Производство здоровых лабораторными выращены клещи необходимо исследования по клещу биологии, и тик-патоген взаимодействий. Здесь мы демонстрируем простой протокол для незрелого кормления клеща, что является экономически эффективными и менее напряженным для мышей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ixodes scapularis , вектор болезни Лайма, является одним из наиболее важных переносчиков заболеваний в восточной и среднезападной части Соединенных Штатов. Этот вид представляет собой трёхмерный клещ, для которого требуется кровь из позвоночного хозяина для каждой стадии развития, а взрослым самкам требуется кровь для размножения. Клещи личинок прикрепляются к хозяину в течение 3 - 5 дней для кормления и высадки хозяина при полном насыщении. Эта зависимость от нескольких разных хостов и длительное время присоединения для нагрубания затрудняет выращивание клещей в лабораторных условиях. Тем не менее, чтобы понять биохимию клещей и клещевые патогенные взаимодействия, производство здоровых, лабораторно выращенных клещей очень важно. Здесь мы демонстрируем простой, рентабельный протокол для незрелого клещевого кормления на мышах. Мы модифицировали существующие протоколы для снижения стресса у мышей и увеличили успех клещей и выживаемость, используя одноразовые клетки без дна сетки, чтобы избежать контакта клещей wiЙ воды, загрязненной мочой мышей и фекалиями.
Введение
Клещи являются обязательными гематофагическими эктопаразитами позвоночных и распространены во всем мире. В Соединенных Штатах, по крайней мере, 11 видов клещей являются переносчиками патогенов, имеющих важное значение для общественного здоровья 1 . Ixodes scapularis ответственен за передачу нескольких патогенов, таких как возбудители болезни Лайма ( Borrelia burgdorferi ), рецидивирующая лихорадка ( B.miyamotoi), гранулоцитарный анаплазмоз человека ( Anaplasma phagocytophilum ) и бабезиоз (Babesia spp.). Несмотря на важность I. scapularis как вектор болезни, сбор этих паукообразных в изобилии из дикой природы для исследований в лаборатории не всегда возможен. Таким образом, производство здоровых лабораторных клещей имеет важное значение для изучения биологии клещей и клещевого патогенного взаимодействия.
Жизненный цикл всех тяжелых клещей (семейство Ixodidae), включая I. scapularis, состоит из яйца и трех активныхЕ стадии: личинка, нимфа и взрослый. Каждая активная стадия питается позвоночным хозяином. Сложные взаимодействия, которые происходят между клещами и их хозяевами в течение нескольких дней прикрепления и кормления, почти невозможны для репликации с использованием искусственных фидеров, и вряд ли они обеспечат достаточное количество сытых клещей для массового выращивания 2 , 3 , 4 . Поэтому живые мыши и кролики чаще всего используются в качестве хозяев для выращивания незрелых (личинок и нимф) и зрелых стадий (взрослых) клещей, соответственно. Требование множественных хостов для кроветворения в течение каждой стадии развития усложняет клещевое разведение и требует значительных затрат времени и средств 5 , 6 , 7 . Большинство протоколов размножения клещей требуют удерживания мышей в клетке 7 или 8 в подвесной проволочной сетке или в цилиндрическом саGE таких размеров , что животное не может свободно перемещаться и жених себя 6, 9, 10.
Эти цилиндрические клетки, которые затем переносили в обувной коробке клетку с проволочной сеткой. Напитавшиеся, отдельные клещи затем собирает из воды под ним. Тем не менее, этот метод приводит к обнажая кормили клещей воды , загрязненной мочой и калом , которые могут увеличить рост грибковой и тикают смертность 9. Кроме того, это увеличивает возможность клеща выхода из воды желоба, а также вызывает стресс у мышей. Чтобы обойти эти проблемы, мы здесь демонстрируем личиночное кормление клеща на мышах в течение пластик коробки типа одноразовых клеток. Этот метод позволяет нормальное поведение мышей, увеличивается напитавшихся восстановление тик, тик и уменьшает смертность вследствие загрязнения.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протокол (Номер-00682), описанный ниже, одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованием (IACUC) в Университете Невады Рено и соответствует принципам Университета штата Невада, комитета по этическим исследованиям животных Рено. Короче говоря, мышей анестезировали изофлураном, а носовой конус использовался для поддержания непрерывного уровня изофлурана в течение 20 мин. Мазь ветеринара использовалась для предотвращения высыхания глаз под наркозом. Для определения уровня анестезии использовали уровень пальцев стопы, а во время процедуры измеряли интенсивность дыхания. Мышей держали в отдельных клетках и контролировали до тех пор, пока сознание не было восстановлено. Мыши использовались только один раз для кормления клещей и подвергались эвтаназии после восстановления клеща. Эвтаназия была проведена сотрудниками лаборатории лабораторной медицины. CO 2 и дислокация шейки матки использовались для эвтаназии животных.
ПРИМЕЧАНИЕ. Работа с клещами требует использования полного персонального защитного эквалайзераНАС ТРОЙКА. Для подсчета незрелых клещей, носить белые халаты, длинные нитриловые перчатки, чтобы покрыть рукав открытие лаборатории пальто с крышкой с резинками и закрытым носок обувь. Для паразитирующего мышея с клещами, используйте сетку для волос, одноразовые комбинезоны, с длинными рукавами, перчатки на рукава и охватывает ножной. Используйте белый или светлый цвета комбинезона для обнаружения своенравных тиков. Периодически проверяйте перчатки и рукав для клещей.
1. Подготовка номеров для содержания животных
- Назначьте отдельную комнату для домовых мышей, зараженных клещами. Поместите липкий коврик или двухсторонний ковер ленту снаружи и внутри двери для предотвращения случайного побега клеща.
2. Подсчет Кусачки для мыши зараженности
- Поместите двухстороннюю ленту вокруг верхних краев х 5" х 14" пластмассовой тары 7" и заполняют водой до приблизительно 2 см.
- Поместите еще один небольшой ящик или чашку Петри в центре контейнера и залить водой до 1 см создавая &# 34; ров»вокруг этого контейнера
- Храните флакон, содержащий личинки или нимфы в чашке Петри.
- Используйте тонкую кисть для удаления личинок или нимф из флакона и подсчета под микроскопом. Количество 50 личинок или 25 нимф в отдельные сцинтилляционные флаконы. Накройте чаши сразу с нейлоновой сеткой или органди экран ткани и близко с резинками.
3. Заполнять Мыши с незрелыми тиками
- Используйте белый или светло-окрашенный верстак и наклеить двухсторонний скотч по периметру рабочей зоны.
- Обезболить мышь с изофлураном. Проверьте уровень анестезии схождения крайнем случае. После того, как наркоз, передать мышь на грелку, покрытой бумажным полотенцем и приложите к конусообразной для продолжения изофлурановым питания.
- Применение вазелина на основе глазную мазь, чтобы избежать сухости. Обратите внимание на шаблон дыхания мыши, чтобы регулировать уровни изофлурана (80 -. 230 вдохов в мин нормально, Снижение уровня изофлурана, если ушСкорость выедания менее 80 вдохов в минуту, чтобы избежать убийства животного).
- Возьмите один флакон из 50 личинок или 25 нимф и поместите клещей под шерсть на голове между ушами с помощью кисти ( рис. 1 ). Держите мышь под анестезией в течение 20 минут после размещения, чтобы дать достаточно времени для прикрепления клещей.
- Переместите мышь в стандартную пластиковую коробку с одноразовой пластиковой коробкой для обуви с статическими крышками и белыми постельными принадлежностями. Обеспечьте игрушки, воду и пищу ad libitum в соответствии с нормальным уходом за мышью.
- Храните клетку для мыши внутри большей клетки крысы или песчанки, выложенной двухсторонней липкой лентой вокруг верхних краев. Заполните внешнюю клетку 3 см воды ( рис. 2 ).
4. Сбор мышей от мышей
- Незрелые клещи отделяются между 3 и 6 днями кормления. Проверяйте клетки и водный ров для насыщенных клещей каждый день после третьего дня.
- Соберите отдельные клещи из клетки между 4 и 6 днями. Используйте больКисть или мягкие щипцы для сбора насыпных клещей и хранения в чистых сцинтилляционных флаконах, увенчанных нейлоновой сетчатой тканью, закрепленной резинками.
- Анестезируйте и проверьте мышь на 7-й день для всех остальных прикрепленных клещей.
- Проверьте постельные принадлежности, кормушку и бутылку с водой для насыщенных клещей на 7-й день. Усыпейте мышей, следуя процедуре, описанной выше. Автоклавируйте одноразовые клетки, подстилку, бутылку с водой и кормушку для продуктов питания, чтобы избежать вылета с голодных клещей.
5. Хранение тиков ФРС
- Поддерживать насыщенные клещи при влажности 90%, 20 ° C и 12:12 светлого-темного цикла в инкубаторе с контролируемой влажностью и температурой до тех пор, пока не произойдет линька. Это может занять от 12 до 18 недель.
- В то время как высокая влажность способствует выживанию клещей, это также делает клещей, склонных к разрастанию грибков. Проверяйте подкожные клещи под микроскопом не реже одного раза в неделю для плесени. Если обнаружено, вымыть оставшихся в живых в 70% этанола для 5мин., промыть в воде, переносят в фильтровальную бумагу, чтобы высушить и перенести на новые, чистые флаконы.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы модифицировали существующие протоколы Tick выращивания 6, 10 для улучшения эффективности кормления и снижение нагрузки на хосте мыши. Полученные результаты показывают, что стандартные садки коробки типа мышей хорошо подходят для клеща выращивания. Белое постельное белье обеспечивает хорошую контрастность для удобного сбора сытых клещей. Большинство клещей взобрались стенка контейнеров после кормления и были легко собрать. Кром...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Критические шаги в рамках Протокола
Важно иметь несколько уровней мер безопасности при выращивании клещей, чтобы избежать случайного выхода. Использование липкой ленты и водяного рва имеет решающее значение для обеспечения безопасности. Важно держать анестезированную мышь на грелке, чтобы поддерживать постоянную температуру тела. Мы также обнаружили, что бритье мыши не дает никаких дополнительных преимуществ при прикреплении клещей. Отдельную мышь можно держать в одной клетке в течение одной не...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы выражают признательность за помощь сотрудникам Laboratory Animal Medicine, University of Nevada, Reno. MM получил финансирование от Nevada INBRE.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Ветеринарная мазь Puralube | Доступна в любом зоомагазине или интернет-магазине | ||
| Одноразовая клетка для мышей | Innovive, Сан-Диего, Калифорния | MV 2 | Комплект дна и крышки |
| Белый Alpha dri bedding | Lab Supply, Форт-Уэрт, Техас | nbsp; ALPHA-Dri™ |
Ссылки
- Gleim, E. R., et al. Factors associated with tick bites and pathogen prevalence in ticks parasitizing humans in Georgia, USA. Parasites & Vectors. 9 (125), Available from: http://doi.org/10.1186/s13071-016-1408-6 1-13 (2016).
- Krober, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).
- Kuhnert, F. Feeding of Hard Ticks In Vitro: New Perspectives for Rearing and for the Identification of Systemic Acaricides. ALTEX. 13 (2), 76-87 (1996).
- Voigt, W. P., et al. In vitro feeding of instars of the ixodid tick Amblyomma variegaturn on skin membranes and its application to the transmission of Theileria mutans and Cowdria ruminantium. Parasitol. 107, 257-263 (1993).
- Gregson, J. D. Ticks. Insect Colonization and Mass Production. Smith, C. N. , Academic Press. New York. 49-72 (1966).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. 2, Oxford University Press. New York. (1993).
- Bouchard, K. R., Wikel, S. K. Care, maintenance, and experimental infestation of ticks in the laboratory setting. Biology of Disease Vectors. Marquaedt, W. C. , Elsevier. New York. 705-711 (2005).
- Schumaker, T. S., Barros, D. M. Life cycle of Ornithodoros (Alectorobius) talaje. (Acari:Argasidae) in laboratory. J Med Entomol. 32, 249-254 (1995).
- Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. Laboratory life cycle of Ixodes woodi (Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 35, 177-179 (1998).
- James, A. M., Oliver, J. H. Jr Feeding and host preference of immature Ixodes dammini,I.scapularis,and I.pacificus.(Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 27, 324-330 (1990).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
