Быстрой патрон фильтра на основе 3D-система для первичной культуры клеток простаты дифференциацию

Краткое содержание

Здесь мы представляем метод создания быстрой системы in vitro, которая поддерживает трехмерное культивирование и последующую световую дифференцировку первичных эпителиальных клеток предстательной железы.

Аннотация

Перепрограммировать клетки условно (ЗПК) обеспечивают устойчивый метод для первичной культуры клеток и способности развивать обширные «живой» биобанках пациента клеточных линиях. Для многих типов эпителиальных клеток, различные трехмерные подходы (3D) культуры было описано, что поддерживают улучшенное дифференцированное состояние. В то время как вычисление контрольной суммы сохраняют свою коммитирование к ткани, из которой они изолированы, они не выражают многие из маркеров дифференцировки, ассоциированных с тканью происхождения при выращивании в нормальных условиях двух двухмерных (2D) культуры. Для повышения применение ОЦР пациента, полученных для исследования рака простаты, 3D-формат культура была определена, что позволяет быстро (за 2 недели всего) люминальную дифференцировки клеток в нормальных и опухолевых полученных эпителиальных клеток простаты. При этом фильтрующий элемент на основе формата описан для культивирования и дифференцировки нормальных и злокачественных ОЦР простаты. дехвостатые описание процедур, необходимых для сбора клеток и обработки для иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного окрашивания предоставляются. Коллективно формат культура 3D описано в сочетании с первичными линиями CRC, обеспечивает важные средне- и высоко- пропускную способность системы для модели biospecimen на основе исследования простаты.

Введение

Идентификация и использование методов лечения рака, которые являются персонифицированными для отдельных лиц являются основной целью в исследовании рака. В последнее время новые подходы были разработаны, которые позволяют большей легкостью в создании первичных клеточных культур, потенциально обеспечивая способы и определения и тестирования персонализированных терапии. Например, R-spondin основе простаты Органоид подход ¹ позволяет для трехмерных (3D) культивирование нормальных и метастатических клеток рака простаты в коммерческом внеклеточного матрикса (например, Матригель), в то время как метод Кондиционно Перепрограммирование клеток (CRC) разработанный в Джорджтауне ^{2, 3} использует более стандартных условий 2D культуры. В частности, сочетание ингибитора киназы Rho (Y-27632) и облучают J2 мышиных фидерных клеток фибробластов приводит к неопределенному культивировании кератиноцитов контрольных сумм ^2. Методология CRC являетсячрезвычайно прочный, с основными клеточные линии успешно установлены и сохраняться неопределенно долго от простаты и многих других нормальных и злокачественных эпителиальных тканей ^3. Важно отметить, что наша CRC технология позволила для быстрой идентификации этиологической основы для рецидивирующего респираторного папилломатоза у пациента, который потерпел неудачу ряд предыдущих лекарственной терапии. Кроме того, с использованием нормальных и опухолевых полученных ЗПК, успешная идентификация FDA одобрило препарат, Vorinostat, было сделано в течение двух недель после биопсии исходной ткани. Пациент был помещен на вориностат, что привело к успешному лечению заболевания ^4.

Нормальная предстательная железа состоит из люминала, базальных и редких клеток нейроэндокринных ^5. Просветными клетки образуют столбчатую эпителиальный слой железы и выражают рецептора андрогена (AR), а также другие маркеры, такие его стенке, как цитокератинам 8 и 18 и просостояние-специфического антигена (ПСА) ^6. С другой стороны , базальные клетки локализованы под слоем полостной и выразить цитокератин 5 и p63, но низкие уровни AR ^5. Мы ^{7, 8, 9} и другие ¹⁰ успешно использовали ЗПК простаты в доклинических механистических исследований чувствительности к лекарственным препаратам. Тем не менее, при выращивании в стандартных условиях 2D культуры ткани, эти клетки не в полной мере участвовать AR сигнализации ^10. Важно отметить, что при помещении под почечную капсулу иммунодефицитных мышей ЗПК восстановили нормальную простату железистой архитектуру и функции указывает, что ЗПК простаты сохраняют свою коммитирование при размещении в разрешительном среде. Разработка фильтрующего элемента на основе системы клеточной культуры , описанной здесь , позволяет быстро (2 недели) дифференциацию ин витро ОЦР простаты, о чем свидетельствует бу увеличение экспрессии генов-мишеней AR и AR, а также снижение уровня p63.

Фильтрующие вставки, используемые содержат поликарбонатные мембраны (размер пор 0,4 мкм), которые могут поддерживать культивирование клеток млекопитающих. Система, как развивается, использует нормальных и злокачественных ОЦР простаты, 6-луночные культуры и фильтрующих вставок. Среды для культивирования клеток , обусловленные клетками J2 ¹¹ помещают в нижнюю камеру и простаты дифференцирующих сред в верхней камере. Описанные здесь методы поддерживают люминальную простаты дифференцировки клеток в течение 2-х недельного срока, в соответствии с целями персонализированной медицины. Кроме того, было необходимо разработать методики, которые позволяют комплексной молекулярной, генетической и клеточной профилирования культур. Подходы для выделения ДНК, РНК и белка из клеток высвобождается с поверхности фильтра, были разработаны и обтекаемый для обработки образцов точной повтора. FinaLLY, методология, необходимые для удаления фильтра, чтобы включить вложение, секционирования и для H & E, иммуногистохимических и иммунофлуоресцентного окрашивания, полностью описан.

Протокол

1. Создание 3D клеточных культур Вставка системы

1. Поместите 2 поликарбонатные вставки клеточной культуры в перевернутой ориентации (боковой фильтр вверх) вниз в 6 - луночный планшет (рисунок 1А).
2. Нанесите тонкий слой 0,1% желатина в воде, чтобы в нижней части вставки и дать высохнуть (10-20 мин) в кабинете биологической безопасности для поддержания стерильности.
3. Повторите шаг 1,2 еще два раза в общей сложности 3 приложений 0,1% желатина на вставках.
   Примечание: Желатин покрытие поможет ограничить диффузию между камерами.
4. Для сбора первичной ЗПК от стандартных условий культивирования, добавляют 5 мл PBS мыть колбу культуры.
   1. Trypsinize клеток с использованием (1 мл для Т-25 и 2 мл в течение Т-75) 0,25% трипсин-ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° С. Аккуратно нажмите на сторону колбы, чтобы помочь в выбивании клеток. Затем приступают, чтобы остановить реакцию трипсина и собирают клетки путем добавления 5 мл полной среды DMEM.
   2. собирать клетки в трубке 15 мл. Центрифуга трубки при температуре 4 ° С и 188 мкг и рассчитывать с использованием автоматического счетчика клеток или гемоцитометра.
   3. Повторное приостановить 600000 ЗПК в 250 мкл кондиционированной среды (СМ) и добавить к правильной ориентации (боковой фильтр вниз) культуры вставки (рис 1B). Это называется внутренней камеры.
      Примечание: CM является F-носитель облученными обусловленные J2 клеток и содержит мкм Y-27632 10 , как было описано ранее ^{7, 8, 9, 11.}
5. Нанести 2 мл CM к внешней камере 6-луночного планшета и инкубировать при 37 ° С в течение ночи (в течение, по крайней мере 18 ч).
6. Осторожно удалите КМ на внутренней камере с 1 мл или 200 мкл пипетки и медленно добавляют дифференцировки (DM) во внутреннюю камеру с 1 мл пипеткой до полного. Будьте осторожны, чтобы не нарушить слой клеток.

ле "> 2. Поддержание 3D культур

1. Проверьте культур ежедневно. Здоровые клетки появляются , как показано на рисунке 2.
2. Изменение КМ во внешней камере каждый день или через день, в зависимости от метаболизма клеток.
3. Когда носитель внутреннего меняет свой цвет камеры (желтый), осторожно удалите носитель на внутренней камере фильтра с 1 мл или 200 мкл пипетки.
4. Аспирируйте СМИ в луночного планшета камеры наружный 6 с наконечником аспирационного.
5. С помощью 1 мл пипетку, медленно применять свежий DM во внутреннюю камеру до полного. Будьте осторожны, чтобы не поцарапать или иным образом сместить слой клеток.
6. Замените носитель во внешней камере с 2 мл свежей КМ.
7. Поддерживать культуру в течение 2-х недель, а затем приступить к обработке для желаемого бимолекулярного изоляции.
   Примечание: Каждая строка в 6 - луночного планшета, в общей сложности шесть вставок (рис 1В), должны быть обработаны на эксперимент , чтобы получить достаточное количество клеток для DNА, РНК или белка для анализа.
8. Аспирируйте СМИ в наружной камере и ополоснуть 2 мл фосфатным буферным раствором (PBS).
9. Осторожно удалите носители из внутренней камеры с 1 мл или 200 мкл пипетки и добавить 500 мкл PBS. Избегать соскабливания или иным образом нарушая клетки на мембране.
10. Отберите PBS от внешней камеры и осторожно удалите PBS из внутренней камеры с 1 мл или 200 мкл пипетки. После того, как PBS был удален, перейдем непосредственно к соответствующему приложению подробно описано ниже. Не позволяйте мембране высохнуть. Культура может быть кратко в PBS, пока приложение не будет готово начать.

3. Обработка Фильтры для окомкования Banking

1. Добавьте 100 мкл 0,25% трипсин-ЭДТА в каждой внутренней камере и инкубируют в течение 5 мин при 37 ° С.
2. Кратко и тщательно перемешивать / скрести клеток на поверхности мембраны с 200 мкл пипеткой в ​​то время как пипетированием вверх и вниз (во избежание puncТьюринга мембрану). Инкубировать в течение 1 мин при 37 ° С.
3. Добавить 250 мкл КМ к первой внутренней камеры и пипеткой вверх и вниз, осторожно, чтобы промыть фильтр.
4. Передача ресуспендировали клетки в соседней камере фильтра, который содержит те же условия, СМИ и повторить пипетированием вверх и вниз.
5. Повторите эту процедуру для каждой из вставок одного состояния. Сбор и передача клеток в 1,5 мл центрифужную пробирку.
6. Промойте каждую внутреннюю камеру с дополнительным 100-200 мкл КМ, чтобы собрать оставшиеся клетки. Добавить в 1,5 мл центрифужную пробирку на шаге 3.5.
7. Спин клетки при 423 х г в микроцентрифуге при 4 ° С в течение 5 мин.
8. Аспирируйте супернатант и мыть осадок клеток один раз с 1000 мкл PBS.
9. снова отжим на 423 XG в микроцентрифуге при 4 ° С в течение 5 мин.
10. Отберите PBS и замораживают при -80 ° С для последующего использования.

4. Обработка Фильтры для РНК или ДНК Изоляция

1. Добавить 200 мкл гуанидин тиоцианат-фенол-хлороформ или подобным реагентом экстракции во внутреннюю камеру, и кратко перемешивать клетки на поверхности мембраны с помощью пипетки вверх и вниз.
2. Выдержите в экстрагирующего реагента в течение 5 мин при комнатной температуре с внешней камере сухой.
   1. В качестве фильтра может диссоциировать от вставки, моют диссоциированного мембрану фильтра с помощью пипетки экстракционного раствора вверх и вниз. Собрать как можно больше реагента экстракции, как это возможно за счет наклона 6-луночного планшета и аспирационного любой остаточной жидкости.
3. Следуйте протоколу производителя для очистки и выделения ДНК, РНК или белка.

5. Обработка Фильтры для белка Изоляция

1. Поместите вставку фильтра в 6-луночного планшета на льду. Для внутренней камеры, добавьте 10 мкл буфера для лизиса белка с добавлением 1 мМ фторида натрия (NaF), 1 мМ ванадата натрия (СЧА), 100 мМ dithiothreitol (DTT), и 100 мкл анти-протеаз.
2. Перемешайте / скрести клеток на поверхности мембраны с 20 мкл пипеткой в ​​то время как пипетированием вверх и вниз. Избегайте образования пузырьков в буфере для лизиса.
3. Выдержите 6-луночный планшет с фильтром вставками на льду в течение 10 мин.
4. Повторите выскабливание, а затем промыть поверхность мембраны с буфером для лизиса.
5. Соберите лизатов от 6 вставок и переносят в 1,5 мл центрифужную пробирку на льду.
6. Ополосните первую мембрану с дополнительными 10 мкл буфера для лизиса и передачи к следующему фильтру.
7. Повторите шаг 5.6 для всех вставок, собирая любого остаточного раствора буфера для лизиса и добавляют к 1,5 мл трубки (этап 5.5).
8. Инкубируйте образца на льду в течение еще 5 мин.
9. Отжим на максимальной скорости (16873 Xg в центрифуге таблицу) в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
10. Пипетка лизата супернатант в свежую 1,5 мл трубки.
11. Перейдем к анализу концентрации белка или STOповторно лизатов при -80 ° С.

6. Обработка для H & E и Иммуно-окрашивания

1. Добавить 500 мкл и 1 мл 10% -ного НСБ (нейтральный забуференный формалин) с внутренней и внешней камеры и пусть инкубировать в течение ночи при температуре 4 ° С.
2. Аспирируйте НСБ из внешней камеры и добавьте 1 мл гидроксиэтилкарбоксиметилцеллюлозу агарозы (ВЭП) обработка геля в 1,5 мл центрифуге. Медленно расплавления агарозы в микроволновой печи с использованием малой мощности и повторяется 10-20 секунд импульсы пока агароза не расплавится.
3. Держите HEA в теплой ванне 37 ° C, чтобы предотвратить затвердевание, пока готов к использованию.
4. Удалить НСБ из внутренней камеры и применить 25 мкл расплавленного АЭМ во внутреннюю камеру и позволить агарозы, чтобы затвердеть в течение 2-5 мин.
5. Влажные 2 пены гистологии прокладки в 10% НСБ и поместите одну площадку в вложению кассету (см рисунок 3D).
6. Используйте лезвие скальпеля на # 11 (который имеет очень острый, тонко заостренным лезвием) забивать фильтр с нижней стороны вставкикамера, частично выпуская его из пластиковой вставки камеры.
7. Поместите небольшое количество (100-200 мкл) NBF в чашке Петри и погружают частично выбиты фильтр в НСБ (фиг.3А).
8. С помощью лезвия скальпель # 10, осторожно прижиматься к середине фильтра, с внутренней стороны вставки камеры, чтобы полностью выбивать фильтр из вставки ствола (рис 3б). Если есть какая-либо часть фильтра, которая все еще прикреплен к цилиндру, разъединить его с скальпелем.
9. Вырезать фильтр АЭМ с покрытием пополам с # 10 лезвий скальпеля (рис 3C).
10. Поместите каждую половину фильтра на поролоновую подкладку в гистологии кассете , полученного на стадии 6.4 (рисунок 3D).
11. Добавьте второй 10% НСБ смоченную губку к кассете, прослаивая фильтр.
12. Привязать уплотнение кассеты, место в НСБ и инкубировать в течение ночи.
13. Технологические фильтры в парафиновые блоки для секционирования и окрашивания, какбыло описано ранее ^12.

Результаты

Система на основе клеточной культуры вставки является относительно простой и быстрой процедуры получения 3D культур контрольных сумм простаты, которые поддерживает люминальную дифференцировки клеток. Схематическое изображение системы показана (Фигура 1А) , подчеркивающие применение желатина покрытия к нижней поверхности фильтрующего элемента. Вставки переворачивают только для применения желатина. На фигуре 1В фильтры в соответствующей ориентации с послед...

Обсуждение

Первичные клеточные линии являются важной и быстро развивающейся платформой для исследований рака. Культура вставки на основе 3D-система культуры поддерживает дифференциацию первичных ОЦР простаты в течение двух недель сроки. Метод фильтра CRC представляет собой новый метод, средний пропускная способность для исследования простаты. Существующие модели мыши PDX имеют много времени и очень дорого, и многие из образцов PDX не могут быть выращены в культуре, что ограничивает исследователя инициированное экспериментирование ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Corning Costar Snapwell Culture Inserts	Corning	3801
Millicell Cell Culture Вставки	Millipore	PIHP01250
Multiwell 6 Well	Falcon	353046
желатин 0,1% в воде	Stemcell Technologies	7903
Sterile Saftey Scapel 10 Blade	Integra Miltex	4-510
Стерильный стандартный скальпель 11 лезвий	Integra Miltex	4411
RIPA Буфер для лизиса и экстракции	Thermofisher Scientific	89900
Фторид натрия	Fishcer Scientific	S299-100
Ванадат натрия	Fishcer Scientific	13721-39-6
Дитиотреитол	Sigma-Aldrich	3483123
Коктейль ингибиторов протеазы (AEBSF, апротинин, бестатин, Е-64, лейпептин и пепстатин А)	Sigma-Aldrich	P8340
0,25% трипсин-ЭДТА (1x)	Thermofisher Scientific	25200-056
DMEM	Thermofisher Scientific	11965-092
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Glutamine	Thermofisher Scientific	25030081& НБСП;
Пенициллин стрептомицин	Thermofisher Scientific	15140-122
F-12 Питательная смесь Среда	Thermofisher Scientific	11765054
Y-27632 дигидрохлорид Ингибитор горных пород	Enzo	ALX-270-333-M025
Гидрокортизон	Sigma-Aldrich	H0888
EGF	Thermofisher Scientific	PHG0315
Инсулин	Thermofisher Scientific	12585-014
Холерный токсин	Sigma-Aldrich	C3012
Гентамицин	Thermofisher Scientific	15710-064
Фунгизон	Fisher Scientific	BP264550
Тризол Реагент	Инвитроген	15596026
Гистогель Гель для обработки образцов ( гидроксиэтилагароза (HEA))	Thermo Scientific	HG-4000-012
Неадгезивная повязка	Telfa	KDL2132Z
для клеточных культур	Sigma	SIAL0167
HISTOSETTE II Тканевая обработка / встраивание кассет	Crystalgen	CG-M492