Быстрой патрон фильтра на основе 3D-система для первичной культуры клеток простаты дифференциацию

Идентификация и использование методов лечения рака, которые являются персонифицированными для отдельных лиц являются основной целью в исследовании рака. В последнее время новые подходы были разработаны, которые позволяют большей легкостью в создании первичных клеточных культур, потенциально обеспечивая способы и определения и тестирования персонализированных терапии. Например, R-spondin основе простаты Органоид подход ¹ позволяет для трехмерных (3D) культивирование нормальных и метастатических клеток рака простаты в коммерческом внеклеточного матрикса (например, Матригель), в то время как метод Кондиционно Перепрограммирование клеток (CRC) разработанный в Джорджтауне ^{2, 3} использует более стандартных условий 2D культуры. В частности, сочетание ингибитора киназы Rho (Y-27632) и облучают J2 мышиных фидерных клеток фибробластов приводит к неопределенному культивировании кератиноцитов контрольных сумм ^2. Методология CRC являетсячрезвычайно прочный, с основными клеточные линии успешно установлены и сохраняться неопределенно долго от простаты и многих других нормальных и злокачественных эпителиальных тканей ^3. Важно отметить, что наша CRC технология позволила для быстрой идентификации этиологической основы для рецидивирующего респираторного папилломатоза у пациента, который потерпел неудачу ряд предыдущих лекарственной терапии. Кроме того, с использованием нормальных и опухолевых полученных ЗПК, успешная идентификация FDA одобрило препарат, Vorinostat, было сделано в течение двух недель после биопсии исходной ткани. Пациент был помещен на вориностат, что привело к успешному лечению заболевания ^4.

Нормальная предстательная железа состоит из люминала, базальных и редких клеток нейроэндокринных ^5. Просветными клетки образуют столбчатую эпителиальный слой железы и выражают рецептора андрогена (AR), а также другие маркеры, такие его стенке, как цитокератинам 8 и 18 и просостояние-специфического антигена (ПСА) ^6. С другой стороны , базальные клетки локализованы под слоем полостной и выразить цитокератин 5 и p63, но низкие уровни AR ^5. Мы ^{7, 8, 9} и другие ¹⁰ успешно использовали ЗПК простаты в доклинических механистических исследований чувствительности к лекарственным препаратам. Тем не менее, при выращивании в стандартных условиях 2D культуры ткани, эти клетки не в полной мере участвовать AR сигнализации ^10. Важно отметить, что при помещении под почечную капсулу иммунодефицитных мышей ЗПК восстановили нормальную простату железистой архитектуру и функции указывает, что ЗПК простаты сохраняют свою коммитирование при размещении в разрешительном среде. Разработка фильтрующего элемента на основе системы клеточной культуры , описанной здесь , позволяет быстро (2 недели) дифференциацию ин витро ОЦР простаты, о чем свидетельствует бу увеличение экспрессии генов-мишеней AR и AR, а также снижение уровня p63.

Фильтрующие вставки, используемые содержат поликарбонатные мембраны (размер пор 0,4 мкм), которые могут поддерживать культивирование клеток млекопитающих. Система, как развивается, использует нормальных и злокачественных ОЦР простаты, 6-луночные культуры и фильтрующих вставок. Среды для культивирования клеток , обусловленные клетками J2 ¹¹ помещают в нижнюю камеру и простаты дифференцирующих сред в верхней камере. Описанные здесь методы поддерживают люминальную простаты дифференцировки клеток в течение 2-х недельного срока, в соответствии с целями персонализированной медицины. Кроме того, было необходимо разработать методики, которые позволяют комплексной молекулярной, генетической и клеточной профилирования культур. Подходы для выделения ДНК, РНК и белка из клеток высвобождается с поверхности фильтра, были разработаны и обтекаемый для обработки образцов точной повтора. FinaLLY, методология, необходимые для удаления фильтра, чтобы включить вложение, секционирования и для H & E, иммуногистохимических и иммунофлуоресцентного окрашивания, полностью описан.

1. Создание 3D клеточных культур Вставка системы

1. Поместите 2 поликарбонатные вставки клеточной культуры в перевернутой ориентации (боковой фильтр вверх) вниз в 6 - луночный планшет (рисунок 1А).
2. Нанесите тонкий слой 0,1% желатина в воде, чтобы в нижней части вставки и дать высохнуть (10-20 мин) в кабинете биологической безопасности для поддержания стерильности.
3. Повторите шаг 1,2 еще два раза в общей сложности 3 приложений 0,1% желатина на вставках.
   Примечание: Желатин покрытие поможет ограничить диффузию между камерами.
4. Для сбора первичной ЗПК от стандартных условий культивирования, добавляют 5 мл PBS мыть колбу культуры.
   1. Trypsinize клеток с использованием (1 мл для Т-25 и 2 мл в течение Т-75) 0,25% трипсин-ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° С. Аккуратно нажмите на сторону колбы, чтобы помочь в выбивании клеток. Затем приступают, чтобы остановить реакцию трипсина и собирают клетки путем добавления 5 мл полной среды DMEM.
   2. собирать клетки в трубке 15 мл. Центрифуга трубки при температуре 4 ° С и 188 мкг и рассчитывать с использованием автоматического счетчика клеток или гемоцитометра.
   3. Повторное приостановить 600000 ЗПК в 250 мкл кондиционированной среды (СМ) и добавить к правильной ориентации (боковой фильтр вниз) культуры вставки (рис 1B). Это называется внутренней камеры.
      Примечание: CM является F-носитель облученными обусловленные J2 клеток и содержит мкм Y-27632 10 , как было описано ранее ^{7, 8, 9, 11.}
5. Нанести 2 мл CM к внешней камере 6-луночного планшета и инкубировать при 37 ° С в течение ночи (в течение, по крайней мере 18 ч).
6. Осторожно удалите КМ на внутренней камере с 1 мл или 200 мкл пипетки и медленно добавляют дифференцировки (DM) во внутреннюю камеру с 1 мл пипеткой до полного. Будьте осторожны, чтобы не нарушить слой клеток.

1. Проверьте культур ежедневно. Здоровые клетки появляются , как показано на рисунке 2.
2. Изменение КМ во внешней камере каждый день или через день, в зависимости от метаболизма клеток.
3. Когда носитель внутреннего меняет свой цвет камеры (желтый), осторожно удалите носитель на внутренней камере фильтра с 1 мл или 200 мкл пипетки.
4. Аспирируйте СМИ в луночного планшета камеры наружный 6 с наконечником аспирационного.
5. С помощью 1 мл пипетку, медленно применять свежий DM во внутреннюю камеру до полного. Будьте осторожны, чтобы не поцарапать или иным образом сместить слой клеток.
6. Замените носитель во внешней камере с 2 мл свежей КМ.
7. Поддерживать культуру в течение 2-х недель, а затем приступить к обработке для желаемого бимолекулярного изоляции.
   Примечание: Каждая строка в 6 - луночного планшета, в общей сложности шесть вставок (рис 1В), должны быть обработаны на эксперимент , чтобы получить достаточное количество клеток для DNА, РНК или белка для анализа.
8. Аспирируйте СМИ в наружной камере и ополоснуть 2 мл фосфатным буферным раствором (PBS).
9. Осторожно удалите носители из внутренней камеры с 1 мл или 200 мкл пипетки и добавить 500 мкл PBS. Избегать соскабливания или иным образом нарушая клетки на мембране.
10. Отберите PBS от внешней камеры и осторожно удалите PBS из внутренней камеры с 1 мл или 200 мкл пипетки. После того, как PBS был удален, перейдем непосредственно к соответствующему приложению подробно описано ниже. Не позволяйте мембране высохнуть. Культура может быть кратко в PBS, пока приложение не будет готово начать.

3. Обработка Фильтры для окомкования Banking

1. Добавьте 100 мкл 0,25% трипсин-ЭДТА в каждой внутренней камере и инкубируют в течение 5 мин при 37 ° С.
2. Кратко и тщательно перемешивать / скрести клеток на поверхности мембраны с 200 мкл пипеткой в ​​то время как пипетированием вверх и вниз (во избежание puncТьюринга мембрану). Инкубировать в течение 1 мин при 37 ° С.
3. Добавить 250 мкл КМ к первой внутренней камеры и пипеткой вверх и вниз, осторожно, чтобы промыть фильтр.
4. Передача ресуспендировали клетки в соседней камере фильтра, который содержит те же условия, СМИ и повторить пипетированием вверх и вниз.
5. Повторите эту процедуру для каждой из вставок одного состояния. Сбор и передача клеток в 1,5 мл центрифужную пробирку.
6. Промойте каждую внутреннюю камеру с дополнительным 100-200 мкл КМ, чтобы собрать оставшиеся клетки. Добавить в 1,5 мл центрифужную пробирку на шаге 3.5.
7. Спин клетки при 423 х г в микроцентрифуге при 4 ° С в течение 5 мин.
8. Аспирируйте супернатант и мыть осадок клеток один раз с 1000 мкл PBS.
9. снова отжим на 423 XG в микроцентрифуге при 4 ° С в течение 5 мин.
10. Отберите PBS и замораживают при -80 ° С для последующего использования.

4. Обработка Фильтры для РНК или ДНК Изоляция

Система на основе клеточной культуры вставки является относительно простой и быстрой процедуры получения 3D культур контрольных сумм простаты, которые поддерживает люминальную дифференцировки клеток. Схематическое изображение системы показана (Фигура 1А) , подчеркивающие применение желатина покрытия к нижней поверхности фильтрующего элемента. Вставки переворачивают только для применения желатина. На фигуре 1В фильтры в соответствующей ориентации с последующим культивированием. Используя прозрачную вставку ячейки, представитель образ здорового 3D культуры CRC простаты показан (10X) (Рисунок 2). Плотный наслоение здоровых ОЦР продемонстрировал типично после установления и могут быть визуализированы с использованием стандартной световой микроскопии. Во время первоначального создания, очень важно, чтобы визуализировать слой клеток, образованных для обеспечения того, чтобы этот метод совместим с данной клеточной линии, и что соответствующее приспособление и ЛаЙеринг клеток произошли.

АЭМ применяется к внутренней части пластины, как описано выше. После нанесения АЭМ, необходимо соблюдать осторожность , когда забил фильтр , чтобы удалить его из вставки (фиг 3А, 3В). На всех этапах (Фигуры 3A-3D), уход также должны соблюдать осторожность , чтобы свести к минимуму нежелательное движение НЕА слоя на фильтре с клетками. Слой CRC может быть легко нарушена и повреждены во время перевода в H & E кассеты (Рисунок 3D). После удаления фильтра АЭМ покрытием из пластиковой бочке (Фигуры 3А-3C), фильтр может быть в два раза , и обработаны для секционирования и окрашивания с использованием стандартного вложения кассеты (рис 3D). Расщепление фильтр пополам важно максимально доступную поверхность для поперечного секционирования на H & E и IF.

иммунофлуоресцентного окрашиваниеа также светлого поля (BF) были собраны образы клеток, культивируемых на слое фильтра с помощью микроскопа с ДСУ (Disk Unit Scan) вращающийся диск конфокальной возможностей. Представитель результаты гистологии и H & E окрашивания показаны в поперечном сечении вставки и ячеек фильтра (20X) (рисунок 4). При надлежащем уходе, мы показали, что слой CRC на фильтрующих вставок могут быть разрезали и окрашивали, как это стандартная практика для гистологического исследования тканей. Во время секционирования, возможно для ЗПК отделяться от фильтра в качестве неповрежденного слоя клеток , как показано (рисунок 4). БФ изображение показывает многослойную слои клеток на верхней части пористой мембраны (рис 5А). Отдельные флуоресцентные изображения для ядер (DAPI, Фиг.5В), p63 (рис 5в) и АР (рис 5D) показаны, как это имеет место слияние всех трех маркеров флуоресценции (рис 5д). Наконец, композитнаяе BF и IF Покрышка показано (рис 5F), установление локализации сигнала флуоресценции по отношению к клеткам , и фильтр. Наложение DAPI пятно с p63 IF окрашивание ясно демонстрирует некоторые клетки еще в пролиферативной состоянии. Локализация AR IF окрашивания в ядре является показателем функционального реактивации AR в клетках предстательной железы.

Сравнение между IF нашей системы фильтра вставки и секционного ткани простаты показано (рис 6а, 6б) , чтобы продемонстрировать сходство в развитии нашей CRC вставки слоя к этому эпителия простаты. Канал простаты показывает экспрессию р63, в соответствии с базальных клеток простаты. p63 окрашивания также рассматривается в ОЦР на вставке. Более высокий процент клеток, экспрессирующих P63 наблюдалась в нашей вставке по сравнению с секции неповрежденной ткани. Кроме того, как ядерную и цитоплазматическую AR наблюдаются в тис простаты подать в суд на раздел и в то время как ЗПК на фильтре вставки показывают меньше всего выражения AR, как AR экспрессии ядерного и цитоплазматического окрашивания видно, похожий на неповрежденную простаты.

Рисунок 1: Типичные изображения 6-а блюдо культуры и вставки, входящие в состав 3D - системе культуры. (A) Инвертированный вставки для нанесения покрытия на желатиновой нижней стороне фильтра (стрелка). Большее изображение вставки и фильтра-шоу (вставка). (B) должным образом размещены вставки. Внутренние и наружные камеры системы показаны (стрелки). Коробочная строка B показывает, как несколько образцов получены для данного условия эксперимента. По завершении периода роста 2 недели эти вставки могут быть объединены, чтобы получить достаточное количество материала для анализа."Целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Представитель изображения слоя здорового CRCS высевают на прозрачную мембранный фильтр показан. Обе внутренние и наружные камеры содержали кондиционированной среды. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Представитель Изображение фильтра Половинки на две части и помещали в кассету Парафин для встраивания. (A) Фильтр вставки с УВО покрытия после озвучивания и перед снятием. (В) Освобожденный вкладыш фильтра из бочки из поликарбоната. ( (D) Правильное размещение и ориентация двух половин внутри вложения кассеты. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Представитель H & E Витраж Поперечное сечение патрон фильтра и клетки (20X). И мембрана (нижний) и слой клеток (вверху) показаны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Серия представителя светлого поля (BF) и иммунофлюоресценции (ИФ) ИзображенияКлетки секционного на фильтре (40X). Разрезы фильтра и клетки показаны. Неокрашенными Б.Ф. изображение клеток на поверхности фильтра (5А) сопровождается изображениями для окрашенного ядра DAPI (5б) и специфического окрашивания для двух различных белков, р63 (5С) и рецептора андрогена (AR, 5D). Составной оверлей из секций клеток (5E, F) определяет локализацию сигналов ПЧ в контексте клеток и фильтра. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6: Представитель Иммунофлуоресценции (IF) Изображение клеток секционного на фильтре против секции простаты Эпителий из ткани (20Х).Поперечное изображение в разрезе нашего фильтрующего элемента показан (6А) по сравнению с протоковой эпителиальных слоев интактной предстательной железы (Фиг.6В). Окрашивание p63, AR и ядро проводили , как на рисунке 5. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Авторы не имеют ничего раскрывать.