Методическая статья

Измерение и моделирование Сократительная Сушка в роговом слое кожи человека

6.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55336

⸱

1 марта 2017 г.

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Binghamton University

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье описывается метод количественной оценки динамических характеристик сушки и механические свойства рогового слоя путем измерения с пространственным разрешением в плоскости сушки перемещения образцов ткани круговыми привязанных к эластомерной подложке. Этот метод может быть использован для измерения, как различные виды химической обработки изменяют высыхание и ткани механические свойства.

Аннотация

Роговой (SC) является наиболее поверхностный слой кожи. Его контакт с внешней средой означает, что этот слой ткани подвергается обоим очистительных средств и суточных колебаний в окружающей влажности; оба из которых могут изменить содержание воды в ткани. Снижение содержания воды от тяжелой барьерной дисфункции или низкой влажности может изменять жесткость SC и вызвать накопление сушильных напряжений. В экстремальных условиях, эти факторы могут привести к механическому разрыву ткани. Мы создали метод с высокой пропускной способностью количественной оценки динамических изменений в механических свойствах SC при сушке. Этот метод может быть использован для количественной оценки изменений в поведении сушки и механические свойства SC с косметическим моющим средством и увлажняющее средство лечения. Это достигается путем измерения динамических изменений в пространственно решенных плоскостных сушильных перемещений образцов круговых тканей, прилипших к эластомерным субстратом. В плоскости радиальных перемещений ПОЛУЧuired во время сушки азимутально усредненные и оснащены профилем на основе линейной упругой модели сократимости. Динамические изменения в сушильном стресса и SC модуля упругости можно извлечь из профилей подобранной модели.

Введение

Наружный самый слой эпидермиса, или роговой слой (SC) , состоит из липких клеток корнеоцитов , окруженных богатой липидами матрицей 1, 2. Состав и структурная целостность СК имеет важное значение для поддержания правильного функционирования барьера 3, который предотвращает вторжение от микроорганизмов и противостоит как механические силы и чрезмерную потерю воды 4. Способность продуктов личной гигиены для поддержания или ухудшать функцию барьера кожи представляет большой интерес для кожи здравоохранения и косметической промышленности 5. Ежедневное применение средств личной гигиены , как известно, изменяют механические свойства SC 6, 7, 8. Например, поверхностно-активные вещества, содержащиеся в косметических моющих средств может привести к значительному увеличению модуля упругости и наращиваниесушильные напряжения в СК, увеличение склонности ткани к треснуть 7, 9. Глицерин содержится почти во всех косметических увлажняющих средств может смягчить SC и уменьшить накопление сушильных напряжений 8, 10, 11, уменьшая вероятность разрыва ткани.

Подробно описано в данной статье метод позволяет количественной оценки динамических характеристик сушки и механические свойства SC сушки в контролируемых средах 7, 8. Ранее эта техника была продемонстрирована быть способным выяснении влияния различных косметических продуктов на изменения в динамическом режиме сушки и механические свойства SC ткани. Это достигается с помощью количественного анализа сушильно-индуцированной усадки ткани SC человека приклеена к подложке из мягкого эластомера, подгонка сушильных смещениях с простымсократимость модель, а затем извлечения модуля упругости и сушки напряжение от подогнанной профиля. Когда требуется тестирование нескольких образцов SC, этот способ предлагает более быстрый альтернативой одноосного тензометрии, использует значительно меньше тканей и обеспечивает более физиологически соответствующую сушку путем предотвращения испарения с образца нижней стороны.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Освобожденные утверждение (3002-13) для проведения исследований с использованием образцов обезличенной ткани в соответствии с Департаментом здравоохранения и социальных служб США правила, 45 CFR 46,101 (б) (4) была удовлетворена. Полная толщина кожи получена от плановой операции. В этой статье источник ткани 66-летний кавказских женской груди.

1. Получение Эластомер с нанесенным покровные

  1. В стеклянную пробирку емкостью 20 мл, смесь 0,107 г Sylgard 184 отвердителем с 5.893 г основания. Общая масса смеси составляет 6 г основанием с отверждением отношение агента в 55: 1.
  2. После смешивания стеклянной палочкой для обеспечения однородности, поместите флакон стекла в вакуумной камере и Дега, чтобы удалить все пузырьки.
  3. Поместите стеклянную крышку скольжения (55 мм х 25 мм) в центре спин для нанесения покрытий. Добавить ~ 1 мл смеси на центр крышки скольжения. Используйте 5000 мкл пипетки с конца отрезать ножницами. Спин пальто покрытие скольжению при 2000 оборотах в минуту в течение 60 сек.
    1. Повторите этот рrocess для создания 5-6 субстратов.
  4. Лечение Сокрытие промахов в печи в течение 12 ч при температуре 60 ° C.
  5. Используйте лезвие, чтобы частично удалить эластомерной пленки из жертвенного подложки. Используйте несмываемый маркер, чтобы отметить Topside эластомерного пленки и облученной стекла.
  6. Установите образец на инвертированный микроскоп и использовать удаленный фокус аксессуар для записи разницу в г высоты между координационными плоскостями двух марок. Это соответствует толщине эластомера подложки, ч.

2. Получение рогового слоя

  1. С помощью водяной бани или подогретой мешалка для нагревания стеклянный стакан, наполовину заполненный деионизованной водой (DW) до 60 ° C. Внутри бокса биологической безопасности, погрузить всю толщину кожи человека в воде в течение 4 мин.
  2. Немедленно перенести образец кожи в химический стакан, содержащий DW охлаждают до <10 ° С в течение 4 мин. Половина наполнения стакана минимизирует разбрызгивание биологически опасными материалами,
  3. Удалить кожу из стакана, место в чашке Петри, и аккуратно изолировать эпидермис с помощью пары изогнутых пинцетов обнюханными ткани.
  4. Поместите изолированном эпидермисе базальной стороной вниз в чашку Петри выложены марлю. Убедитесь, что базальный слой полностью контактирует с марлей.
    1. Замачивание марлю в 0,25% (вес / объем) типа IX-S поджелудочной железы свиньи раствора трипсина, растворенного в 0,1 М фосфатном буферном солевом растворе в течение 6-8 ч при комнатной температуре. Добавьте только достаточное количество трипсина в контейнере, чтобы смочить марлю.
  5. Поднимите марлю с помощью пинцета ткани и плавать его в контейнере, частично заполненной DW. Осторожно потяните SC, чтобы отделить его от марли.
  6. Вымойте рогового слоя 3-4 раза в DW для удаления остаточного эпидермальный ткань, которая остается прикрепленной к SC.
  7. Поплавок обособленное SC в растворе 0,4% глицин макс (соя) ингибитор трипсина в DW. Используйте планшетном шейкере для перемешивания ткани в течение 10 мин.
  8. Поплавок SC в чашке Петри частичнозаполнена DW. Используйте планшетном шейкере для перемешивания ткани в течение 10 мин.
  9. Сушат изолированный SC лист на ультра-тонкой пластиковой сетки в течение 48 часов при комнатной температуре (25 ° C, 40% относительной влажности (RH)).
  10. Отделить SC от сетки и вырезать отдельные образцы круговой радиус R = 3 мм, используя круглую дырокола. Отметьте центр наиболее удаленном от центра лица с небольшим спиральным метки с использованием несмываемым маркером. Это обеспечивает визуальный сигнал для распознавания TopSide КА.
    Примечание: Неизгладимое отметка должна быть применена в центре образца, где сушка деформации будет наименьшим. Это позволит свести к минимуму влияние маркера на записанных профилей сушки смещения.

3. Образец Лечение и Отложение

  1. Перемешивайте образцы SC в течение 30 мин в 15 мл DW, содержащей 90 мкл флуоресцентный маркер бусин (505/515 нм, диаметр 1 мкм, карбоксилат-модифицированный). Эти отложения бусин на поверхность SC
    Примечание: В то время как осаждение лАРГЕ количество бисера на КА может незначительно медленной сушке относительно образцов без бусинок присутствуют 12, он будет максимизировать пространственное разрешение полей деформации в плоскости , которые можно получить в дальнейшем. Поэтому выбор объема шарика добавлен должны быть сделаны специальные.
  2. Удалить образцы SC и поместить их в чашку Петри, частично заполненном DW.
  3. Частично погружать подложку в ДГ под небольшим углом 15-30 °.
  4. Чтобы закрепить края образца плавающего SC на линии контакта между подложкой и интерфейсом воды. Вертикально снятия подложки из воды будет плавно ламинировать образец SC на подложку без складок и вовлеченного воздуха пузырьки.
  5. Повторите шаг 3.4, чтобы разместить до 6 образцов SC на каждой подложке. Оставьте по крайней мере, зазор 2-3 мм между образцами и избежать образца ламинирование близко к краю подложки. Это предотвращает высыхание одного образца, влияющих на сушильных перемещений в другой.
  6. Сухие смонтированные образцы SC в лабораторных условиях в течение 60 мин. Это позволяет остаточную воду между SC и субстратом для испарения и обеспечивает полную адгезию тканей.
    Примечание: На этом этапе образцы SC можно лечить с помощью химических или косметических составов 7, 8 путем размещения подложки вверх дном в желаемом раствором в течение необходимого периода времени. Повторите шаг 3,6 раз этап обработки выполняется. После сушки, неполное сцепление SC образцов с подложкой можно проверить с помощью микроскопии в проходящем свете. Захваченные пузырьки под образцом SC или расслаиваться края будет формировать четкие вариации контраста в образце с четко определенными краями.
  7. Создание влажной камере путем размещения чашки Петри, частично заполненной жидкостью в герметично закрытом контейнере.
  8. Место субстратов в камере в течение 24 ч до уравновешивания до относительной влажности 99%. Не ставьте подложки в Petrя блюдо.

4. Контроль окружающей среды микроскоп

  1. Обеспечение контроля за состоянием окружающей среды через систему контроля влажности, подключенного к микроскопу монтируемый перфузионной камеры. Детали системы контроля влажности предоставляются на немецком языке и др. (2013) 7 и Лю и немецком языках (2015) 8.
  2. Устанавливать подложку на микроскопе, поместите перфузии камеры над подложкой и запечатать края перфузионной камеры с эластомером с помощью вакуумной смазки.
  3. После того, как установлен, уравновешивания внутреннего воздуха до 99% RH до эксперимента. Это предотвращает испарение воды до эксперимента. После того, как изображения в разделах 5 или 7 началось, уменьшить внутреннюю влажность воздуха до требуемого значения.
    Примечание: В данной статье SC образцы высушивают до 25% относительной влажности

5. визуализации в самолет Сушильные перемещениях

  1. Получение изображений образцов SC с использованием инвертированного microscoре с 1X объективом. Excite флуоресцентные шарики, используя легкий двигатель с FITC фильтром (503-530 нм излучение полосовой). Несколько образцов могут быть отображены последовательно во время сушки с использованием автоматизированного этап XY.
  2. Запись флуоресцентные и прошедшего света изображения с помощью цифровой ПЗС-камерой с разрешением 1392 х 1040 пикселей. Поле зрения каждого изображения 8.98 х 6.71 мм, что позволяет единое изображение, чтобы захватить полный образец SC. Возьмем изображения с частотой 10 мин в течение 16 часов.

6. Подготовка основания для измерения толщины

  1. В химическом вытяжном шкафу, поместите 1 мл силана (3-аминопропилтриэтоксисилан; ≥98%) в какой-то небольшой пластиковой крышкой. Поместите эластомерные субстраты из секции 1 и крышкой в ​​герметичном контейнере в течение 5 часов. Не допускать субстраты прийти непосредственно в контакт с силаном.
  2. Добавить 5 мг EDC (N - (3-диметиламинопропил) - N -ethylcarbodiimide гидрохлорид; ≥99%) в 1,5 мл трубки. Добавить 500 мкл DW к EDC. Перемешивать раствор в течение 10 с с вихревым смесителем.
  3. Добавить 0,076 г тетрабората натрия и 0,1 г борной кислоты в 20 мл DW. Смешать с помощью магнитной мешалки при 70 ° С (1 час). Добавить борную кислоту до тех пор, пока рН не является 7,4.
  4. Добавьте 20 мл боратного буфера в 50 мл центрифужную пробирку. Добавить 60 мкл 1 мкм шариков (535/575 нм, карбоксилат-модифицированного) в буфер борат. Наконец, добавьте 200 мкл раствора EDC в бутылку. Встряхните пробирку, чтобы смешать шарик раствора, а затем вылить в 10 см диаметром чашки Петри.
  5. Удалите силанизировать субстраты из контейнера и поместите их эластомер пленки стороной вниз в раствор гранулы. Делайте это медленно, чтобы предотвратить пузыри от попадания в ловушку. Две основы будет вписываться в каждой чашке Петри.
  6. Оставьте субстраты, чтобы плавать в растворе шарик в течение 45 мин.
  7. Используйте пинцет, чтобы удалить подложки из раствора шарик, затем промыть в DW для удаления несвязанных бусы.
  8. Воздух сухой подложки. Продувка сжатым воздухом надповерхность эластомер пленка уменьшает образование пятен от воды.
  9. Уплотнение субстратов в непрозрачном ящике, чтобы предотвратить фото-отбеливание гранул до осаждения SC образца.

7. визуализации Толщина SC

  1. Образцы вкладов SC на подложку с использованием раздела 3. Однако выполнить шаг 3.1 без добавления флуоресцентных бусины в DW. Кроме того, наносить каплю 5 мкл неразбавленного раствора флуоресцентного маркера шарик (505/515 нм, диаметр 0,1 мкм) до поверхности каждого осажденного образца SC с пипеткой до выполнения шага 3.6.
  2. Установить измерения толщины SC с помощью микроскопа с 40Х объективом. Измерить толщину образцов СУ с течением времени с использованием удаленного фокуса аксессуар для записи разности г высоты между двумя бортовыми фокальные плоскости слоя, расположенного на границе раздела SC-подложка, так и надводной части КА.
  3. Измерить толщину 3 областей каждого образца SC в течение периода сушки 3 ч. ТолщинаSC образцов достигает установившегося значения в течение этого времени 8.

8. Количественная и моделирование тканей Деформация

  1. Использование частиц изображения велосиметрии 13 для получения пространственно решена в плоскости сушки смещения от флуоресцентных изображений на каждом шаге по времени записанного.
  2. Использование MATLAB для получения азимутально усредненных радиальных и азимутального смещения профилей из поля смещений каждого радиально-симметричного образца SC.
    Примечание: Пример набора данных (под названием 'd.mat') и MATLAB код (под названием 'PIV-processing.m »), который выполняет как этот шаг и шаг 8.3 была представлена ​​в справочной информации.
  3. Установить профили радиального смещения к модели 7, 8, 14, 15, 16 , описывающего сушки SC в качестве сокращающейся линейной упругой циркуляциейг диск времени различной толщины, H SC, радиус R, и модуль упругости, E SC, приклеенный к деформируемой упругой подложке с модулем упругости, Е. Предположим , SC имеет отношение четко определенной и постоянной Пуассона, ν SC = 0,4 7 , 8. Получите лучшие припадки с использованием минимального подхода наименьших квадратов.
    Примечание: Модель, используемая для подгонки описывает радиальных перемещений в терминах модифицированных функций Бесселя являются:
    figure-protocol-1 (1)
    с figure-protocol-2 , figure-protocol-3 а также figure-protocol-4
    Срок figure-protocol-5 соответствует глубине проникновения заданной,
    Уравнение.
    figure-protocol-7 обозначает параметр субстрат жесткости; действительный, когда размеры выборки намного больше толщины подложки. Здесь параметры, figure-protocol-8 а также figure-protocol-9 соответственно обозначают толщину подложки коэффициент Пуассона. Коэффициент Пуассона эластомерного подложки 17 силикон ν = 0,5.
  4. Получить параметры модели а и β на каждом временном шаге от наименьших квадратов уравнения (1) для радиального профиля смещения.
    1. Наймите фитинга параметр & beta ; получить SC модуль упругости, E SC, используя выражение,
      figure-protocol-10
    2. Используйте подходящие параметр а для получения времени изменения сократительной сушки STREсс, PSC, используя выражение,
      figure-protocol-11

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 (а) показывает характерный флуоресцентное изображение образца , покрытого SC флуоресцентных бусин (раздел 3). Соответствующий передаваемый свет изображение образца показана на рисунке 1 (б) , обложенных с колчаном участком пространственно решенных сушильных смещений, образующих после 16 ч сушки при 25% относительной влажности Из - за круговой симметрии образцов, эти смещения могут быть азимутально в среднем. На рисунке 1 (с)...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой статье мы опишем метод, который может быть использован для измерения динамических характеристик сушки и механические свойства человеческого SC. Предыдущие исследования показали , что этот метод может быть использован для количественной оценки последствий условий окружающей среды и химических продуктов , обычно используемых в косметических моющих средств и увлажняющих средств на динамическое поведение сушки SC 7, 8. Есть целый ряд ключевых шагов в протокол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

У авторов нет благодарностей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Основа силиконового эластомераDow-Corning1064291
Силиконовый эластомер Отверждающий агентDow-Corning1015311
FluoSpheres Carboxylate 0.1 &микро; м желтый зеленый люминесцентный 505/515 Thermo FisherF8803
FluoSpheres Карбоксилат 1 & микро; м желтый зеленый люминесцентный 505/515 Thermo FisherF8823
FluoSpheres Карбоксилат 1 & микро; М Нил красный флуоресцентный 535/575 Thermo FisherF8819
Трипсин из поджелудочной железы свиньиSigma-AldrichT6567
Ингибитор трипсина типа II-sSigma-AldrichT9128
(3-аминопропил)триэтоксисиланSigma-Aldrich440140
Тетраборат натрияSigma-Aldrich221732
Борная кислотаSigma-AldrichB0294
Фосфатный буферный физиологический растворSigma-AldrichP7059
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-этилкарбодиимида гидрохлоридSigma-AldrichE7750
Вихревой смесительVWR58816-123
диаметр отверстия диаметром 6 ммSigma-AldrichZ708860
SOLA 6-LCR-SB Lummencor световой модульNo3526
Cfi Plan Achro Uw 1X ObjectiveNikon Plan UWMRL00012
CFI Plan Fluor 40X Oil Objective 1.3 na - 0.20  мм wdNikon Plan FluorMRH01401
инвертированный микроскоп Nikon Eclipse Ti-U Фотоаппарат NikonMEA53200
Clara-EAndorDR-328G-C02-SIL
Насадка с дистанционной фокусировкой E-RFA Ergo DesignNikon99888
Ti-S-E Моторизованная сценаNikonMEC56110

Ссылки

  1. Van Hal, D., Jeremiasse, E., Junginger, H. E., Spies, F., Bouwstra, J. Structure of fully hydrated human stratum corneum: a freeze-fracture electron microscopy study. J. Invest. Dermatol. 106 (1), 89-95 (1996).
  2. Norlén, L., Al-Amoudi, A. Stratum corneum keratin structure, function, and formation: the cubic rod-packing and membrane templating model. J. Invest. Dermatol. 123 (4), 715-732 (2004).
  3. Liu, X., Cleary, J., German, G. K. The global mechanical properties and multi-scale failure mechanics of heterogeneous human stratum corneum. Acta Biomater. , (2016).
  4. Geerligs, M. Skin layer mechanics. , Technische Universiteit Eindhoven. (2010).
  5. Farage, M. S., Miller, K. W., Maibach, H. I. Textbook of Aging Skin. , (2010).
  6. Levi, K., Kwan, A., Rhines, A. S., Gorcea, M., Moore, D. J., Dauskardt, R. H. Emollient molecule effects on the drying stresses in human stratum corneum. Br. J. Dermatol. 163 (4), 695-703 (2010).
  7. German, G. K., Pashkovski, E., Dufresne, E. R. Surfactant treatments influence drying mechanics in human stratum corneum. J. Biomech. 46 (13), 2145-2151 (2013).
  8. Liu, X., German, G. K. The effects of barrier disruption and moisturization on the dynamic drying mechanics of human stratum corneum. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 49 (13), 80-89 (2015).
  9. Levi, K., Weber, R. J., Do, J. Q., Dauskardt, R. H. Drying stress and damage processes in human stratum corneum. Int. J. Cosmet. Sci. 32 (4), 276-293 (2010).
  10. Levi, K., et al. Effect of glycerin on drying stresses in human stratum corneum. J. Dermatol. Sci. 61, 129-131 (2011).
  11. Fluhr, J. W., Darlenski, R., Surber, C. Glycerol and the skin: holistic approach to its origin and functions. Br. J. Dermatol. 159 (1), 23-34 (2008).
  12. German, G. K., et al. Heterogeneous drying stresses in stratum corneum. Biophys. J. 102 (11), 2424-2432 (2012).
  13. Willert, C. E., Gharib, M. Digital particle image velocimetry. Exp. Fluids. 10 (4), 181-193 (1991).
  14. Mertz, A. F., et al. Scaling of traction forces with the size of cohesive cell colonies. Phys. Rev. Lett. 108 (19), 1-5 (2012).
  15. Banerjee, S., Marchetti, M. C. Substrate rigidity deforms and polarizes active gels. Euro Phys. Lett. 96 (2), 28003(2011).
  16. Edwards, C. M., Schwarz, U. S. Force localization in contracting cell layers. Phys. Rev. Lett. 107 (12), 128101(2011).
  17. Cesa, C., et al. Micropatterned silicone elastomer substrates for high resolution analysis of cellular force patterns. Rev. Sci. Instrum. 78 (3), 34301(2007).
  18. Wu, K. S., Van Osdol, W. W., Dauskardt, R. H. Mechanical And Microstructural Properties Of Stratum Corneum. Mater. Res. Soc. 724, 27-33 (2002).
  19. Yuan, Y., Verma, R. Measuring microelastic properties of stratum corneum. Colloids Surf. B. 48 (1), 6-12 (2006).
  20. Christensen, M. S., Hargens, C. W., Nacht, S., Gans, E. H. Viscoelastic properties of intact human skin: instrumentation, hydration effects, and the contribution of the stratum corneum. J Invest. Dermatol. 69 (3), (1977).
  21. Pailler-Mattei, C., Bec, S., Zahouani, H. In vivo measurements of the elastic mechanical properties of human skin by indentation tests. Med. Eng.Phys. 30 (5), 599-606 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи