Микрожидкостных Платформа с уплотненными электронным детектором для пространственного слежения частиц

Summary

Мы демонстрируем микрожидком платформу с интегрированной поверхности электрода сети, которая сочетает в себе резистивный импульса зондирования (RPS) с множественного доступа с кодовым разделением каналов (CDMA), мультиплексирование обнаружение и определение размеров частиц в нескольких микроканалов.

Abstract

Микрожидкостных обработки биологических образцов, как правило, включает в себя дифференциальные манипуляции взвешенных частиц в различных силовых полях, чтобы пространственно фракционирования образца, основанный на биологическом свойстве интерес. Для результирующее пространственное распределение для использования в качестве аналитического считывания, микрофлюидальные устройства часто подвергаются микроскопическому анализу требует сложного приборы с более высокой стоимостью и уменьшенной переносимости. Для устранения этого ограничения, мы разработали интегрированную электронную технологию зондирования для мультиплексированного обнаружения частиц в различных местах на микрожидком чипе. Наша технология, получившая название микрожидком КОДЫ, сочетает в себе резистивный импульсного зондирования с кодовым разделением множественного доступа для сжатия 2D пространственной информации в 1D электрический сигнал. В этой статье мы представляем практической демонстрацией Микрожидкостных технологии КОДОВ для обнаружения и размера культивируемые раковые клетки распределены по нескольким микроканалов. В видеподтверждено высокоскоростном микроскопии, наша технология может точно анализировать плотные клеточные популяции все в электронном виде без необходимости внешнего устройства. Таким образом, Микрожидкостных КОДЫ потенциально может позволить недорогие интегрированные устройства лаборатории-на-чипе, которые хорошо подходят для тестирования точки оказания медицинской помощи биологических образцов.

Introduction

Точное обнаружение и анализ биологических частиц , таких как клетки, бактерии или вирусы , взвешенных в жидкости представляет большой интерес для целого ряда приложений ^{1, 2, 3.} Хорошо подобранная по размеру, микрофлюидальные устройства предлагают уникальные преимущества для этой цели , такие как высокая чувствительность, нежные манипуляции образца и хорошо контролируемой микросреде ^{4, 5, 6, 7.} Кроме того, микрофлюидальные устройства могут быть разработаны , чтобы использовать комбинацию динамики жидкости и силовых полей пассивно фракционирования гетерогенную популяцию биологических частиц на основе различных свойств ^{8, 9, 10, 11, 12.} В те устройствас, результирующее распределение частиц может быть использован в качестве считыванием но пространственной информации, как правило, доступны только через микроскопии, что ограничивает практическую полезность микрожидком устройства, связывая его к лабораторной инфраструктуре. Таким образом, встроенный датчик, который может легко сообщать о пространственно-временного отображения частиц ", так как они манипулируют на микрожидком устройстве, потенциально может дать недорогой, интегрированные устройства лаборатории-на-чипе, которые особенно привлекательны для тестирования образцов в мобильном телефоне , ограниченных ресурсов.

Тонкопленочных электродов использовались в качестве встроенных датчиков в микрофлюидальных устройств для различных применений , ^{13, 14.} Резистивный Pulse Sensing (RPS) является особенно привлекательным для интегрированного зондирования малых частиц в микроканалов , как это предлагает надежный, чувствительный, и механизм обнаружения высокой пропускной способностью непосредственно из электрических измерений ¹⁵, В RPS, модуляция импеданса между парой электродов, погружают в электролит, используется в качестве средства для обнаружения частицы. Когда частица проходит через отверстие, размером от порядка частицы, число и амплитуда переходных импульсов в электрический ток используются для подсчета и частиц размера, соответственно. Кроме того, геометрия датчика может быть разработан с разрешением фотолитографии для формирования резистивных формы сигналов импульсов с целью повышения чувствительности ^{16, 17, 18, 19} или оценить вертикальное положение частиц в микроканалов ^20.

Мы недавно ввели масштабируемой и простой мультиплексированный резистивной технологии импульсного зондирования под названием Микрожидкостных закодированных с ортогональным обнаружения электрическими зондированию (микрожидком кодов) ^21. Микрожидком КОДЫ полагается навзаимосвязанную сеть резистивных датчиков пульса, каждый из которых состоит из множества электродов микромеханического для модуляции проводимости в уникальном, различимым способом, с тем чтобы позволить мультиплексирование. Мы специально разработаны каждый датчик для получения ортогональных электрических сигналов , аналогичных цифровых кодов , используемых в множественного доступа с кодовым разделением каналов ²² (CDMA) телекоммуникационные сети, так что индивидуальный сигнал резистивный датчик импульсов может быть однозначно восстанавливается из одного выходного сигнала, даже если сигналы от различные датчики мешают. Таким образом, наша технология сжимает 2D пространственной информации частиц в электрический сигнал 1D, что позволяет контролировать частиц в различных местах на микрожидком чипе, сохраняя при этом как Device- и на системном уровне сложности к минимуму.

В этой статье мы представляем подробный протокол для экспериментальных и расчетных методов, необходимых для использования Микрожидкостных технологии кодексах, а также гepresentative результаты его использования при анализе моделируемых биологических образцов. Используя результаты от прототипа устройства с четырьмя мультиплексированных датчиков в качестве примера, чтобы объяснить технику, мы предоставляем протоколы о (1) процесса микротехнологий для создания микрожидкостных устройств с Микрожидкостных технологии кодексах, (2) описание экспериментальной установки, включая электронной, оптической и жидкостный аппаратных средств, (3) компьютерный алгоритм для декодирования сигналов помех от различных датчиков, и (4) результаты обнаружения и анализа раковых клеток в микроканалов. Мы считаем, что использование подробный протокол, описанный здесь, другие исследователи могут применять нашу технологию для своих исследований.

Protocol

1. Конструкция Coding электродов

Примечание: На рисунке 1а показан 3-D структуру micropatterned электродов.

1. Дизайн набор из четырех 7-битных кодов Gold для кодирования микроканалов ^23.
   1. Построить два линейных сдвига с обратной связью-регистров (LFSRs), каждый из которых представляет собой примитивный многочлен.
   2. Используйте LFSRs для создания предпочтительного пары 7-битных м -последовательностями.
   3. Циклическая сдвиг предпочтительный пару м -последовательностями и добавить их в мод 2 для создания четырех различных кодов Gold.
2. Дизайн расположение электродов кодирования (рис 1b).
   1. Поместите три электродных выводов, представляющих положительный, отрицательный и опорные электроды на трех углах.
   2. Маршрут положительный и отрицательный электрод следы на противоположных сторонах каждого микрожидком канала.
   3. Продлить положительные и отрицательные электроды вмикроканалов в качестве электродных пальцев, следуя однозначно присвоен код Голда (рис. 1в)
   4. Поместите электрод сравнения между положительными и отрицательными электродными пальцами.
   5. Поместите положительные и отрицательные электродные следы далеко от внешнего опорного электрода пальцами, чтобы минимизировать электрическую проводимость вне кодирующей области.

2. микротехнологий поверхностных электродов

Примечание: На рисунке 2b показан процесс изготовления поверхностных электродов.

1. Почистите 4-дюймовый боросиликатного стекла пластины в пираньи раствор (98% -ной серной кислоты: 30% перекиси водорода = 5: 1) при 120 ° С в течение 20 мин, чтобы удалить все органические загрязнения. Затем поместите пластину на горячей плите 200 ° С в течение 20 мин для удаления остаточной воды.
2. Передача пластины на блесны. Разлить 2 мл негативного фоторезиста на пластину и закрутить пластины со скоростью 3, 000 оборотов в минуту в течение 40 секунд, чтобы равномерно покрыть вафель с фоторезиста толщиной слоя 1,5 мкм.
3. Поместите пластину на горячей плите 150 ° C и выпекать прядильного фоторезиста в течение 1 мин.
4. Выставляют фоторезиста 365 нм УФ - светом (225 мДж / см ²⁾ через хромированной маску с помощью маски Aligner.
5. Поместите пластину на горячей плите 100 ° С и выпекать подвергается фоторезиста в течение 1 мин.
6. Разработка фоторезиста путем погружения пластины в проявителе фоторезиста (Rd6) в течение 15 с. Аккуратно распылить деионизированную (DI) воду и промойте пластину. Сухие путем продувки сжатым азотом.
7. Поместите пластину с узорчатым фоторезиста в металлический испаритель электронного пучка, и депонировать 20-нм толщиной хромированную пленку, с последующим 80-нм толщиной пленки золота на пластину при базовом давлении от 3 · 10 ^-6 Торр с скорость осаждения 1 Å / с.
8. Опустить пластину с металлическим покрытием в ацетоном в ультразвуковой ванне набор на частоте 40 кГц с амплитудой 100% в течение 30 мин при комнатной нравратура вытравить основной фоторезиста и завершить процесс подъема-офф.
9. Нарезать пластины на более мелкие части, используя обычную пилу для нарезания кубиками.

3. Изготовление пресс-формы SU-8 для микроканалов

Примечание: На рисунке 2а показан процесс изготовления пресс - формы для микроканалов.

1. Очистить и испечь 4-дюймовый кремниевой пластины с помощью той же процедуры, описанной в разделе 2.1.
2. Передача пластины на блесны. Налейте 4 мл фоторезиста на пластину. Покройте пластину с фоторезистом.
   1. Спин пластины при 500 оборотах в минуту в течение 15 сек.
   2. Спин пластины при 1000 оборотах в минуту в течение 15 сек.
   3. Спин пластины при 3000 оборотах в минуту в течение 60 секунд, чтобы получить равномерное покрытие 15-мкм слой фоторезиста.
3. Поместите пластины лицевой стороной вверх на чистую комнату протирать смоченной в ацетоне и удаления остатков фоторезиста с тыльной стороны и по краям пластины.
4. Передача пластины на горячую плели для мягкой выпечки. Во-первых, выпекать пластины при температуре 65 ° С в течение 1 мин. Затем быстро переместить пластины к C горячей плите 95 ° и выпекать в течение 2 мин.
5. Выставляют фоторезиста 365 нм УФ - светом (180 мДж / см ²⁾ через хромированной маску с помощью маски Aligner.
6. Выпекать вафельного после воздействия при температуре 65 ° С в течение 1 мин и затем при 95 ° С в течение 2 мин.
7. Погрузитесь пластины в разработчика и осторожно встряхните контейнер в течение 3 мин. Затем промойте пластину с изопропанолом спиртом (IPA) и высушить его путем продувки сжатым азотом. Если на пластине появляется белого цвета остаток, погрузить его в проявитель снова и развиваться в течение длительного времени и сухой.
8. Выпекать пластины на горячей плите 200 ° С в течение 30 мин, чтобы высушить его полностью.
9. Измерьте толщину узорной фоторезиста с использованием профилометра в различных местах по всей пластине, чтобы обеспечить однородность.
10. Silanize пластины пресс-формы с использованием техники осаждения из паровой фазы. Добавить 200 мкл трichlorosilane в чашку Петри и поместить в вакуум-сушилке, вместе с пластиной формы SU-8 в течение 8 ч.

4. Монтаж Микрожидкостных коды устройств

1. Поместите 4-дюймовый кремниевой пластины с плесенью в чашку Петри диаметром 150 мм, и закрепить его пластырем из его краев.
2. Смешайте полидиметилсилоксан (PDMS), предварительно полимер и сшивающий агент, в соотношении 10: 1, и заливают 50 г смеси в чашку Петри. Поместите чашку Петри в вакуумном эксикаторе , чтобы дегазировать смеси в течение 1 ч, а затем вылечить его в печи при температуре 65 ° С в течение по меньшей мере 4 ч (рис 2а).
3. Вырежьте отвержденного PDMS слой с помощью скальпеля и очистить его от пластины пресс-формы, используя пинцет. Размер устройства доказательством правильности принципа составляет около 20 мм × 7 мм. Затем пробивки отверстий с диаметром 1,5 мм, через PDMS для входа и выхода из канала с помощью микрожидком перфоратором биопсии.
4. Очистите узорчатую сторону части PDMS путем размещения Iт на чистой комнаты клейкой лентой.
5. Очистите стеклянную подложку с поверхностными электродами, промывая его ацетоном, IPA, дистиллированной водой и высушить с помощью сжатого азота.
6. Активируйте поверхности PDMS и стеклянной подложки в кислородной плазме в течение 30 с с микромеханического стороны каждой части лицевой стороной вверх в генераторе ВЧ плазмы, установленной на 100 мВт.
7. Совместите микрожидкостных канал PDMS с поверхностными электродами на стеклянной подложке с помощью оптического микроскопа, а затем довести два плазменных активированных поверхностей в физическом контакте.
8. Выпекать устройство на горячей плите 70 ° С в течение 5 мин, с стороны стекла, обращенной к горячей пластины.
9. Соедините контактные площадки электродов с проводами с помощью пайки.

5. Подготовка моделируемого биологического образца,

1. Культура HeyA8 клеток рака яичников человека в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина в 5% атмосфере СО ₂ при 37 ° Cпока они не достигают 80% слияния.
2. Аспирируйте носитель из культуральной колбы с помощью стеклянной пипетки. Разлить, а затем аспирата 1x фосфатный буферный раствор (PBS), чтобы промыть клетки.
3. Инкубируйте клетки в 2 мл 0,05% (вес / объем) раствора трипсина в течение 2 мин при 37 ° C, чтобы приостановить прилипшие клетки. Затем добавляют 4 мл культуральной среды, чтобы нейтрализовать трипсина.
4. Центрифуга клеточной суспензии при 100 х г в течение 5 мин для осаждения клеток в пробирке. Затем аспирата супернатант полностью.
5. Повторное приостановить клеток в 1-2 мл 1x PBS, осторожно пипеткой вверх и вниз, чтобы механически диссоциируют сгустки клеток.
6. Нарисуйте небольшое количество суспензии клеток в пипетку и подсчитывают количество клеток с использованием гемоцитометра.
7. Развести суспензии клеток с PBS для получения образца с конечной концентрации клеток 10 ⁵ -10 ⁶ клеток / мл.

6. Запуск Микрожидкостных коды устройств

Примечание: Fi3 цифра показывает экспериментальную установку.

1. Поместите Микрожидкостных коды устройств на этапе оптического микроскопа.
2. Применение 400 кГц синусоиду для электрода сравнения на чипе с использованием функции электронного генератора.
3. Подключение положительный и отрицательный электроды чувствительных к двум независимым усилителей транс импедансом для преобразования сигналов тока от каждого в сигналы напряжения.
4. Вычитание положительного чувствительного электрода сигнал напряжения от отрицательного напряжения сигнала чувствительного электрода с помощью усилителя дифференциального напряжения для того, чтобы получить биполярный сигнал.
5. Используйте камеру высокоскоростной оптически операции записи устройства в целях проверки и определения характеристик.
6. Привод клеточной суспензии через устройство микрожидком коды со постоянной скоростью потока (50-1,000 мкл / ч) с помощью шприцевого насоса.
7. Измерить сигнал модуляции импеданса, используя Синхронный усилитель.
   1. Подключите опорный сигнал переменного тока к исхразностная вход усилителя блокировки в. Подключите дифференциальный сигнал биполярного к усилителю блокировки в качестве входного сигнала.
   2. Амплитуду RMS дифференциального сигнала от синхронизированный выходной сигнал усилителя.
8. Пример блокировки в выходной сигнал усилителя при частоте 1 МГц в компьютер через платы сбора данных для дальнейшего анализа.

7. Обработка сигналов датчиков

1. Передача записанных электрических данных в MATLAB для последующей обработки и декодирования.
2. Фильтр записанного сигнала в цифровой области с использованием фильтра Баттерворта (MATLAB встроенную функцию), чтобы удалить высокочастотный шум (> 2,5 кГц).
3. Создайте библиотеку шаблонов кода из сигналов датчиков.
   1. Определить репрезентативные сигналы не перекрываются код, соответствующий каждому датчику в устройстве и извлечения этих блоков сигнала из набора данных в виде отдельных векторов формы сигнала.
   2. Нормализация каждого шаблона вектора кода формы сигналаего силой. Использование MATLAB встроенной функции (bandpower) для измерения мощности сигнала.
   3. Используйте функцию MATLAB (передискретизации), чтобы расширить библиотеку шаблонов с помощью цифровой форме создания версии нормированных кодовых сигналов с различной длительности для компенсации изменения скорости потока клеток над электродами.
4. Определить блоки сигнала, которые соответствуют датчику активности (порог: SNR> 12 дБ) в отфильтрованной формы сигнала. Форма сигнала с ОСШ ниже порога будет рассматриваться как шум.
5. Расшифруйте отдельные блоки датчика активности в записываемый сигнал, используя итерационный алгоритм , основанный на отмене последовательного вмешательства, технику , обычно используемые в многопользовательских сетях связи CDMA ^{24, 25.}
   1. Расчет кросс-корреляции каждого сигнального блока со всеми шаблонами в библиотеке с помощью скользящего скалярного произведения.
   2. Определить шаблон, который производит крупЭст автокорреляции пик для определения доминирующего индивидуального кода сигнала датчика. Запишите время и амплитуду пика АКФ.
   3. Построить кодового сигнала датчика оценку путем масштабирования идентифицированный шаблон кода, основанный на пиковой амплитуды автокорреляции измеренной и временной информации (определяется на этапе 7.5.2).
   4. Вычитание оценочную кодового сигнала датчика от исходных данных.
   5. Итерации процесс от 7.5.1, до тех пор, пока остаточный сигнал не похож на какой-либо сигнал в библиотеке шаблонов, математически определяется как коэффициентом корреляции менее 0,5.
6. Уточнить первоначальные оценки сигнала датчика с шага 7.5 с использованием процесса оптимизации.
   1. Реконструировать сигнал путем добавления отдельных сметных сигналов датчиков от каждой итерации.
   2. Развертки амплитуду, длительность и сроки отдельных сигналов датчиков вокруг первоначальных оценок, чтобы произвести наилучшее соответствие с записанными электрический сигналосновываясь на наименьших квадратов аппроксимации ^26.
7. Преобразование амплитуды расчетных сигналов датчиков в размера ячейки путем калибровки электрических сигналов от оптических изображений.

Results

Микрожидком КОДЫ устройство , состоящее из четырех датчиков , распределенных по четырем микроканалов показано на рисунке 1b. В этой системе, поперечное сечение каждого микрожидком канала был разработан, чтобы быть близко к размеру ячейки таким образом, чтобы (1) множество ячеек, не могут проходить через электроды параллельно, и (2) клетки остаются близкими к электродам повышения чувствительности , Каждый датчик предназначен для создания уникального 7-битный цифровой код....

Discussion

Несколько резистивными датчиками импульсов ранее были включены в микрофлюидальных чипы ^{28, 29, 30, 31, 32.} В этих системах, резистивные датчики импульсов либо не были мультиплексированы ^{28, 29, 30, 31} или они требуются отдельные дат...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
98% серной кислоты	BDH Chemicals	BDH3074-3.8LP
30% перекись водорода	BDH Chemicals	BDH7690-3
Трихлорсилан	Олдрич Химия	235725-100G
Негативный фоторезист	Фуруттекс
Резист Проявитель RD6	Фуруттекс
Ацетон	BDH Химикаты	BDH1101-4LP
SU-8 2015 Негативный фоторезист	Microchem	SU8-2015
SU-8 Проявитель	Microchem	Y010200
полидиметилсилоксан (PDMS)	Dow Corning	3097358-1004	Sylgard 184 Набор силиконовых эластомеров
Изопропиловый спирт	BDH Химикаты	BDH1133-4LP
RPMI 1640	Corning Cellgro	10-040-CV
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)	Seradigm	1500-050
Пенициллин-стрептомицин	Amresco	K952-100ML
Фосфат-солевой буфер (PBS)	Corning Cellgro	21-040-CM
PHD 22/2000 Шприцевой насос	Harvard Apparatus	70-2001
HF2LI Lock-in усилитель	Zurich Instrument
HF2TA Усилитель тока	Zurich Instrument
Eclipse Ti-U Микроскоп	Nikon Corporation
DS-Fi2 Цветная камера высокой четкости	высокоскоростной
v7.3	Phantom
PCIe-6361	National Instruments	781050-01
BNC-2120 Экранированный соединительный блок	National Instruments	777960-01
Система плазменной обработки PX-250	Nordson MARCH