Методическая статья

Выделение и Обогащение печени подмножествах идентифицированных-предшественников маркером Комбинация Novel поверхности

10.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55284

⸱

18 февраля 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine II, Saarland University Medical Center, 2Department of Physiology, Center for Integrative Physiology and Molecular Medicine (CIPMM), University of Saarland

В этой статье

Краткое содержание

травмы печени сопровождаются расширением клеток-предшественников, что представляет собой гетерогенную популяцию клеток. Новые классификация этого клеточный компартмент позволяет различении нескольких подмножеств. Описанный здесь метод иллюстрирует поток цитометрии и высокой чистоты изоляции различных подмножеств, которые могут быть использованы для дальнейшего анализа.

Аннотация

Во время хронических повреждений печени, клетки-предшественники расширяться в процессе, называемом протоками, реакция, которая также влечет за собой возникновение воспалительного клеточного инфильтрата и активации эпителиальных клеток. Популяция клеток-предшественников во время таких воспалительных реакций в основном были исследованы с использованием одиночных поверхностных маркеров, либо с помощью гистологического анализа или с помощью проточной цитометрии методов на основе. Тем не менее, новые поверхностные маркеры идентифицировали различные функционально различных подмножеств в пределах прародителя клеток печени отделение / стволовых. Изложенный здесь метод описывает выделение и детальный анализ проточной цитометрии подмножеств предшественников с использованием комбинаций маркеров романа поверхности. Кроме того, он показывает, как различные прогениторных клеток подмножества могут быть выделены с помощью методов высокой чистоты с использованием автоматизированной магнитной и FACS сортировки на основе. Важно отметить, что новые и упрощенную ферментативная диссоциация печени позволяет изоляции этих популяций редких клеток с высокой жизнеспособностьючто превосходит по сравнению с другими существующими методами. Это особенно актуально для дальнейшего изучения клеток - предшественников в пробирке или для изоляции высокого качества РНК для анализа профиля экспрессии генов.

Введение

регенерации печени чаще всего ассоциируется с самообновлению мощностью гепатоцитов. Тем не менее, хронические повреждения печени возникают при активации клеток - предшественников и расширения, которые были связаны с их способностью дифференцироваться в гепатоциты и холангиоцитах 1, 2, 3, 4. Это особенно актуально, так как, во время хронических травм, пролиферации гепатоцитов не является эффективным. Несмотря на многочисленные исследования генетической трассировки , ориентированных на клетки - предшественники, их роль в регенерации печени остается спорным 5, 6, 7, 8. Кроме того, активация клеток - предшественников , было связано с увеличением фиброзной реакции в печени, что вызывает вопросы об их точной роли во время травмы 9, 10.

Гетерогенный характер клеток - предшественников купе уже давно было предложено экспрессии генов исследований, изолированных клеток - предшественников , выражающие одну поверхностный маркер с помощью микродиссекции или клетки методов сортировки на основе 1, 11. Действительно, в последнее время , новая комбинация маркер поверхности с помощью gp38 (podoplanin) однозначно связаны предыдущие одиночные маркеры клеток - предшественников различных подмножеств 12. Важно отметить, что эти подмножества не только отличались по экспрессии поверхностных маркеров , но также демонстрируют функциональные изменения во время травм 12.

Несколько моделей на животных были использованы для исследования активации клеток-предшественников и регенерации печени. Кажется , что различные виды травм способствуют активации отличаясь подмножеств клеток - предшественников 12. Это могло бы объяснить фотenotypic дивергенция протоками реакции , наблюдаемой у человека 4. Таким образом, сложные фенотипические и функциональный анализ клеток-предшественников являются ключевыми для понимания их роли в травмах и истинное значение протоками реакции при заболеваниях печени.

Кроме комбинаций поверхностных маркеров, решающие различия в протоколах выделения клеток еще больше осложнить выводы , основанные на предыдущих исследованиях 2. Значительное количество исследований было посвящено роли клеток - предшественников , которые значительно различаются по их протоколу изоляции (например, диссоциации печени (комбинацией ферментов и длительность процесса), средней плотности и скорости центрифугирования) 2. Оптимизированный метод выделения, обеспечивая лучшую жизнеспособность популяций редких клеток и отражает подмножество состава, была разработана и опубликована недавно 12. Цель данной статьи состоит в том, чтобы обеспечить более йеболело протокол этой процедуры выделения клеток печени и анализа подмножества для обеспечения надлежащего воспроизведения техники. Кроме того, протокол включает в себя сравнение с предыдущим методом изоляции, чтобы продемонстрировать различия по сравнению с новым протоколом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все экспериментальные процедуры были проведены с одобрения комитетов по этике и по уходу за животными в Хомбург University Medical Center.

1. Подготовка материалов и буферами

  1. Свеже подготовить все буферы, необходимые для переваривания печени с использованием стерильных компонентов и ламинарный капюшон, чтобы избежать бактериального загрязнения.
  2. Приготовьте сбор буфера (CB) путем смешивания 49,5 мл RPMI среды и 0,5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS; низкая эндотоксин, инактивированной нагреванием) для достижения раствора 1% (об / об). Хранить раствор на льду до дальнейшего использования.
    Примечание: Приблизительно 25 мл CB необходимо переварить одну целую печень.
  3. Готовят переваривании буфера (DB) с использованием следующих ингредиентов: RPMI среду, 1% (об / об) FBS (низкий эндотоксин, инактивированной нагреванием), коллагеназы P (0,2 мг / мл), ДНКазы I (0,1 мг / мл) и диспаза (0,8 мг / мл).
    Примечание: Примерно 25 мл БД необходимо усвоить одну целую печень. Предварительно нагрейте DB в тон 37 ° C на водяной бане перед использованием.
  4. Развести ферменты по прибытии в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS; collagense P и диспаза) или в ДНКазы I - буфера (50% (об / об) глицерина, 1 мМ MgCl 2, и 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5) , аликвоту его и хранить его при температуре -20 ° C. Хранить ДНКазы I буфер при температуре 4 ° С и использовать его в течение двух месяцев.

2. Подготовка печени одноклеточные Подвеска

  1. Эвтаназии необработанных мышей дикого типа путем цервикальной дислокации в соответствии с местными комитетов по этике и по уходу за животными.
  2. Поместите мышей на рассечение борту и влажный мех с 70% этанола. С помощью ножниц, откройте живот с срединный разрез кожи, а затем с помощью Y-разрез в направлении конечностей. Откройте брюшины до грудины с помощью ножниц. Для того, чтобы раскрыть печень, вытесняют кишечник мягко с правой стороны с помощью ватного тампона.
  3. С помощью ножниц и щипцов, удалить мочки печени,оставляя позади желчного пузыря, а также во избежание загрязнения соединительной тканью. Взвесьте печень и поместить его на льду в чашке Петри, содержащей HBSS.
  4. Поместите печень на мочки сухой чашке Петри и разрезают ткани печени на однородные кубики размером примерно 2 мм полутуши с помощью скальпеля. Передача части в 15-мл коническую центрифужную пробирку.
  5. Добавить 2,5 мл БД в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую кусочки печени и поместить его в водяной бане при 37 ° C, чтобы начать процесс пищеварения (здоровая печень занимает 60-70 мин и цирроза печени занимает 80-90 мин ).
    Примечание: Если одна целая печень переваривается, печень должна быть разделена на две 15-мл коническую центрифужные пробирки, чтобы обеспечить хорошую жизнеспособность клеток.
  6. Подготовьте новый 15-мл коническую центрифужную пробирку для сбора высвобожденные клетки печени. Поместите полиамид 100 мкм сетчатый фильтр на верхней части трубки и смачивать сетку с 800 мкл СВ. Поместите коническую центрифужную пробирку на льду.
  7. Смешайте СэмуПлес в водяной бане 37 ° C после 5 и 10 мин для того, чтобы поддержать процесс пищеварения путем встряхивания 15 мл коническую центрифужную пробирку, содержащую кусочки печени.
  8. Через 15 мин после начала переваривания, осторожно перемешать кусочки печени с помощью пипетки 1000 мкл, с наконечником, который позволяет вырезать кусочки печени пройти легко. Поместите трубки обратно в ванну с водой и позволяют куски урегулировать в течение 2 мин.
  9. Удалить супернатант, содержащий распространяемой клетки (как правило, 2x 700 мкл) и добавить его к трубе, полученного на стадии 2.6. Заменить удаленный супернатанта с БД (2x 700 мкл) и поместить его обратно в водяную баню на 37 ° C.
  10. Повторите процедуру, описанную в пункте 2.8 (как правило, на 30, 40, 50, 55 и 60 мин) до примерно 60-70 мин прошло с момента начала пищеварения. С 40 мин и далее, остальные кусочки печени должны быть достаточно малы, чтобы пройти через неподрезанные 1000 мкл кончика пипетки.
    Примечание: Здоровая печень DigeSTED полностью в течение 60-70 мин, в то время как фиброзная печени обычно требуется 80-90 мин. К этому моменту времени, ткани печени, не должна быть видна в коническую 15-мл центрифужную пробирку, содержащую кусочки печени, и все высвобожденные клетки должны быть переданы в трубку, полученного на стадии 2.6.
  11. В конце процесса пищеварения, сбора клеток и их центрифугировать в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (с использованием уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2).
  12. Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл-аммоний хлорид-калия (ACK) буфера для лизиса и инкубируйте в течение 1 мин при комнатной температуре, чтобы лизировать красные кровяные клетки. Остановить реакцию добавлением 5 мл CB, а затем центрифугировать клетки в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (используя уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2). Ресуспендируют клеток в 4 мл СВ и хранить их на льду. Граф клеток, как описано в шаге 3.
    Примечание: Клеточный осадок рыхлый, и, следовательно, супернатант пипеткой прочь вместо того, чтобы быть декантируют.

3. Определение клеточного графа с использованием проточной цитометрии

Примечание: Для определения количества клеток, автоматизированный счетчик клеток или, в идеале, поток клеток Количественное цитометрии на основе описанной ниже предлагается вместо классического метода Нойбауэра камеры на основе. Подвеска печени одноклеточного описано в шаге 2 содержит паренхимы и не паренхимных клеток (NPC) с сильно различающимися размерами и гранулярности. Надлежащее исключение клеточных остатков вместе с литниковой-на рассеяния вперед, боковое рассеивание (FSC-SSC) характеристики РНУ при использовании проточной цитометрии обеспечивает успех описанного протокола 12.

  1. Готовят аликвоту клеток печени суспензии (20 мкл) и добавляют 174 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) и 6 мкл пропидиума йода (PI; конечная концентрация 0,375 мкг / мл). Добавить подсчета шарики, которые позволяют для количественной оценки клеток.
  2. Ворота на SSC-A-FSC-A, чтобы избежать мусора и далее исключить дублеты с использованием FSC-H и FCS-A.
    Примечание: Важно следовать стратегии стробирования , изображенную на рисунке 2.
  3. Ворота из PI-положительные мертвые клетки, измеряют 30 мкл из ваших образцов, а также записывать события. Следуйте руководство изготовителя для расчета количества клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги с 4 по проточной цитометрии измерения, шаги 5 и 6 для изоляции на основе магнитных клеток-предшественников, а также шаги 7 для проточной цитометрии рода субпопуляции клеток-предшественников.

4. Окрашивание одноклеточные подвески печени для FoW цитометрии анализа прародителя подмножествах

антитело клон Host / Изотип Фото Концентрация [мг / мл] разбавление
CD64 X54-5 / 7.1 Мышь IgG1, κ 0,5 1: 100
CD16 / 32 93 Крыса IgG2a, λ 0,5 1: 100
CD45 30-F11 Крыса IgG2b, κ 0,2 1: 200
CD31 MEC13.3 Крыса IgG2a, κ 0,5 1: 200
ASGPR1 Поликлональные Коза IgG 0,2 1: 100
Podoplanin 1/8/2001 Сирийский хомяк IgG 0,2 1: 1 400
Podoplanin 1/8/2001 Сирийский хомяк IgG 0,5 1: 1 400
CD133 Mb9-3G8 Крыса IgG1 0.03 3 мкл
CD133 315-2C11 Крыса IgG2a, λ 0,5 1: 100
CD34 RAM34 Крыса IgG2a, κ 0,5 1: 100
CD90.2 53-2,1 Крыса IgG2, κ 0,5 1: 800
CD157 BP-3 Мышь IgG2b, κ 0,2 1: 600
EpCAM G8.8 Крыса IgG2a, κ 0,2 1: 100
Sca-1 D7 Крыса IgG2a, κ 0.03 10 мкл
Мышь IgG2b, κ MPC-11 0,2
Крыса IgG1 RTK2071 0,2
Крыса IgG2b, κ RTK4530 0,2
Крыса IgG2a, κ RTK2758 0,5
Крыса IgG2a, κ RTK2758 0,2
Сирийский хомяк IgG SHG-1 0,2
Сирийский хомяк IgG SHG-1 0,5
Нормальный контроль Коза IgG Поликлональные Коза IgG 1
Осел анти-IgG Коза Осел IgG 2 1: 800
стрептавидином 1 1: 400

Таблица 1.

антитело 1 2 3 4 5
CD45 APC / Cy7 Крыса IgG2b, κ
0,5 мкл 		+ + + +
CD31 Биотин + Крыса IgG2a, κ
0,5 мкл 		+ + +
ASGPR1 очищают + + Нормальный контроль Коза IgG
0,2 мкл 		+ +
Podoplanin APC + + + Сирийский хомяк IgG
1 мкл 1:14 Разбавление 		+
CD133 PE + + + + Крыса IgG1
0,45 мкл
Осел анти-Коза
Alexa Fluor 488 		+ + + + +
стрептавидином
Alexa Fluor 405 		+ + + + +

Таблица 2.

  1. Поместите аликвоты клеточной суспензии с шага 2,11 в реакционную трубку (1,5 мл) , содержащей 2,5 × 10 5 клеток, определяют , как описано в шаге 3.
  2. Центрифуга клетки в течение 3 мин при 300 х г и 4 ° С с использованием микроцентрифуге.
    Примечание: На этом этапе вакуумный насос может быть использован, чтобы тщательно удалить супернатант.
  3. Ресуспендируют осадок клеток в Fc-блоке смеси и инкубировать ее в течение 5 минут на льду. Подготовьте Fc-блок смесь с общим объемом 50 мкл на пятно. Добавьте 10 мкл FcR-блокирующего реагента, 1 мкл очищенного анти-CD64 (1: 100; 0,5 мкг / пятно), и 40 мкл окрашивающего буфера (ST буфер: HBSS, 1% (об / об) FBS, и 0,01% азид натрия) на пятно.
    Примечание: азид натрия очень токсичен. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты, такие как нитрил перчатки, лабораторный халат, а также маски для лица.
  4. Добавить 50 мкл окрашивания смеси с клетками (общий объем клеток в настоящее время 100 мкл) и инкубируют клетки со смесью антител, защищенном от света и в течение 20 мин на льду.
  5. Готовят смесь антител с общим объемом 50 мкл на пятно. Для 50 мкл ST буфера, добавьте следующие конъюгированные антитела для основного окрашивания: CD45 (0,5 мкл; 1: 200; 0,1 мкг / пятно), CD31 (0,5 мкл; 1: 200; 0,25 мкг / пятно), ASGPR1 (1 мкл ; 1: 100; 0,2 мкг / пятно), podoplanin (1 мкл 1:14 разведения; 1: 1 400 конечного разведения; 0,014 мкг / пятно) и CD133 (3 мкл; 0,09 мкг / пятно).
    Примечание: Таблица1 приведены антитела клонов и разведения использованы для основных пятен и дополнительных поверхностных маркеров различных подмножеств. Подготовьте дополнительные клеточные суспензии для смеси антител , содержащего соответствующие элементы управления изотипа и / или флуоресценции минус один контроль (лесозаготовительных предприятий), как показано в таблице 2.
  6. Добавить 400 мкл буфера для ST для каждого образца и центрифугировать клетки в течение 4 мин при 300 х г и 4 ° C.Discard супернатант и клетки вновь суспендируют в 100 мкл вторичного антитела смеси, содержащей 0,125 мкл осла против IgG козьего (1: 800; 0,25 мкг / краситель) и 0,25 мкл флуоресцентного-конъюгированный стрептавидин (1: 400; 0,25 мкг / пятно) в 100 мкл буфера для ST.
  7. Инкубируйте клетки в то время как в защищенном от света и со смесью антител в течение 20 мин на льду. Добавить 400 мкл буфера ST для каждого образца и центрифугировать клетки в течение 4 мин при 300 х г и 4 ° С. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 300 мкл ST нагишомэр, содержащий 0,25 мкг / мл PI.
    ПРИМЕЧАНИЕ: жизнеспособность клеток из клеток-предшественников уменьшается со временем; Поэтому, предлагается измерить свежие образцы как можно скорее.

5. Магнитный Microbead на основе Обогащение клеток-предшественников

  1. Передача аликвоты печени одной клеточной суспензии , содержащей 1,5-2 × 10 6 клеток, на основе подсчета клеток определяли , как описано в шаге 3, в новый 15-мл коническую центрифужную пробирку.
  2. Центрифуга клеток в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (используя уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2).
    Примечание: Как правило, один здоровый C57BL / 6 мышей печени (или 1 г ткани печени), должны быть разделены на три 15-мл коническую центрифужную пробирку.
  3. Ресуспендируют клеток в 400 мкл HBSS 0,5% (об / об) бычьего сывороточного альбумина (БСА) и добавляют 40 мкл анти-CD31 микросфер и 30 мкл анти-CD45 микрогранул. Инкубируйте клетки в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
    Примечание: Не следует превышать тон инкубацией время, поскольку чистота разделения будет значительно уменьшена.
  4. Добавить 5 мл HBSS 0,5% (об / об) БСА к клеткам и отцентрифугированы в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (используя уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2).
  5. Ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл мертвых бусин удаления клеток и инкубировать их при комнатной температуре в течение 15 мин. В то же время, подготовить разделительную колонку LS и калибровать его с 3 мл HBSS 0,5% (об / об) БСА.
    Примечание: Не превышайте время инкубации, так как чистота разделения будет значительно сокращен.
  6. Добавить 900 мкл HBSS 0,5% (об / об) БСА к клеткам, фильтровать их с использованием 100-мкм сетчатый фильтр из полиамида, и загрузить их на разделительную колонку LS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузите один всю печень на одну разделительную колонну LS.
  7. Промыть колонку три раза с 3 мл HBSS 0,5% (об / об) БСА и собирать проточные.
  8. Центрифуга проточный в течение 8 мин при 180 мкг и 4 ° С (с использованием пониженной ACCEleration / 4 и замедление / 2).
  9. Ресуспендируют осадок клеток либо в ополаскивание буфере (RB) (PBS и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА)), содержащего 0,5% (об / об) БСА или ST буфера, в зависимости от дальнейшей экспериментальной процедуры.

6. Магнитный Microbead на основе Автоматизированная Cell Очистка прогениторных клеток подмножествах В сочетании с нескольких Печени

ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку клеток-предшественников подмножества представляют популяции редких клеток, сочетающие в себе клетки из нескольких печени часто требуется для достижения достаточного количества клеток для дальнейших экспериментов. В качестве примера, CD133 + и gp38 + разделение клеток описана ниже.

  1. Выделение CD133 + клеток - предшественников
    1. После шага 5.9, подсчет клеток, как описано в шаге 3, и ресуспендируют до 10 6 клеток ( как правило , 4-6 пулинговой здоровых образцов печени) в 100 мкл РБ.
    2. Добавить анти-CD64 1: 100 и анти-CD16 / 32 1: 100 к клеткам и incubели их на льду в течение 5 мин. Добавить 1: 100 анти-CD133 биотинилированных антител к клеткам и инкубировать их на льду в течение еще 10 мин.
    3. Добавьте 5 мл РБ и центрифуга в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (используя уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2).
    4. Ресуспендируют клеток в 400 мкл РБ и добавляют 10 мкл анти-биотин микрогранул. Инкубируйте образца в течение 15 мин при температуре 4 ° С. Не превышать времени инкубации, так как это снижает чистоту образцов.
    5. Добавьте 5 мл РБ и центрифуга в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (используя уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2). Ресуспендируют осадок в 1 мл РБ.
  2. Выделение gp38 + клеток - предшественников
    1. После шага 5.9, подсчет клеток, как описано в шаге 3, и ресуспендируют до 10 6 клеток ( как правило , 4-6 пулинговой здоровых образцов печени) в 100 мкл РБ.
    2. Добавить анти-CD64 1: 100 и анти-CD16 / 32 1: 100 к клеткам и инкубировать их на льду в течение 5 мин. Затем добавьте 1:100 анти-gp38 биотинилированных антител к клеткам и инкубировать их на льду в течение еще 10 мин.
    3. Добавьте 5 мл РБ и центрифуга в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (используя уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2).
    4. Ресуспендируют клеток в 400 мкл РБ и добавляют 5 мкл анти-биотин микрогранул. Инкубируйте образца в течение 15 мин при температуре 4 ° С. Не превышать времени инкубации, так как это снижает чистоту образцов.
    5. Добавьте 5 мл РБ и центрифуга в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (используя уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2).
    6. Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл РБ.
  3. Общие шаги после шага 6.1 или 6.2
    1. Поместите 15-мл коническую центрифужную пробирку, содержащую магнитно-меченных клеточные суспензии на охлаждающем 5 стойку с двумя дополнительными пустыми трубами для сбора положительных и отрицательных фракций. Поместите чилл стойку на платформе разделения сепаратора.
    2. Используйте позитивную программу выбора(Possel_d2) с обширной стадии промывки между каждой пробы (опция ополаскивания).
      Примечание: Использование колонки на основе ручное разделение клеток вместо автоматического сепаратора уменьшит чистоту образца.
    3. Сбор положительную фракцию и центрифуге в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (с использованием уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2).
    4. Ресуспендируют осадок клеток либо в РБ или ST буфер, в зависимости от дальнейшей экспериментальной процедуры.
    5. Для проверки чистоты, возьмите аликвоты клеток и окрашивать их, как описано в шаге 4.

7. проточной цитометрии сортировки клеток

Примечание: Высокий сорт чистота любого подмножества клеток-предшественников может быть достигнуто с протоколом, описанным ниже. Общий выход клеток значительно ниже, чем это описано в шаге 6, и лучше всего для анализа экспрессии генов.

параметр настройка
Размер сопла 85 мкм
частота 46.00 - 46.20
амплитудное 38.30 - 55.20
фаза 0
Задержка выпадения 28.68 - 28.84
ослабление выключено
Первое падение 284 - 297
Целевой показатель Gap 9.-14
давление 45 фунтов на квадратный дюйм

Таблица 3.

  1. Acquire клетки от магнитного на основе обогащения (описанной на стадии 5); считать их, как описано в шаге 3; и окрашивают их для маркеров-предшественников (CD133, gp38), CD31, CD45 и ASGPR1, как описано в шаге 4.
  2. Подготовка сортировки среды (SM): фенол-красный свободный DulbecК.О. Модифицированный орла Средний (DMEM), содержащей 0,5% (об / об) БСА и 0,01% (об / об) азида натрия. Ресуспендируют окрашенных клеток в SM, передавать их в полипропиленовую с круглым дном трубы, и поместите их на лед.
    Примечание: азид натрия очень токсичен. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты, такие как нитрил перчатки, лабораторный халат, а также маски для лица. Не следует использовать азид натрия, если отсортированной клетки используются для функциональных анализов.
  3. С помощью соответствующего программного обеспечения для типа сортировщика, используемого для выделения клеток. Откройте программу и следуйте инструкциям производителя, чтобы настроить параметры сортировки и технические характеристики машины.
    Примечание: Технические характеристики машины приведены в таблице 3. В то время как технические характеристики машин может быть различным в различных учреждениях, важно отметить, что снижение сортировочного давления и больший размер сопла необходимо (45 фунтов на квадратный дюйм, и сопло 85 мкм) для повышения жизнеспособности клеток-предшественников populatионов и качество РНК, полученной из отсортированных клеток. Важно использовать обогащенные клетки-предшественники печени для установки компенсации. Другие популяции печени или лейкоциты имеют различную автофлуоресценции и результат в неоптимальным разрешением населения стромы и в ложной стратегии стробирования.
  4. Откалибруйте машину и поместить в 5 мл полипропилена с круглым дном пробирки, содержащей 350 мкл SM в устройстве сбора сортировки. Начать сбор образцов и сортировки. Соберите 1000 событий субпопуляции и остановить поток пробы.
  5. Возьмем трубку из устройства сортировки и измерения отсортированных клеток на проточном цитометре. Определить процент отсортированного популяции клеток присутствует среди живых клеток. Этот процент дает чистоту отсортированных клеток.
  6. Если чистота сорт превышает 95%, место 5-мл полипропиленовую с круглым дном пробирки, содержащей 350 мкл RLT буфера для лизиса в устройстве сбора сортировки.
  7. Начните сортировку и собирать 7000-10000 событий в стромальных субпопуляции.
  8. Перенесите RLT буфер для лизиса, содержащую отсортированные клетки в реакционной трубке DNase- и не содержащей РНКазы, и хранить образцы при -80 ° C до дальнейшего анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Процедура , представленная здесь для переваривания печени с использованием новой смеси ферментов приводит к одноклеточной суспензии , содержащей паренхиматозные и не-паренхиматозные клетки печени (рис 1 и 2а). После ACK-лизису эритроцитов, прямой проточной цитометрии анализа одной клеточной суспензии можно (1 и 2). Стратегия стробирования предполагает исключение дублетов и мертвых клеток (фиг.2А). Клетки...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Воспаление печени и травмы различного происхождения вызывают регенеративные процессы в печени, сопровождающихся расширением клеток - предшественников и активации 2, 3. Эти клетки-предшественники печени обладают стволовые клеточные характеристики и, вероятно, играют существенную роль в pathomechanism различных заболеваний печени.

Неоднородность прогениторных клеток печени уже давно было предложено. Переоценка подмножеств предшественни...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Александра фон Гумбольдта премии Софьи Ковалевской в ​​VLK.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
RPMILife Technologies21875-034
фенол красный свободный DMEMLife Technologies31053-028
FBSLife Technologies10270-106
коллагеназа PSigma-Aldrich11249002001
DNAse-ISigma-Aldrich10104159001
DispaseLife Technologies
ACK Лизирующий буферLife TechnologiesA10492-01
HBSSLife Technologies14025-050
PBSSigma-AldrichD8537
Азид натрияSigma-AldrichS2002Приготовить 1% стоковый раствор
10%BSA Miltenyi Biotec130-091-376
autoMACS Раствор для полосканияMiltenyi Biotec130-091-222добавить 0,5% (v/v) BSA и хранить на льду
Фенол-красный свободный DMEMSigma-AldrichD1145
счетные бусины Count BrightLife TechnologiesC36950
PIMiltenyi Biotec130-093-233
FcR Блокирующий реагентMiltenyi Biotec130-092-575
анти-CD31 МикрогранулыMiltenyi Biotec130-097-418
анти-CD45 МикрогранулыMiltenyi Biotec130-052-301
Набор для удаления мертвых клетокMiltenyi Biotec130-090-101
антибиотин МикрогранулыMiltenyi Biotec130-090-485
CD64 ОчищенныеBioLegend139302Разведение: 1:100
CD16/32 ОчищенныйBioLegend101302Разведение: 1:100
CD45 APC/Cy7BioLegend103116 Разведение: 1:200, маркирует гематопоэтические клетки
CD31 BiotinBioLegend102504Разведение: 1:200, маркирует эндотелиальные клетки
ASGPR1 ОчищенныйBio-TechneAF2755-SPРазведение: 1:100, маркирует гепатоциты
Подопланин APCBioLegend127410Разведение: 1:1,400, маркирует клетки-предшественники
Подопланин БиотинBioLegend127404Разведение: 1:1,400
CD133 PEMiltenyi Biotec130-102-210использовать 3 &микро; L, метки клеток-предшественников
CD133 BiotinBioLegend141206Разведение: 1:100
CD34 БиотинeBioScience13-0341-81Разведение: 1:100
CD90.2 Pacific BlueBioLegend140306Разведение: 1:800
CD157 PEBioLegend140203Разведение: 1:600
EpCAM Brilliant Violet 421BioLegend118225Разбавление: 1:100
Sca-1 BiotinMiltenyi Biotec130-101-885use 10 &микро; L
мышь IgG2b, κ PEBioLegend400311
крысы IgG1 PEBioLegend400407
крысы IgG2b, κ APC/Cy7BioLegend400624
крысы IgG2a, κ БиотинBioLegend400504
крысы IgG2a, κ Brilliant Violet 421BioLegend400535
Сирийский хомяк IgG APCBioLegend402012
Сирийский хомяк IgG БиотинBioLegend402004
обычной козы Контроль IgG очищенныйBio-TechneAB-108-C
Ослик против коз IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA11055Разведение: 1:800
Стрептавидин Alexa Fluor 405Life TechnologiesS32351Разведение: 1:400
100 &; m Фильтрующая сеткаA. HartensteinPAS3
LS КолоннаMiltenyi Biotec130-042-401
Сепаратор QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi Biotec130-096-343
Сепаратор AutoMACS ProMiltenyi Biotec130-092-545
FACS AriaTMIIIBD Biosciences
FACSDiva sofwareBD Biosciences
Полипропиленовая круглая донная трубкаFalcon352063
Rneasy plus плюс мини-наборQiagen74134RLT лизисный буфер в комплекте
17105041

Ссылки

  1. Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
  2. Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).
  3. Dorrell, C., et al. Surface markers for the murine oval cell response. Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).
  4. Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. Ductular reactions in human liver: diversity at the interface. Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).
  5. Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury. Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).
  6. Shin, S., et al. Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential. Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).
  7. Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).
  8. Font-Burgada, J., et al. Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer. Cell. 162 (4), 766-779 (2015).
  9. Kuramitsu, K., et al. Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation. Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).
  10. Pritchard, M. T., Nagy, L. E. Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice. Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).
  11. Spee, B., et al. Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling. Gut. 59 (2), 247-257 (2010).
  12. Eckert, C., et al. Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).
  13. Epting, C. L., et al. Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells. J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).
  14. Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).
  15. Rountree, C. B., et al. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).
  16. Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion. J Vis Exp. (56), (2011).
  17. Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).
  18. Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12(2011).
  19. Schmelzer, E., et al. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FACSCD45 CD31 ASGPR1GP38 CD133

Похожие статьи