Method Article

Методы исследования эпителиальной транспортной функции белков и выражение в Native кишка и Сасо-2 клеток, выращенных в 3D

DOI:

10.3791/55304

⸱

March 16th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Department of Research, Jesse Brown VA Medical Center

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to the Authors section in: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D.

One of the authors' names was corrected from:

Arivarasu N. Anabazhagan

to:

Arivarasu N. Anbazhagan

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описаны простые методы для изучения регуляции кишечной функции переносчика серотонина (SERT) и выражения с использованием экстракорпорального клеточной культуры модели в ЦАС-2 клеток , выращенных в 3D и ех естественных условиях модель кишечника мыши. Эти методы применимы к изучению других эпителиальных транспортеров.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпителий кишечника имеет важные транспортные и барьерные функции, которые играют ключевую роль в нормальных физиологических функций организма, обеспечивая барьер для посторонних частиц. Недостатками эпителиальной транспорт (ионов, питательных веществ, или наркотики) было связано со многими заболеваниями и может иметь последствия, которые выходят за рамки нормальных физиологических функций транспортеров, например путем оказания влияния на целостность эпителия и кишечника микробиомом. Понимание функции и регулирование транспортных белков имеет решающее значение для развития улучшенных терапевтических вмешательств. Самой большой проблемой в изучении эпителиального транспорта разрабатывает подходящую модель системы, которая резюмирует важные особенности нативных клеток эпителия кишечника. Существует несколько моделей в пробирке для культивирования клеток, такие как Сасо-2, Т-84 и НТ-29-Cl.19A клетки , как правило , используются в эпителиальной транспортных исследований. Эти клеточные линии представляют собой редукционистскую подход к моделированию еpithelium и использовались во многих механистических исследований, в том числе их изучения эпителиально-микробной взаимодействия. Однако клеточные монослои не точно отражают межклеточных взаимодействий и в естественных условиях микросреды. Клетки, выращенные в 3D показали перспективность модели для исследования проницаемости для лекарственных средств. Показано, что клетки Сасо-2 в 3D могут быть использованы для изучения эпителиальные транспортеров. Кроме того, важно, что исследования в клетках Сасо-2 дополнены другими моделями, чтобы исключить специфические клеточные эффекты и принимать во внимание сложность нативной кишечника. Существует несколько методов были ранее использованы для оценки функциональности транспортеров, таких как вывернутой мешочка и поглощение в изолированных эпителиальных клетках или в изолированных плазматических мембранных везикул. Принимая во внимание проблемы в области по отношению к моделям и измерения транспортной функции, мы демонстрируем здесь протокол для роста клеток Сасо-2 в 3D и описывают использование камеры Ussing какэффективный подход для измерения серотонина транспорта, например, в неповрежденных поляризованных кишечных эпителиев.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпителий кишечника оснащен различными транспортными белками (каналы, АТФаз, со-транспортеров и теплообменников), которые выполняют множество функций, начиная от поглощения питательных веществ, электролитов и лекарственных средств к секреции жидкости и ионов в просвете. Транспортные белки генерируют электрохимические градиенты, которые позволяют перемещение ионов или молекул в векторную образом. Это достигается за счет асимметричных распределений транспортных систем в верхушечных и базолатеральных мембран поляризованных эпителиальных клеток. Кроме того, плотные соединения, которые TETHER соседние эпителиальные клетки, играют важную роль в этом процессе, выступая в кач....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Изучение Кишечные транспортников в 3D системе культуры СаСО-2: Growing 3D Сасо-2 клеточной культуры на желатиновой смеси белков

  1. Оттепели фактор роста снижается желеобразную смесь белка на льду в течение 8 ч (или O / N) при температуре 4 ° С. После оттаивания составит 1 мл или 500 мкл аликвоты для использования или хранить при -20 ° С для последующего использования.
  2. В день культуры, предварительно охлаждать культуральные планшеты (для РНК и белка экстракции) или камерных слайдов (для иммунное окрашивание) на льду. Добавить 30 мкл желатиновой белковой смеси в каждую лунку восьми хорошо камерные-стекло (или 120 мкл на лунку 6-луночного планшета) ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммунологическое в 3D Сасо-2 кист показана на рисунке 1. Представитель образ XY-плоскости , показывающий хорошо разграниченные просвет в 3D кистой , окрашенном фаллоидином актина изображен на рисунке 1А. Сторона, обращенная в просвет обозначает апикальной стороне. Эпителиальные клетки, культивируемые в 3D-среде в результате надежной эпителиального фенотипа. Различные Сасо-2 кист на 12 -й день, когда актин и SERT были совместно окрашивали, показаны на

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полностью дифференцированные монослоев Сасо-2 клеточные широко использовались в качестве поляризованный эпителиальные монослоев для изучения кишечную транспортировки 10, 11, 12, 13, 14, 15. Тем не менее, чтобы имитировать физиологическую организацию эпителиальных клеток кишечника, наблюдается значительный интерес к развитию .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим г-на Кристофера Манзеллу, студента MD/PhD в лаборатории RKG, за помощь в редактировании и корректуре нашей рукописи.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x PBSATCCATCC® HTB­ 37&торговля;Клетки
10x PBSCarl ZeissMicrosope для конфокальной визуализации
3[H]-5-HT LabtekII152453Культивирование клеток для микроскопии
5-HT Gibco70013-032Не является опасным веществом
95% O2- 5% CO2 баллонKPL71-00-27Не является опасным веществом
Агар (для агаровых пластин)FischerBP151-100Острая токсичность, Ora
Agar (для электрода)SigmaG7126-1KGНе является опасным веществом
Alexa Fluor PhalloidinSigmaC3867-1VLНе является опасным веществом
Бычья сыворотка Альбумин (БСА)SigmaP6148-500GВреден при проглатывании или вдыхании
CaCl2LifeTechnologiesA12380Не является опасным веществом
Caco-2 CellsSigmaA8806-5GНе является опасным веществом
Буфер для лизиса клетокFischerBP337-100Не является опасное вещество
Чеканные слайдыSigmaS5886-1KGНе является опасным веществом
Коллаген Тип-1 РастворSigmaS8045-500G
ЭлектродыSigmaS-0876
EMEMGibco by Life Technologies25200-056
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Corning356234используется в качестве внеклеточного матрикса
ФлуоксетинQiagen74104
ГентамицинATCC30-2003Клеточная культура Среда
ГлицинКлеточная сигнализация, Данверс, Массачусетс
Хепес Roche11836145001
индометацинGibco от Life Technologies15070-063
K2HPO4Gibco от Life Technologies15710-064
KOHGibco от Life Technologies15630-080
L-аскорбиновая кислота Gibco by Life Technologies10082147
Счетчик жидкостных сцинтилляций Gibco by Life Technologies70013--032
LSM710Метафизиологические инструменты, Сан-Диего, Калифорния;EM-CSYS-8
МаннитолФизиологические инструменты, Сан-Диего, КалифорнияP2304
Физиологические инструменты Matrigel, Сан-Диего, Калифорния;VCC MC8
MgCl2Physiologic Instruments, Сан-Диего, Калифорния;DM MC6
Многоканальные измерительные клещи напряжения/токаФизиологические инструменты, Сан-Диего, Калифорния;P2300
NaClФизиологические инструменты, Сан-Диего, Калифорния;P2023-100
NaClFisher Scientific, Хэмптон,NH BP1423
NaHCO3Sigma-Aldrich, Сент-Луис, МиссуриS5886
Нормальная козья сыворотка (NGS, 10%)Fisher Scientific, Хэмптон, NHS233
Параформальдегид (PFA)Sigma-Aldrich, Сент-Луис, МиссуриP288
Pen-StrpSigma-Aldrich, Сент-Луис, МиссуриC3881
Реактив для анализа белкаSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури10420
Коктейль ингибиторов протеиназыMEDOX, Чикаго, Иллинойс;стиль G-12300
РНК легкий мини-наборSigma-Aldrich, Сент-Луис, MOM4125
Одноканальный модуль ввода электрода Sigma-Aldrich, Сент>Луис, МиссуриA92902
Слайдеры для камер Snapwell ChambersSigma-Aldrich, Сент-Луис, МиссуриH9523
Фосфат натрия (NaHPO4)Sigma-Aldrich, Сент-Луис, МиссуриF132
Гидроксид натрия (NaOH)Sigma-Aldrich, Сент-Луис, МиссуриT7039
TGF-β 1Perkin-Elmer, Waltham, MANFT1167250UC
Triton X-100Packard Instruments, Downers Grove, ILB1600
Trypsin EDTASigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури221473
Tween-20Bio Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния5000006
Ussing Chamber (только камера)Sigma-Aldrich, Сент-Луис, МиссуриI7378
Использование камерных системSigma-Aldrich, Сент-Луис, МиссуриA1296

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
  2. Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. B....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Caco 2 Cells3D CultureUssing ChamberSerotonin TransportEpithelial TransportIntestinal EpitheliumSERT ProteinWestern BlotImmunofluorescenceCell Culture

Related Articles