Method Article

Мультимеру-PAGE: метод для захвата и Разрешающая белковых комплексов в биологических образцах

DOI:

10.3791/55341

⸱

May 5th, 2017

 ,  ,  , 
1Physiology, Michigan State University, 2Center for Neurodegenerative Science Van Andel Institute, 3Pharmaceutical Sciences, Wayne State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлен способ стабилизации и отделения нативных белковых комплексов из немодифицированного тканевого лизата с использованием реакционноспособного по аминогруппе белкового сшивающего агента, связанного с новой двухмерной системой электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Есть много хорошо разработанных методов для очистки и изучения одиночных белков и пептидов. Тем не менее, большинство клеточных функций осуществляется сетей взаимодействующих белковых комплексов, которые зачастую трудно исследовать, поскольку их связывания не является ковалентной и легко возмущается методами очистки. Эта работа описывает способ стабилизации и разделения нативные белковые комплексы из немодифицированной ткани с помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном геле. Ткань лизат наносили на неденатурирующем сине-родной полиакриламидном геле, а затем электрический ток подается до тех пор, пока белок мигрирует на короткое расстояние в геле. Полоска геля, содержащая перенесенный белок затем вырезала и инкубировала с дитиобисом аминного реакционноспособным сшивающим реагентов (сукцинимидилпропионат), который ковалентно стабилизирует белковые комплексы. Полосы гель, содержащий поперечно-сшитые комплексы затем отливают в сульфат полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и третон комплексы разделены полностью. Метод основан на методах и материалах, знакомых большинству молекулярных биологов, это означает, что это недорогой и простой в освоении. В то время как он ограничен в своей способности адекватно отделить чрезвычайно крупные комплексы, и не было универсально успешным, метод был в состоянии захватить широкий спектр хорошо изученных комплексов, и, вероятно, применимо ко многим системам, представляющим интерес.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нормальная клеточная функция зависит от белок-белковых взаимодействий , 1, 2. В результате болезнь человека часто отмечается возмущениями в сборке и поведении различных белковых комплексов 3. Способность характеризовать такие взаимодействия Поэтому крайне важно. Современные средства обнаружения этих взаимодействий требует очистки белков-мишеней, часто с последующим раскрывающихся их взаимодействующих партнеров. Обычная очистка осуществляется дифференциальным центрифугированием, осаждением и / или хроматографически 4. Эти методы требуют больших затрат време....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка ткани

  1. Подготовьте 10 мл 4x BN-PAGE буфера для образцов (200 мМ бис (2-гидроксиэтил) амино-трис (гидроксиметил) метан (Bis-Tris), 200 мМ NaCl, 40% вес / объем глицерина, 0,004% Ponceau S, рН 7,2 ).
    Примечание: Этот исходный раствор может быть изготовлен заранее и хранили при 4 ° С.
  2. Разбавляют 250 мкл 4х буфера для образца в 750 мкл дН 2 O , содержащей 1x коммерческий коктейль ингибитора протеазы. Vortex и холод на льду.
  3. Однородные 20 мг ткани-мишени в 1 мл 1x охлажденного льда BN-PAGE образец буфере с 30 ударами чистого Даунсом гомогенизатора.
    Примечание: Для этого демонстрационного эксперимента, тк....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом демонстрационном эксперименте мультимер-PAGE проводили на всем лизате мозга крысы. Полученные в результате этого выделенные белки переносили на поливинилиденфторид дифторида (PVDF) мембраны, а затем зондировали с использованием антител против белков, которые, как известно, образуют комплексы. На рисунке 1 показана проверка протокола двумя способами. Во- первых, мы показали , что эти сшитые белки расщепляться путем добавления восстанавливающего агента, то есть набл.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Белок-белковые взаимодействия являются важными для каждой задачи живых существ выполнять. Из-за этого, они являются предметом пристального внимания и исследования. Мультимер-страница представляет собой новый способ для захвата, разделения и анализа широкого спектра белковых комплексов. Ранее мы показали его применимость к изучению oligimerization болезненного-ассоциированного белка альфа-синуклеина 11. Тем не менее, он является расширяемым многих белковых комплексов, как показано на рисун.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поддерживается DA034783 NIH / NIDA. Мы благодарим Брайан А. Киллингера за техническую помощь с мультимерами-ПААГОМ.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<сильно>Химикаты
&эпсилон;-Аминокапроновая кислотаSigmaA2504
АкриламидAcros Organics164855000токсичный.
Акриламид/бисакриламид 37,5:1 (40% Т стоковый раствор)BioRad161-0148Токсичный.
Персульфат аммонияSigmaA3678
Анти кролика IgG-HRP от козыSanta Cruz Biotechnologysc-2004
Набор для анализа бицинхониновой кислотыThermofisher23225
Bis-trisSigmaB9754
Бычий сывороточный альбуминSigmaA9647
БутанолFisher ScientificA399-1
Набор хемилюминесцентного субстратаThermoFisher24078
Coomassie blue G-250Sigma-AldrichB0770
DigitoninSigmaD141Toxic.
ДиметилсульфоксидFisher ScientificD128-1
Дитиобис(сукцинимидилпропионат)Thermo Scientific22585
Сухое обезжиренное молокоLabScientificM0841
ГлицеринSigmaG9012
ГлицинFisher ScientificBP381-5
Коктейльингибиторов протеазыThermofisher78430
Соляная кислотаFisher ScientificA144SI-212Для титрования. Едкий.
МетанолFisher ScientificA412-4Для активации мембраны PVDF. Токсичный.
Моноклональный анти α-синуклеин IgG из кроликаSanta Cruz Biotechnologysc-7011-R
N,N,N',-тетраметилэтилендиаминSigmaT9281
N,N'-метиленбисакриламидAcros Organics16479токсичный.
NP40Boston BioproductsP-872
Polysorbate 20 (tween-20)Fisher ScientificBP337-500
Мембраны для переноса поливинилиденфторидаThermo Scientific88518
Ponceau SSigmaP3504
Хлорид калияFisher ScientificP217-3
Фосфат калия одноосновнойкоктейльP9791
Thermo Scientific88265
SDS раствор (10% по объему)BioRad161-0416
Хлорид натрияFisher ScientificBP358-212
Додецилсульфат натрияSigmaL37771
Одноосновной фосфат натрияFisher ScientificBP329-1
TricineSigmaT0377
Трис базаFisher ScientificBP152-500
Tris-HCl (0,5 М буфер, pH 6,8)BioRad161-0799
Tris-HCl (1,5 М буфер, pH 8,8)BioRad161-0798
Name<strong>Company Каталожный номерComments
Instruments
GE Imagequant LAS 4000GE Healthcare28-9558-10
Программное обеспечение ImageJ NIH
Synergy H1 микропланшетный ридерBioTek
Gel Former + StandBiorad
Центрифуга Microfuge 22RBeckman Coulter
2 мл Гомогенизатор
Вихревой смесительFisher Scientific
Ультразвуковой гомогенизатор тканейFisher ScientificFB120220
ингибиторов протеазы Sigma

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
  2. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Complex AnalysisNative PAGEIn gel Cross linkingSDS PAGE SeparationBlue Native GelGel Re castingDSP Cross linkerTissue Lysate PreparationImmunoblot DetectionMolecular Weight Ladder

Related Articles