калибратор дозыCapintecCRC-25R
PETtrace циклотронGeneral Electric Medical Systems
DOTA-NHSMacrocyclicsB-280DOTA-конъюгация
Anti-cOVA-TCR антитела (KJ1-26)Выделен из гибридомной клеточной культурыDOTA-конъюгация
Na2HPO4Sigma-Aldrich71633DOTA-конъюгация
H+ Chelex 100Sigma-AldrichC7901DOTA-конъюгация
Amicon Ultra-15 фильтрующий блокMerck MilliporeUFC910008DOTA-конъюгация
Rotipuran сверхчистая водаCarl RothHN68.3DOTA-конъюгация
ацетата аммонияSigma-Aldrich32301DOTA-конъюгация
PBSУниверситет ТюбингенаDOTA-конъюгация
Micro Bio-spin P-6 колонкаBio-Rad Laboratories7326221DOTA-конъюгация
цитрат натрияSigma-Aldrich71497DOTA-конъюгация
Cyclone Plus PhosphorImager Perkin-ElmerL2250116DOTA-конъюгация
DMEMMerck Millipore102568ингредиент для Т-клеточной среды 
Ингредиент FCSMerck MilliporeS0115/1004Bдля Т-клеточной среды 
Пируват натрияMerck MilliporeL0473ингредиент для Т-клеточной среды 
MEM-аминокислотыMerck MilliporeK0293ингредиент для Т-клеточной среды 
HEPES Merck MilliporeL 1613ингредиент для Т-клеточной среды 
  Пенициллин/стрептомицинMerck MilliporeA2212ингредиент для Т-клеточной среды 
0,05 мМ 2-&бета;-меркаптоэтанолингредиент Sigma-AldrichM3148для Т-клеточной среды 
DO11.10 мышисобственной селекцииTH1 клеточная культура
DPBSGibco14190144TH1 клеточная культура
Cell siter 40 &микро; М Corning352340TH1 клеточная культура ACK
лизирующий буферLonza10-548ETH1 клеточная культура
CD4 MicroBeads, мышьMiltenyi Biotech130-097-145TH1 клеточная культура
QuadroMACS сепараторMiltenyi Biotech130-090-976TH1 клеточная культура
LS колонкаMiltenyi Biotech130-042-401TH1 клеточная культура
анти-CD4 антитело (Gk1.5)Выделено из гибридомной клеточной культурыTH1 клеточной культуры
анти-CD8 антитело (5367.2)Выделено из гибридомной клеточной культурыTH1 клеточное
антитело Anti-rat (MAR18.5)Выделено из гибридомной клеточной культурыTH1
Кролик комплемент MAtebu-BioCL3221TH1 клеточная культура
Anti-IL-4 антитело (11B11)Выделено из гибридомной клеточной культурыTH1 клеточной культуры
cOVA 323-339-пептид EMC-микро-коллекцииИндивидуальный заказTH1 клеточная культура
CPG1668-олигонуклеотидовEurofins MWG OperonИндивидуальный заказTH1 клеточная культура
IL-2Novartis65483-116-07TH1 клеточная культура
96-луночных планшетовGreiner 655180Клеточная культура TH1
24-луночные планшетыGreiner 662160Колба для клеточных культур TH1
Greiner 660175Клеточная культура TH1
48-луночные планшетыGreiner 677 180маркировка клеток
Gammacell 1000Best Theratronicsvia запрос 
Gulmay RT225Gulmayvia inquiry 
Трипановый синийMerck MilliporeL6323in vitro оценка
Мышь ИФН-&гамма; ELISABD Biosciences558258in vitro оценка
PE Annexin V Набор для обнаружения апоптоза BD Biosciences559763in vitro оценка
Пробирка 5 млSarstedt55.476in vitro оценка
Трубки с круглым дном BD Biosciences352008in vitro оценка
Wizard γ-counterPerkin-Elmer2480-0010in vitro оценка
ELISA Reader MultiscanEXThermo Fisher Scientific51118177in vitro оценка
МикроскопLeicavia inquiry Оценка in vitro
BD LSRII BD Biosciencesvia inquiry in vitroevaluation
BALB/c мышиCharles River028in vivo торговля клетками
Алюминиевый гельServa Электрофорез12261.01in vivo торговля клетками
XylazineBayer HealthCareЗаказана via Университетская больницаin vivo торговля клетками
КетаминRatiopharmЗаказано via University hospitalin vivo торговля клетками
IsofluraneCP-PharmaЗаказана via University hospitalin vivo торговля клетками
30 G иглаBD Biosciences304000in vivo торговля клетками
ШприцBD Biosciences11612491in vivo перенос клеток
Капилляры 10 & микро; LVWR612-2439
Inveon ПЭТ сканерSiemens Healthineersбольше не доступенin vivo торговля клетками, альтернативные компании: Bruker, Mediso 
Inveon ОФЭКТ/КТ сканерSiemens Healthineersбольше не доступенin vivo трафик клеток
Inveon Research WorkplaceSiemens Healthineersанализ изображений, альтернативное программное обеспечение: Pmod
TH1

Ссылки

  1. Cerri, S., et al. Intracarotid Infusion of Mesenchymal Stem Cells in an Animal Model of Parkinson's Disease, Focusing on Cell Distribution and Neuroprotective and Behavioral Effects. Stem Cells Trans Med. 4 (9), 1073-1085 (2015).
  2. Hasenbach, K., et al. Monitoring the glioma tropism of bone marrow-derived progenitor cells by 2-photon laser scanning microscopy and positron emission tomography. Neuro Oncol. 14 (4), 471-481 (2012).
  3. Sood, V., et al. Biodistribution of 18F-FDG-Labeled Autologous Bone Marrow – Derived Stem Cells in Patients With Type 2 Diabetes Mellitus. Clin Nucl Med. 40 (9), 697-700 (2015).
  4. Perez-Diez, A., et al. CD4 cells can be more efficient at tumor rejection than CD8 cells. Blood. 109 (12), 5346-5354 (2007).
  5. Muranski, P., Restifo, N. P. Adoptive immunotherapy of cancer using CD4+ T cells. Curr. Opin. Immunol. 21 (2), 200-208 (2009).
  6. Braumuller, H., et al. T-helper-1-cell cytokines drive cancer into senescence. Nature. 494 (7437), 361-365 (2013).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
  8. Cherry, S. R. Fundamentals of Positron Emission Tomography and Applications in Preclinical Drug Development. J. Clin. Pharmacol. 41 (5), 482-491 (2001).
  9. Tavaré, R., et al. An Effective Immuno-PET Imaging Method to Monitor CD8-Dependent Responses to Immunotherapy. Cancer Res. 76 (1), 73-82 (2016).
  10. Tavaré, R., et al. Engineered antibody fragments for immuno-PET imaging of endogenous CD8+ T cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (3), 1108-1113 (2014).
  11. Dobrenkov, K., et al. Monitoring the Efficacy of Adoptively Transferred Prostate Cancer-Targeted Human T Lymphocytes with PET and Bioluminescence Imaging. J Nucl Med. 49 (7), 1162-1170 (2008).
  12. Rini, J. N., et al. PET with FDG-labeled Leukocytes versus Scintigraphy with 111In-Oxine-labeled Leukocytes for Detection of Infection. Radiology. 238 (3), 978-987 (2006).
  13. Ritchie, D., et al. In vivo tracking of macrophage activated killer cells to sites of metastatic ovarian carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 56 (2), 155-163 (2006).
  14. Adonai, N., et al. Ex vivo cell labeling with 64Cu-pyruvaldehyde-bis(N4-methylthiosemicarbazone) for imaging cell trafficking in mice with positron-emission tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (5), 3030-3035 (2002).
  15. Huang, J., Lee, C. C. I., Sutcliffe, J. L., Cherry, S. R., Tarantal, A. F. Radiolabeling Rhesus Monkey CD34+ Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells with 64Cu-Pyruvaldehyde-Bis(N4-Methylthiosemicarbazone) for MicroPET Imaging. Mol. Imaging. 7 (1), (2008).
  16. Griessinger, C. M., et al. In Vivo Tracking of Th1 Cells by PET Reveals Quantitative and Temporal Distribution and Specific Homing in Lymphatic Tissue. J Nucl Med. 55 (2), 301-307 (2014).
  17. Griessinger, C. M., et al. 64Cu antibody-targeting of the T-cell receptor and subsequent internalization enables in vivo tracking of lymphocytes by PET. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (4), 1161-1166 (2015).
  18. McCarthy, D. W., et al. Efficient production of high specific activity 64Cu using a biomedical cyclotron. Nucl. Med. Biol. 24 (1), 35-43 (1997).
  19. Kalkhof, S., Sinz, A. Chances and pitfalls of chemical cross-linking with amine-reactive N-hydroxysuccinimide esters. Anal. Bioanal. Chem. 392 (1), 305-312 (2008).
  20. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii,, J, Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765(2013).
  21. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), e52739(2015).
  22. Judenhofer, M., Wiehr, S., Kukuk, D., Fischer, K., Pichler, B. Chapter 363. Small Animal Imaging. Basics and Practical Guide. , Springer. 363-370 (2011).
  23. Phelps, M. E. PET. Molecular Imaging and Its Biological Applications. , Springer-Verlag. 93-101 (2004).
  24. Wu, A. M. Antibodies and Antimatter: The Resurgence of Immuno-PET. JNM. 50 (1), 2-5 (2009).
  25. Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. J Nucl Med. 44 (8), 1284-1292 (2003).
  26. Boswell, C. A., et al. Comparative in vivo stability of copper-64-labeled cross-bridged and conventional tetraazamacrocyclic complexes. J Med Chem. 47 (6), 1465-1474 (2004).
  27. Ghosh, S. C., et al. Comparison of DOTA and NODAGA as chelators for (64)Cu-labeled immunoconjugates. Nucl Med Biol. 42 (2), 177-183 (2015).
  28. Johnson, T. E., Birky, B. K. Health Physics and Radiological Health. , 4th ed, Lippincott Williams & Wilkins. (2011).
  29. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Meth. 2 (12), 932-940 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Антитело с меченым медью-64ПЭТ/КТ-визуализация перемещения клетокконъюгация с хелатором DOTAвыделение CD4-положительных Т-клетокпоглощение радиоактивных антителотслеживание клеток in vivoполучение ПЭТ/КТ-изображениймодель гиперчувствительности замедленного типапаттерны хоминга лимфоцитов
Мышиные лимфоцит Этикетировочное по
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.