Методическая статья

In Vivo Отслеживание развития отек и микрососудистая патология в модели экспериментальной церебральной малярии с использованием магнитно-резонансной томографии

DOI:

10.3791/55334

⸱

8 июня 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroradiology, Heidelberg University Hospital, 2Division of Experimental Radiology, Department of Neuroradiology, Heidelberg University Hospital, 3NeuroImaging Centre Research, Department of Neuroscience, Ruhr-University Bochum, 4Centre for Infectious Diseases, Parasitology Unit, Heidelberg University Hospital, 5German Centre for Infection Research (DZIF), 6Department of Neuroradiology, University of Würzburg, 7Center for Childhood and Adolescent Medicine, General Pediatrics, Heidelberg University Hospital

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем мышиную модель экспериментальной церебральной малярии и показываем, как воспалительную и микрососудистую патологию можно отслеживать in vivo с помощью магнитно-резонансной томографии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Церебральная малярия является признаком тяжелого малярийного заболевания и часто является предвестником смерти. В то время как агрессивное лечение может спасти жизнь, выявление церебральной малярии может быть затруднено. Мы представляем экспериментальную мышиную модель церебральной малярии, которая имеет множество общих черт заболевания человека, включая отек и микрососудистую патологию. С помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) мы можем обнаружить и отследить нарушение гематоэнцефалического барьера, развитие отека и последующий отек мозга. Мы описываем несколько методов МРТ, которые могут визуализировать эти соответствующие патологические изменения. Таким образом, мы показываем, что МРТ представляет собой ценный инструмент для визуализации и отслеживания патологических изменений, таких как отек, отек мозга и микрососудистая патология, in vivo.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Малярия является серьезной проблемой глобального здравоохранения. 1 Тяжелая малярия характеризуется, в частности, вовлечением головного мозга и часто является плохим прогностическим фактором. Участие в мозге распространено у детей в возрасте до пяти лет в районах с высокой передачей малярии и является основной причиной смерти от малярии в этой возрастной группе. 1 Хотя агрессивное лечение может быть жизненно важным, выявление церебральной малярии, особенно на ранних стадиях, может быть затруднено. Патологические процессы, связанные с церебральной малярией, включают микрососудистые нарушения и отек мозга, что может привести к серьезному отеку мозга. В этой статье мы представляем протокол магнитно-резонансной томографии (МРТ), который позволяет полностью мозговой визуализации in vivo экспериментальной церебральной малярии (ECM). В этом заболевании широко использовались методы визуализации с высоким разрешением с высоким разрешением, хотя мало что известно о том, как ECM инициирует в центральнойНервной системы или какие конкретные механизмы приводят к заболеванию. МРТ in vivo , охватывающая весь мозг, представляет собой важный исследовательский инструмент для лучшего понимания патологии ECM. МРТ способна оценить глобальную головную мозговую опухоль, которая в последнее время признана важным предсказателем смерти не только в ECM, но также и при церебральной малярии. 2 , 3 Тяжелая опухоль головного мозга возникает при смертельных заболеваниях и представляет собой одну из нескольких патологических особенностей между моделями ECM и болезнями человека, заболеванием, которое характеризуется как воспалительными, так и микрососудистыми изменениями. 4

ECM может индуцироваться у мышей CBA или C57BL путем заражения летальным плазмодием berghei ANKA. 5 Начало ECM обычно происходит между 6 и 10 днями после инфицирования и приводит к фитингу, атаксии, респираторному дистрессу и коме, что приводит к рэпуId смерть. 4 Быстрая шкала комы и поведения (RMCBS) - это полезный показатель для оценки клинических симптомов ECM. Он состоит из 10 параметров, каждый из которых оценивается от 0 до 2, с максимально возможной оценкой 20. 6 Недавно мы показали хорошее согласие между степенью оценки RMCBS у мышей ECM и патологическими изменениями, продемонстрированными с помощью МРТ. 7 В этом протоколе мы описываем индукцию ECM у мышей и визуализацию in vivo магнитно-резонансной томографии мышей с ECM.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных, описанные в этой статье, проводились в соответствии с стандартными рекомендациями Федерации лабораторных ассоциаций животных (FELASA) категории B и стандартами общеорганизационного лабораторного животноводства (GV-SOLAS) и были одобрены местными властями Германии в Карлсруэ (Regierungspräsidium Karlsruhe , Германия). Обратите внимание, что уровень биозависимости 2 относится к работе москита и Plasmodium berghei ANKA sporozoite.

1. Инфекция

  1. Инфекция мошек Anopheles stephensi с помощью Plasmodium berghei ANKA путем кормления их в течение 15 мин на гаметоцитемической мыши. Держите инфицированных комаров при влажности 80% и 21 ° C.
  2. Соберите самцов комаров из их клетки через 17-22 дня после еды. Поместите их на лед, чтобы обезболивать их.
  3. Используя щипцы, разместите от трех до четырех москитов на стеклянном слайде, покрытом каплей холодной среды RPMI. Поместите слайд под микроскоп.
  4. Используя щипцы, аккуратно растяните комара между головой и телом. Выделите слюнную железу с помощью шприца и иглы. Повторите эту процедуру с оставшимися комарами.
  5. Соберите слюнные железы со стекла, сосав их стеклянной пипеткой и соберите их в 1,5 мл центрифужной пробирке.
    ПРИМЕЧАНИЕ. В зависимости от уровня инфицирования, обычно от 8 000 до 15 000 инфекционных спорозоитов могут быть получены в слюнной железе.
  6. В течение приблизительно 3 минут разбейте изолированные слюнные железы в пробирке центрифуги маленькой пластиковой палкой для выделения спорозоитов из ткани слюнной железы.
  7. Центрифуга в течение 3 мин при 1000 мкг и 4 ° С для очистки спорозоитов от оставшейся ткани.
  8. Внесите супернатант, который содержит спорозоиты (SPZ), в новую пробирку для центрифуги и подсчитайте очищенные спорозоиты в гемоцитометре Нойбауэра.
  9. Отрегулируйте концентрацию очищенных спорозоитов до 10 000 / мл, добавив phЗамасленный залив.
  10. Вводят в общей сложности 1000 спорозоитов (0,1 мл) в хвостовые вены инбредных мышей C57BL / 6 для инициирования инфекции. Чтобы облегчить инъекции, поместите мышей C57BL / 6 в ограничитель и поместите хвосты в теплую (приблизительно 37 ° C) воду, чтобы помочь визуализации хвостовых вен;
    ПРИМЕЧАНИЕ. Сама инъекция - это короткая процедура, которая может быть выполнена в течение нескольких секунд.
  11. Один раз в день проверяйте паразитемию крови на мазках крови с 3-го дня после заражения SPZ.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Мониторинг паразитемии был ранее визуализирован в статье JoVE Mueller et al. 8
  12. Оцените мышей один раз в день с помощью шкалы быстрого кома и шкалы поведения (RMCBS), начиная с 5-го дня после инъекции спорозоита.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Подробное описание этой процедуры, включая демонстрацию видео, было опубликовано Caroll et al. 6
  13. оценитьМышей с визуализацией МРТ в соответствии с оценкой RMCBS и вопросом исследования, подлежащим рассмотрению. 6

2. Настройка магнитно-резонансной томографии

  1. Выполните МРТ на маленьком сканирующем сканере 9,4 т с использованием объемного резонатора для радиочастотной передачи и катушки приемника поверхности с 4-канальной фазированной решеткой. Включите водяную баню с контролируемой температурой до 42 ° C, чтобы поддерживать температуру тела мыши.
  2. Вызывают анестезию в камере с использованием 2% изофлурана и сжатого воздуха, пока мышь больше не реагирует на пинч пальца. Поддерживайте анестезию на уровне 1-1,5%.
  3. Поместите катетер хвостовой вены в хвостовую вену мыши. Расположите мышь для МРТ, поставив ее склонным и с хрустом спиной на животной кровати, оборудованной головной дверью и зубчатым стержнем, чтобы свести к минимуму движение головы. Старайтесь не выпрямлять шейный позвоночник мыши.
  4. Подключите систему инъекции контрастного вещества к катетеру хвостовой вены, Используйте специальную инъекционную систему, заполненную шприцем Gd-DTPA (0,3 ммоль / кг), или используйте полиэтиленовые трубки, подключенные к шприцу Gd-DTPA (0,3 ммоль / кг).
  5. Нанести глазную мазь декспантенолом на оба глаза. Поместите обмотку головки приемника с 4-канальной фазированной решеткой на головку мыши. Поместите дыхательную подушку на тыльную сторону мыши и подключите ее к устройству мониторинга дыхания.

3. Протокол обработки изображений

ПРИМЕЧАНИЕ. Выберите последовательности изображений из приведенного ниже протокола в соответствии с вопросами исследования, которые необходимо решить. Все перечисленные параметры действительны для программного обеспечения MRI, но могут потребоваться корректировка при использовании других программ.

  1. Начните с выполнения локализующего сканирования, чтобы убедиться, что мозг мыши находится в изоцентре магнита.
  2. Чтобы качественно оценить вазогенный отек, используйте 3D-взвешенное изображение с Т2, выбирая многосекундную RARE-последовательность.
    1. Введите следующий paПомехами в программное обеспечение MRI: время повторения = 2000 мс, время эха = 22 мс, изотропное разрешение = 0,1 мм, поле зрения = 20 x 10 x 12 мм 3 ; Матрица = 200 x 100 x 120, угол поворота = 90-180 °; (Спин-эхо) и редкий фактор = 8. Запустите последовательность и подождите 10 мин 48 с, чтобы получить необработанные изображения.
  3. Чтобы количественно оценить вазогенный отек, произведите релаксометрию Т2, выбирая многослойную множественную спин-эхо-последовательность.
    1. Используйте следующие параметры: время повторения = 3,100 мс, время эха = 8-136 мс с шагом 8 мс, количество срезов = 17, толщина среза = 0,7 мм, разрешение по плоскости = 0,116 мм x 0,116 мм, поле зрения 20 X 20 мм 2 , матрица = 172 x 172, угол поворота = 90-180 градусов; (Спин-эхо). Запустите последовательность и подождите 8 мин 53 с, чтобы получить необработанные изображения.
  4. Чтобы количественно оценить как вазогенный отек, так и цитотоксический отек, выполните диффузионно-взвешенную визуализацию / коэффициент кажущейся диффузии(АЦП) путем выбора диффузионной последовательности ЭПИ спин-эха.
    1. Используйте следующие параметры: время повторения = 3.400 мс, эхо-время = 20 мс, толщина среза = 0,7 мм, количество срезов = 17, количество сенсибилизированных направлений диффузии = 30, значение b = 1,500 с / мм 2 , δ = 3 мс , Δ = 9 мс, частичный коэффициент ускорения Фурье = 1,51, поле зрения = 12 x 15 мм 2 , матрица = 96 x 128, разрешение в плоскости = 0,125 мм x 0,117 мм, угол поворота = 90-180 градусов и Количество насыщенных срезов (сагиттал) = 1. Запустите последовательность и подождите 7 минут 56 с, пока не будут получены необработанные изображения.
  5. Чтобы оценить микрогеморрагии, используйте 3D T2 * -среднюю визуализацию. Выберите FLASH-последовательность с компенсацией потока.
    1. Введите следующие параметры в программное обеспечение MRI: время повторения = 2000 мс, время эха = 22 мс, изотропное разрешение 0,08 мм, поле зрения = 32 x 15 x 8 мм 3 , размер матрицы = 400 x 188 x 100 и fУгол губ = 12 градусов. Запустите последовательность и подождите 15 мин 40 с, чтобы получить необработанные изображения.
  6. Чтобы оценить артериальную проходимость, используйте время ангиографии полета, выбрав трехмерную последовательность FLASH.
    1. Используйте следующие параметры в программном обеспечении MRI: время повторения = 16 мс, время эха = 3,5 мс, толщина среза = 0,07 мм, разрешение в плоскости = 0,104 x 0,104 мм, поле зрения = 20 x 20 x 10 мм 3 , матрица = 192 x 192 x 142, угол поворота = 15 градусов. Запустите последовательность и подождите 7 минут 16 с, пока изображения не будут получены.
  7. Чтобы оценить нарушение гематоэнцефалического барьера, используйте 3D T1-взвешенную визуализацию до и после инъекции контрастного агента 0,3 ммоль / кг. Выберите радиочастотную вспышку FLASH с глобальным радиочастотным возбуждением.
    1. Используйте следующие параметры последовательности в программном обеспечении MRI: время повторения = 5 мс, время эха = 1,9 мс, изотропное разрешение = 0,156 мм, поле зрения 20 х 18,7X 18,7 мм 3 , матрица 128 x 120 x 120 и угол поворота = 8.5 ° ;. Начните последовательность и подождите 1 мин 14 секунд, пока изображения не будут получены.

4. Обработка и анализ изображений

  1. Чтобы проанализировать нарушение гематоэнцефалического барьера, вычитайте трехмерные не расширенные изображения, взвешенные по T1, из расширенных изображений с T1-взвешиванием с помощью арифметического инструмента или инструмента калькулятора изображения в ImageJ. Оцените вычитание изображений для увеличения сигнала, что соответствует разрушению гематоэнцефалического барьера. 9
  2. Чтобы проанализировать объем мозга, используйте собственные 3D-массивы T1 или 3D T2. Выделите мозг из обонятельной луковицы в мозжечок, используя редактор сегментации. 10
  3. Вазогенный отек
    1. Обработайте данные релаксометрии T2 с помощью программного обеспечения MRI или используйте нелинейную процедуру подбора наименьших квадратов. 11 Данные с диффузионно-взвешенной технологией для получения карт АЦП с использованием МРТTware или FDT (см. Таблицу материалов ).
    2. Поместите области интереса вручную в разные анатомические области.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Автоматическое размещение областей, представляющих интерес, может регистрироваться неправильно из-за значительного отека мозга. Таким образом получают значения Т2 и АЦП выбранных анатомических областей.
  4. Чтобы проанализировать объем микрогеморрагии, выделите микрогеморрагии, которые выглядят как яйцевидные, темные фокусы на T2 * -уровневых наборах данных, используя редактор сегментации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У мышей C57BL / 6 первые клинические симптомы ECM наблюдаются между 6 и 10 днями после заражения спорозоитами P. berghei ANKA . ECM развивается у 60 - 80% инфицированных мышей и быстро прогрессирует до комы и смерти в течение 24-48 часов. Напротив, мыши, которые не развивают ECM, умирают после второй недели после инфицирования от тяжелой анемии из-за гиперпаразитемии. 12

В МРТ-визуализ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы описываем МРТ-протокол всего мозга для определения изменений в экспериментальной церебральной малярии. Мы считаем, что МРТ до сих пор недостаточно используется в исследованиях малярии и надеемся, что наши протоколы помогут другим исследователям. Мы хотели бы описать некоторые дополнительные моменты, которые могут быть полезны.

Если выводятся тяжелые больные мыши, то позиционирование имеет решающее значение. Из-за повышенного внутричерепного давления мыши подвержены смерти, и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С благодарностью признается экспертная техническая помощь Мириам Рейниг. AH получил финансирование от постдокторской стипендии медицинского факультета Гейдельбергского университета. MP поддерживается мемориальной стипендией фонда Else-Kröner-Fresenius. АКМ является получателем стипендии по беременности и родам Академии DZIF Немецкого центра инфекционных исследований (DZIF). JP является получателем научного центра Heidelberg Research Molecular Medicine (HRCMM) по развитию карьеры. Кроме того, мы с благодарностью признаем Джулию М. Саттлер и Фридриха Фришкнехта за предоставление образцового фильма о спорозоите.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ИзофлуранБакстера1001747для анестезии
DotaremGuebert1086923Gd-DTPA контрастное вещество; 0,5 ммоль/мл
Amira (Программа обработки изображений)FEI GroupVersion Amira 5.3.2
MATLAB MathWorks, Inc.,выпуск 2012b
FDT toolbox Библиотека программного обеспеченияFMRIBhttp://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Health Organization. World Malaria Report. , (2014).
  2. Seydel, K. B., et al. Brain swelling and death in children with cerebral malaria. N Engl J Med. 372 (12), 1126-1137 (2015).
  3. Penet, M. F., et al. Imaging experimental cerebral malaria in vivo: significant role of ischemic brain edema. J Neurosci. 25 (32), 7352-7358 (2005).
  4. de Souza, J. B., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes Infect. 4 (3), 291-300 (2002).
  5. Curfs, J. H., van der Meide, P. H., Billiau, A., Meuwissen, J. H., Eling, W. M. Plasmodium berghei: recombinant interferon-gamma and the development of parasitemia and cerebral lesions in malaria-infected mice. Exp Parasitol. 77 (2), 212-223 (1993).
  6. Carroll, R. W., et al. A rapid murine coma and behavior scale for quantitative assessment of murine cerebral malaria. PLoS One. 5 (10), (2010).
  7. Hoffmann, A., et al. Experimental Cerebral Malaria Spreads along the Rostral Migratory Stream. PLoS Pathog. 12 (3), e1005470(2016).
  8. Mueller, A. K., Behrends, J., Blank, J., Schaible, U. E., Schneider, B. E. An experimental model to study tuberculosis-malaria coinfection upon natural transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei. J Vis Exp. (84), e50829(2014).
  9. Hynynen, K., McDannold, N., Sheikov, N. A., Jolesz, F. A., Vykhodtseva, N. Local and reversible blood-brain barrier disruption by noninvasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications. Neuroimage. 24 (1), 12-20 (2005).
  10. Nag, N., Mellott, T. J., Berger-Sweeney, J. E. Effects of postnatal dietary choline supplementation on motor regional brain volume and growth factor expression in a mouse model of Rett syndrome. Brain Res. 1237, 101-109 (2008).
  11. Giri, S., et al. T2 quantification for improved detection of myocardial edema. J Cardiovasc Magn Reson. 11, 56(2009).
  12. Engwerda, C., Belnoue, E., Gruner, A. C., Renia, L. Experimental models of cerebral malaria. Curr Top Microbiol Immunol. 297, 103-143 (2005).
  13. Zhao, H., et al. Olfactory plays a key role in spatiotemporal pathogenesis of cerebral malaria. Cell Host Microbe. 15 (5), 551-563 (2014).
  14. Nacer, A., et al. Experimental cerebral malaria pathogenesis--hemodynamics at the blood brain barrier. PLoS Pathog. 10 (12), e1004528(2014).
  15. Nacer, A., et al. Neuroimmunological blood brain barrier opening in experimental cerebral malaria. PLoS Pathog. 8 (10), e1002982(2012).
  16. Pai, S., et al. Real-time imaging reveals the dynamics of leukocyte behaviour during experimental cerebral malaria pathogenesis. PLoS Pathog. 10 (7), e1004236(2014).
  17. Shaw, T. N., et al. Perivascular Arrest of CD8+ T Cells Is a Signature of Experimental Cerebral Malaria. PLoS Pathog. 11 (11), e1005210(2015).
  18. Potchen, M. J., et al. Acute brain MRI findings in 120 Malawian children with cerebral malaria: new insights into an ancient disease. AJNR Am J Neuroradiol. 33 (9), 1740-1746 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

2Time of FlightGd DTPA

Похожие статьи