Моделирование рака яичников Многоклеточная Сфероид Поведение в микроустройство Dynamic 3D перитонеального

Краткое содержание

Для изучения прогрессии опухоли яичников в физиологически соответствующей модели, многоклеточные сфероиды культивировали в микроустройство в смоделированных потоке текучей среды. Эта динамическая 3D модель эмулирует внутрибрюшного среду с клеточными и механических компонентов, где происходит яичников раковых метастаз.

Аннотация

Рак яичников характеризуется широким перитонеального метастазирования, с опухолевыми сферами обычно встречаются в злокачественных асцит. Это связано с плохими клиническими результатами и в настоящее время не хватает эффективного лечения. И трехмерные (3D) окружающая среда и динамические механические силы являются очень важными факторами в этом метастатического каскада. Тем не менее, традиционные клеточные культуры не Повторим этот естественный микросреды опухоли. Таким образом, в естественных условиях -как модели , которые могут эмулировать внутрибрюшной среды имеют очевидное значение. В этом исследовании, новая платформа Микрожидкостных брюшины была создана, чтобы имитировать ситуацию яичников сфероидов рака в брюшной полости во время метастазирования. Яичниковые сфероидов рака, сгенерированные под неприлипающими состоянии культивировали в микроканалов, покрытых перитонеального мезотелиальной клеток, подвергнутых физиологически соответствующего напряжения сдвига. Таким образом, эта динамика 3D-рак яичников Мезотелия микрофонrofluidic платформа может предоставить новые знания по основам биологии рака и служить в качестве платформы для потенциального скрининга и разработки лекарственных средств.

Введение

Рак яичников является наиболее летальной гинекологический рак и характеризуется широко распространенной перитонеального распространения и образование злокачественных асцит ^1. Эта обширная перитонеальный метастаз представляет собой серьезную клиническую проблему и связано с плохими клиническими результатами. В отличие от большинства твердых карцином, которые метастазируют через кровь, рак яичников, прежде всего, рассеивает в брюшную полость. Опухолевые клетки существуют как многоклеточные агрегаты / сфероиды в процессе метастазирования ^2. Тот факт , что подвеска культура может обогатить овариальных стволовых рак / опухолевые инициирующие клетки далее предположить , что эти сфероиды могут быть связаны как с опухолевой агрессивностью и усиливается химиорезистентность ^{3, 4.} Существуют различия в ответ наркотиков между 2D и 3D культур, которые , предположительно , имеют разные молекулярные механизмы ^5.

_content "> Существенное взаимодействие с мезотелием создает первичный микросреду для прогрессии опухоли яичников. Эти мезотелиальной клетки лежат на внеклеточного матрикса (ЕСМ), где фибронектин является вездесущим компонентом. Связь между увеличением экспрессии мезотелиальной клеток, полученных фибронектина и прогрессирование опухоли было показано. фибронектина в изобилии присутствует в злокачественных асцит ^{6, 7.} Яичниковые раковые клетки также способны индуцировать секрецию фибронектина из мезотелиальной клеток для того , чтобы способствовать раннему метастазирования рака яичников ^8.

Все новые данные показывают , что механические стимулы, в том числе напряжения сдвига, могут модулировать морфологии клеток, экспрессию генов, и, таким образом, фенотипы опухолевых клеток ^{9, 10, 11.} Как злокачественного асцита развивать и накапливать в течение тumor прогрессии, овариальные опухолевые клетки подвергаются потока жидкости и в результате напряжения сдвига. Ряд групп, включая и наши, показали влияние напряжения сдвига на прогрессирование рака яичников, в том числе модификации цитоскелета, эпителиально-к-мезенхимальных переходы и стволовости ^{12 рака, 13, 14, 15.} Таким образом, физиологически соответствующие микросреда имеет важное значение для исследования опухоли перитонеальные метастазы. Однако современные гидродинамические культурах клеток имеют ограничения на пародирование и контроль постоянной, низкий, физиологически соответствующее напряжение сдвига ^{16, 17, 18, 19.} Обычные в пробирке подходы , ориентированные либо на клеточном или механической среде по - прежнему ограничены вимитируя сложность внутрибрюшинного микросреды с правильной физиологической значимости.

Вот для того, чтобы спроектировать новую модель брюшины, чтобы преодолеть ограничения традиционных стратегий и продвигать исследование внутрибрюшинного отделение в метастазирования рака, 3D Микрожидкостных на основе платформы с регулируемым потоком жидкости был разработан. В этой модели, овариальные сфероидов рака совместно культивировали с первичными перитонеальных мезотелиальных клеток человека в микрофлюидальных чипсов при непрерывном жидкостный поток (рисунок 1А). Мезотелиальной клетки высевали на фибронектином. Неприлипающие яичников сфероидов рака были посеяны в микроканалов с непрерывным потоком среды перфузируемом с помощью шприца. Оба 3D окружающей среды и динамические механические силы являются очень важными факторами, метастатического каскада. Эта платформа может быть использована для исследования внутрибрюшной микросреду с точки зрения комплексного CELlular и совместного взаимодействия культур, а также в отношении динамических механических сигналов.

Протокол

1. Микрожидкостных Конструкция устройства и изготовление

1. Микрожидкостных мастер-дизайн
   1. Дизайн и рисовать микрожидкостных шаблон канала с любой компьютерной системы автоматизированного проектирования (САПР).
      Примечание: Как правило, САПР чертеж может быть отправлен в фотошаблон компании для производства фотошаблона. Микрожидкостных конструкция состоит из трех идентичных параллельных каналов, каждый со следующими размерами: 4 мм × 25 мм × 250 мкм (ширина × длина × высота) и установить 2 мм друг от друга. На обоих концах канала были разработаны с 127 ° углами для облегчения жидкости вход и выход (рис 1B). Канал , используемый в данном протоколе сообщалось в предыдущей публикации ^13.
   2. Промыть кремниевой пластины с ультразвуком (500 Вт / 42 кГц), в ацетоне, изопропанола и деионизированной воды в течение 15 минут каждый. Сушат пластины при использовании сжатого газа азота. Нагреть кремниевой пластины на горячей плите при 250 ° С в течение 15 мин полностью высохнутьЭто.
   3. Спин-пальто слой SU-8 2075 фоторезиста (125 мкм толщиной) на кремниевой пластине со скоростью прядения 1800 оборотов в минуту. Выпекать фоторезиста покрытием пластин непосредственно на горячей плите при температуре 65 ° С, а затем при температуре 95 ° C, для удаления избытка растворителя, в течение 5 и 25 мин, соответственно (в соответствии с инструкцией продукт SU-8).
   4. Повторите шаг 3 и спин-пальто еще один слой SU-8 2075 фоторезиста, чтобы получить конечную толщину 250 мкм. Выпечка фоторезиста покрытием пластины непосредственно на горячей плите при температуре 65 ° С в течение 7 мин и затем при 95 ° С в течение 30 мин. Медленно охладить пластины до комнатной температуры. Не охлаждать воздухом под давлением.
   5. Выравнивание и поставить фотошаблон непосредственно на верхней части пластины. Подвергать его воздействию УФ света в течение 20 секунд, чтобы сшивать образец.
   6. Выпекать пластины с фоторезистом при 65 ° С и 95 ° С на плитке в течение 5 и 12 мин, соответственно, для удаления растворителя для полимеризации (в соответствии с инструкцией продукт SU-8). Затем охлаждают до облаткукомнатная температура.
   7. Удалите несшитый фоторезиста путем погружения пластины в СУ-8 разработчика в течение 25 мин. Промыть пластины с изопропилового спирта и высушить его сжатым воздухом.
      Примечание: Если млечный раствор наблюдается при промывая изопропанолом, что указывает на неполное развитие, погрузить пластину обратно в СУ-8 разработчика в течение более длительного времени разработки.
   8. Поместите пластину на горячей плите при 180 ° С в течение 10 мин, чтобы излечить образец от потенциальных трещин. Выключите горячую плиту и медленно охладить пластины до комнатной температуры, оставив его на горячей плите.
   9. Добавляют несколько капель трихлор (1H, 1H, 2H, 2H-перфтороктилтриэтоксисилана) силана в флакон крышкой. Поместите флакон крышкой в ​​вакуумной сушилке. Поместите пластину рядом с флакон крышкой, чтобы silanize пластины в течение 10 мин.
2. изготовление чипа PDMS
   1. Оберните пластину с алюминиевой фольгой, чтобы создать держатель.
   2. Смешайте полидиметилсилоксана (PDMS) основы и отвердителя в соотношении 10: 1 массс помощью центробежного смесителя под функцией смешивания и дегазации. Поток смесь PDMS медленно на пластину на высоте около 5 мм. Дегазировать PDMS под вакуумом в течение 40 мин. Вылечить PDMS в духовке при температуре 65 ° С в течение 2 ч.
   3. Тщательно очистите плиту PDMS выключить мастера и обрезать PDMS вдоль каналов до тех пор, пока размер предметного стекла. Пробить PDMS с трепанобиопсия 1 мм, чтобы создать входы и выходы устройства.
   4. Очистите поверхность PDMS с воздухом под давлением и клейкой лентой для удаления пыли и мусора PDMS.
   5. Поместите плиту PDMS, с боковым каналом был обращен вверх, в очистителя плазмы. Поместите чистую предметное стекло в пылесос плазмы наряду с плитой PDMS.
   6. Лечить PDMS и предметное стекло под воздушной плазмы на высоком уровне РФ в течение 1 мин. Свяжите PDMS к стеклу, чтобы создать необратимую ковалентную связь.
   7. Поместите чип PDMS на горячей плите при 150 ° С в течение 1 ч, чтобы повысить прочность соединения и вернуть hydrophobicity из PDMS перед использованием.

2. Посев Микрожидкостных чип с первичными перитонеальном Мезотелиальной клеток (НРМС)

1. Фибронектина покрытие микроканалов
   1. Стерилизовать микрожидкостных канал с 30 мкл 75% этанола. Удаления этанола и дважды полоскание с 30 мкл стерилизованной фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) с использованием кончика пипетки. Тщательно аспирата PBS в каналах.
      Примечание: Для того, чтобы свести к минимуму загрязнение, Микрожидкостных культура клеток должна быть тщательно проводить при полностью асептических условиях через использование колпака с ламинарным потоком.
   2. Подготовьте 10 мкг раствора / мл фибронектина в бессывороточной M199: MCDB105 (1: 1) средний. Пипетировать решение вверх и вниз, с особой тщательностью, чтобы избежать образования пузырьков. Не вихрь.
   3. Медленно заполнить каждый канал с 30 мкл раствора фибронектина. Уплотнение каналы с лентой и инкубировать чип в течение ночи при температуре 4 ° С.
3. Культура НРМС в 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) , культуральной среды (M199: MCDB105 не с добавлением 10% FBS и 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина) в атмосфере 5% СО ₂ при температуре 37 ° С до 80% слияния.
4. Промыть НРМС с 3 мл PBS и Trypsinize с 2 мл 0,05% трипсина / 0,01% раствора в течение 30 с ЭДТА (TE). Нейтрализовать с 4 мл 10% -ного среды ФБС культуры и спином вниз клеток при 1000 х г в течение 5 мин.
5. Ресуспендируют НРМС в 2 мл 10% -ной среды ФБС культуры. Подсчитайте количество клеток с гемоцитометра и регулировать концентрацию клеток до 3,5 × 10 ⁶ / мл.
6. Подогреть фибронектина покрытием микрожидкостных чип в C инкубаторе 37 ° в течение 5 мин перед использованием. Полностью аспирация решение фибронектина.
7. Медленно пипеткой 30 мкл НРМС суспензии в каждый канал. Уплотнение каналов с лентой и размещения устройств в CO ₂ инкубаторе в течение ночи.

1. Образование Рак яичников сфероида
   1. Поддерживать человека эпителиального рака яичников клеток линии SKOV-3 в 5% FBS культуральной среды (M199: MCDB105 с 5% FBS и 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина) при 5% CO ₂ при 37 ° С до экспериментов.
   2. Растворить 0,5% агарозы в стерилизованной воде при кипячении. Распределить 50 мкл раствора агарозы в каждую лунку 96-луночных планшетов. Оставьте пластины в вытяжном шкафу в течение 20 мин, чтобы позволить агарозном затвердевать; Затвердевший агарозы покрытие лунки может предотвратить адгезию клеток и указывает на то, что плиты готовы к использованию.
   3. Промыть клетками SKOV-3 с 3 мл PBS. Trypsinize с 2 мл раствора TE в течение 3 мин. Нейтрализовать с 4 мл 5% -ного среды ФБС культуры и спином вниз клеток при 1000 х г в течение 5 мин.
   4. Подсчитайте число SKOV-3 клеток с помощью гемоцитометра и клетки вновь суспендируют в 5% FBS культуральной среде при плотности 5000 клеток / мл. Трansfer 200 мкл суспензии клеток в каждую агарозы-лунке и культивированию в 5% СО ₂ при 37 ° С в течение 48 ч.
2. Рак сфероид загрузки
   1. Передача рака сфероиды в центрифужную пробирку на 50 мл предварительно смачивать 1 мл бессывороточной среды и спином вниз со скоростью 750 мкг в течение 5 мин.
      Примечание: Предварительно смачивают пипеток и центрифужные пробирки могут предотвратить нежелательное присоединение сфероида на центрифужные пробирки.
   2. Приготовьте 2,5 мкг / мл раствора 5-chloromethylfluorescein диацетатной (CMFDA) в бессывороточной M199: MCDB105 среду. Ресуспендируют рака сфероиды в 1 мл раствора CMFDA и инкубировать при 37 ° С в течение 30 мин. Центрифуга при 750 мкг в течение 5 мин.
   3. Промыть сфероидов рака с 2 мл не содержащей сыворотки среды и центрифуге при 750 мкг в течение 5 мин. Повторите этот шаг в два раза для удаления оставшейся флуоресцентного красителя из среды.
      Примечание: Флуоресцентный сигнал может быть сохранен в сфероиды в течение более чем 96 часов.
   4. Ресуспендируют раксфероиды в бессывороточной M199: MCDB105 средних и подсчитать число сфероид с помощью гемоцитометра. Регулировка концентрации до 2000 сфероидов / мл не содержащей сыворотки среде.
   5. До сфероида загрузки, медленно вводят 100 мкл бессывороточной M199: MCDB105 среды, чтобы смыть не-придерживалась мезотелиальной клетки внутри каналов.
      Примечание: быстрый впрыск, стремление, или образование пузырей приведет к отрыву мезотелиальной монослоя.
   6. Нагрузка 30 мкл флуоресцентного меченных сфероида суспензии в каждый канал. Поместите микрожидкостных чип в CO ₂ инкубаторе.
3. Платформа Перфузия сборки и совместного культивирования
   1. Приложить шприц с загруженными свежей, свободной от сыворотки M199: MCDB105 среде до 1 м длиной трубы.
   2. Поместите шприц на шприцевой насос и закрепить поршень и корпус шприца. Установить шприцевой насос в горизонтальном положении на той же высоте, что и микрожидком чип внутри инкубатора.
      NОТЕ: Число и размер шприцев зависит от количества используемых каналов и продолжительность эксперимента.
   3. Быстро влить всю трубку со средой, нажав и удерживая кнопку перемотки вперед, пока среда не переливается трубку.
   4. Запуск инъекции с требуемой скоростью потока. Оценить напряжение сдвига стены, используя следующее уравнение:
      
      где τ представляет собой напряжение сдвига стенки внутри камеры, ǫ = скорость потока, р = вязкость (0,01 г) ^-1 КМВ; Высота камеры ч = расход, а W = ширина потока камеры.
   5. Подсоедините силиконовую трубку к впускному отверстию канала. Поместите избыточную впускной трубки в инкубаторе, чтобы гарантировать, что среда, подогревают перед тем вводили в каналы. Для облегчения соединения между трубой и каналом, соответствующие разъемы могут быть выбраны. Примечание: Осторожно, чтобы не вводить какие-либо пузырь на СиринGE, трубы и соединения.
   6. Подключение выхода канала в конической трубе 50-мл для сбора вытекания среды с короткой выходной трубкой.
      Примечание: Полная динамическая система совместного культивирования показана на рисунке 1D.

4. Наблюдение НРМС и рака сфероидов после перфузии

1. Обратите внимание на НРМС и рак сфероиды с ярко-поле или флуоресцентного микроскопа и делать снимки через 1 ч перфузии.

Результаты

Используя этот протокол, микрожидком платформа была создана для моделирования яичников сфероидов рака с мезотелиальной клеток в условиях гидродинамической. Первичные перитонеальные мезотелиальные клетки человека культивировали в микроустройство в течение 16 ч и наблюдают под ярко-поле микроскопа. Как показано на фигуре 2А, нижний канал был успешно покрыт монослоем НРМС. Важно отметить, что образование пузырьков во время фибронектина или НРМС кучность приведет к отказу ка...

Обсуждение

Этот анализ предлагает гибкую и физиологически соответствующую модель, которая может быть объединена с различными биохимическими и клеток на основе анализов, в том числе, но не ограничиваясь ими, анализов адгезии, мезотелиальной анализов очистки, а также скрининга лекарственных средств. Он может быть применен к оценке влияния внутрибрюшинного микросреды на прогрессирование рака. Тем не менее, некоторые экспериментальные условия , возможно , необходимо оптимизировать, в зависимости от целей проекта (например, ко...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Кремниевая пластина	University wafer	#1196	100 мм
SU-8 2075 фоторезист	Разработчик Microchem
SU-8	Microchem	108-65-6
Трихлор (1H, 1H, 2H, 2H-перфтороктил) силан	Sigma	448931
Sylgard 184	Dow Corning	1673921	полидиметилсилоксан (PDMS) + набор отвердителя
Biopsy punch	Miltex	33-31AA	Диаметр 1 мм
Плазменный очиститель	Harrick Plasma	PDC-002
Полиэтиленовая трубка	SCI	BB31695-PE/5	0,86 мм (внутренний диаметр)
Шприц	Terumo
Шприцевой насос	Более длинный прецизионный насос	LSP01-2A
Medium 199	Invitrogen	31100-035	Добавить 2,2 г/л бикарбоната натрия
MCDB 105 Medium	Sigma	M6395
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Гиклон	SH30068,02
Пенициллин/стрептомицин	Инвитроген	15070-063
Трипсин ЭДТА раствор	Gibco	25300-054	0,05% Трипсин - 0,01% ЭДТА, фенол красный
Фибронектин человека	BD	354008
Агароза	Invitrogen	15510-027
5-хлорметилфлуоресцеин диацетат	Life technologies	C7025	Green CMFDA
CO2 инкубатор	SANYO	MCO-18AIC
Centrifuge	Hitachi	CT15RE
Флуоресцентный микроскоп	Nikon		Модель: 80i или ECLIPSE Ti; программное обеспечение: SPOT
SKOV-3& НБСП;			Подарок от доктора Н. Ауэрсперга (Университет Британской Колумбии)