Представлен способ стабилизации и отделения нативных белковых комплексов из немодифицированного тканевого лизата с использованием реакционноспособного по аминогруппе белкового сшивающего агента, связанного с новой двухмерной системой электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мультимеру-PAGE: метод для захвата и Разрешающая белковых комплексов в биологических образцах
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Есть много хорошо разработанных методов для очистки и изучения одиночных белков и пептидов. Тем не менее, большинство клеточных функций осуществляется сетей взаимодействующих белковых комплексов, которые зачастую трудно исследовать, поскольку их связывания не является ковалентной и легко возмущается методами очистки. Эта работа описывает способ стабилизации и разделения нативные белковые комплексы из немодифицированной ткани с помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном геле. Ткань лизат наносили на неденатурирующем сине-родной полиакриламидном геле, а затем электрический ток подается до тех пор, пока белок мигрирует на короткое расстояние в геле. Полоска геля, содержащая перенесенный белок затем вырезала и инкубировала с дитиобисом аминного реакционноспособным сшивающим реагентов (сукцинимидилпропионат), который ковалентно стабилизирует белковые комплексы. Полосы гель, содержащий поперечно-сшитые комплексы затем отливают в сульфат полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и третон комплексы разделены полностью. Метод основан на методах и материалах, знакомых большинству молекулярных биологов, это означает, что это недорогой и простой в освоении. В то время как он ограничен в своей способности адекватно отделить чрезвычайно крупные комплексы, и не было универсально успешным, метод был в состоянии захватить широкий спектр хорошо изученных комплексов, и, вероятно, применимо ко многим системам, представляющим интерес.
Введение
Нормальная клеточная функция зависит от белок-белковых взаимодействий , 1, 2. В результате болезнь человека часто отмечается возмущениями в сборке и поведении различных белковых комплексов 3. Способность характеризовать такие взаимодействия Поэтому крайне важно. Современные средства обнаружения этих взаимодействий требует очистки белков-мишеней, часто с последующим раскрывающихся их взаимодействующих партнеров. Обычная очистка осуществляется дифференциальным центрифугированием, осаждением и / или хроматографически 4. Эти методы требуют больших затрат време....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка ткани
- Подготовьте 10 мл 4x BN-PAGE буфера для образцов (200 мМ бис (2-гидроксиэтил) амино-трис (гидроксиметил) метан (Bis-Tris), 200 мМ NaCl, 40% вес / объем глицерина, 0,004% Ponceau S, рН 7,2 ).
Примечание: Этот исходный раствор может быть изготовлен заранее и хранили при 4 ° С. - Разбавляют 250 мкл 4х буфера для образца в 750 мкл дН 2 O , содержащей 1x коммерческий коктейль ингибитора протеазы. Vortex и холод на льду.
- Однородные 20 мг ткани-мишени в 1 мл 1x охлажденного льда BN-PAGE образец буфере с 30 ударами чистого Даунсом гомогенизатора.
Примечание: Для этого демонстрационного эксперимента, тк....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этом демонстрационном эксперименте мультимер-PAGE проводили на всем лизате мозга крысы. Полученные в результате этого выделенные белки переносили на поливинилиденфторид дифторида (PVDF) мембраны, а затем зондировали с использованием антител против белков, которые, как известно, образуют комплексы. На рисунке 1 показана проверка протокола двумя способами. Во- первых, мы показали , что эти сшитые белки расщепляться путем добавления восстанавливающего агента, то есть набл.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Белок-белковые взаимодействия являются важными для каждой задачи живых существ выполнять. Из-за этого, они являются предметом пристального внимания и исследования. Мультимер-страница представляет собой новый способ для захвата, разделения и анализа широкого спектра белковых комплексов. Ранее мы показали его применимость к изучению oligimerization болезненного-ассоциированного белка альфа-синуклеина 11. Тем не менее, он является расширяемым многих белковых комплексов, как показано на рисун.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Поддерживается DA034783 NIH / NIDA. Мы благодарим Брайан А. Киллингера за техническую помощь с мультимерами-ПААГОМ.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Химикаты | |||
| &эпсилон;-Аминокапроновая кислота | Sigma | A2504 | |
| Акриламид | Acros Organics | 164855000 | токсичный. |
| Акриламид/бисакриламид 37,5:1 (40% Т стоковый раствор) | BioRad | 161-0148 | Токсичный. |
| Персульфат аммония | Sigma | A3678 | |
| Анти кролика IgG-HRP от козы | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Набор для анализа бицинхониновой кислоты | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Бычий сывороточный альбумин | Sigma | A9647 | |
| Бутанол | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Набор хемилюминесцентного субстрата | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Диметилсульфоксид | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Дитиобис(сукцинимидилпропионат) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Сухое обезжиренное молоко | LabScientific | M0841 | |
| Глицерин | Sigma | G9012 | |
| Глицин | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Коктейль | ингибиторов протеазыThermofisher | 78430 | |
| Соляная кислота | Fisher Scientific | A144SI-212 | Для титрования. Едкий. |
| Метанол | Fisher Scientific | A412-4 | Для активации мембраны PVDF. Токсичный. |
| Моноклональный анти α-синуклеин IgG из кролика | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',-тетраметилэтилендиамин | Sigma | T9281 | |
| N,N'-метиленбисакриламид | Acros Organics | 16479 | токсичный. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Мембраны для переноса поливинилиденфторида | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Хлорид калия | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Фосфат калия одноосновной | коктейль | P9791 | |
| Thermo Scientific | 88265 | ||
| SDS раствор (10% по объему) | BioRad | 161-0416 | |
| Хлорид натрия | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Додецилсульфат натрия | Sigma | L37771 | |
| Одноосновной фосфат натрия | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Трис база | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0,5 М буфер, pH 6,8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1,5 М буфер, pH 8,8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name< | strong>Company | Каталожный номер | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| Программное обеспечение ImageJ NIH | |||
| Synergy H1 микропланшетный ридер | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Центрифуга Microfuge 22R | Beckman Coulter | ||
| 2 мл Гомогенизатор | |||
| Вихревой смеситель | Fisher Scientific | ||
| Ультразвуковой гомогенизатор тканей | Fisher Scientific | FB120220 |
Ссылки
- Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
