Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Качественный и количественный анализ иммунной синапсов в системе человека с использованием визуализации проточной цитометрии

11.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55345

⸱

7 января 2019 г.

 ,  , 
1Institute of Immunology, Section Molecular Immunology, University of Heidelberg

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем полный рабочий процесс для качественного и количественного анализа иммунных синапсов между основной человеческий Т-клеток и антиген представляющих клеток. Метод основан на визуализации проточной цитометрии, который позволяет приобретение и оценки нескольких тысяч клеток изображений в течение относительно короткого периода времени.

Аннотация

Иммунная синапса — это область коммуникации между Т-клеток и антиген представляющих клеток (БТР). Т-клетки поляризовывайте поверхности рецепторы и белков к иммунной СИНАПС для обеспечения стабильного привязки и сигнал обмен. Классическая конфокальный, TIRF или суперразрешением микроскопии были использованы для изучения иммунной синапсе. Поскольку эти методы требуют ручной изображения приобретение и длительным количественной оценки, изображений редких событий является сложной задачей. Здесь мы описываем рабочий процесс, который позволяет морфологический анализ десятки тысяч клеток. Иммунные синапсы наведены между первичной клетки человека T в Пан лейкоцита препаратов и золотистый стафилококк энтеротоксинов B SEB-загружен Раджи клетки как БТР. Получение изображения производится с изображений проточной цитометрии, также называется микроскопии в поток, который сочетает в себе черты проточный цитометр и флуоресцентным микроскопом. Предоставляется полный стробирования стратегию для выявления клеток T/APC пары и анализа иммунной синапсы. Как этот рабочий процесс позволяет анализ иммунной синапсов в подготовке неочищенную Пан лейкоцитов и поэтому требует лишь небольшого количества крови (т.е., 1 мл), он может применяться для образцов от пациентов. Важно отметить, что несколько образцов можно подготовлен, измеряется и проанализированы параллельно.

Введение

Т-клетки являются основными регуляторами адаптивной иммунной системы и активируются через антигенные пептиды, которые представлены в контексте комплексов гистосовместимости (MHC). Полная активация Т-клеток требует двух сигналов, компетенции сигнал через антиген специфические Т-клеточных рецепторов (TCR) / CD3 комплекса и костимуляторных сигнала через аксессуар рецепторов. Обе сигналы генерируются путем непосредственного взаимодействия Т-клеток с антиген представляющих клеток (БТР). Зрелые БТР обеспечивают компетенции сигнал для активации Т-клеток через MHC-пептидных комплексов, и они выражают костимуляторных лигандами (например, CD80 или CD86) заверить прогрессирование Т-клеток активации1. Одной из важных функций костимуляции является перераспределение актина цитоскелета2,3,4. Корковых F-актина относительно статичной в отдыхая Т-клеток. Т-клеточная стимуляция через антиген подшипник БТР приводит к глубокой перестройки Цитоскелет актина. Актина динамика (т.е., быстро актина полимеризации/деполимеризации круги) позволяют Т-клетки для создания сил, которые используются для перевозки белки или органеллы, например. Кроме того Цитоскелет актина имеет важное значение для разработки специальной контактной зоны между Т-клеток и БТР, называется иммунной синапсе. Ввиду важности Цитоскелет актина в иммунной синапса стало необходимо разработать методы количественной оценки изменений в Цитоскелет актина T клетки5,6,,78 , 9.

С помощью актина цитоскелета помощи поверхности рецепторы и сигнализации белки подвергаются сегрегации в супрамолекулярные активации кластерах (SMACs) в пределах иммунной синапса. Стабильность иммунной синапса обеспечивается путем связывания рецепторов к F-актина расслоений, которые повышают эластичность Цитоскелет актина. Было показано, что формирование иммунной синапса иметь решающее значение для поколения адаптивного иммунного ответа. Пагубные последствия формирования дефектных иммунной синапсов в естественных условиях были впервые реализованы в пациентов, страдающих от синдром Вискотта-Олдрича синдром (WAS), заболевание в котором актина полимеризации и сопутствующе обстоятельств, нарушается формирование иммунной синапса10 . Последнее, что пациенты могут страдать от экземы, тяжелой инфекции, аутоиммунные заболевания и меланомы. Несмотря на этот вывод, в настоящее время не известно, отличается ли формирование иммунной синапсов в Т-клетки здоровых лиц и пациентов, страдающих от иммунные дефекты или аутоиммунных заболеваний.

Микроскопии флуоресцирования, включая конфокальный, TIRF и микроскопии суперразрешением, были использованы для раскрыть архитектура иммунной синапса11,12,,1314. Высокое разрешение этих систем и возможность выполнения клеток позволяет коллекции точно, пространственно временной информации о Цитоскелет актина и поверхности или внутриклеточных белков в иммунной синапсе. Многие результаты, однако, основаны на анализе лишь несколько десятков Т-клеток. Кроме того Т-клетки должны быть очищены для этих типов микроскопии флуоресцирования. Однако для многих исследований вопросов, неочищенную клетки, вместо того, чтобы резолюции максимально используется исключительно важное значение. Это актуально, если анализируются Т-клетки от пациентов, поскольку объем донорской крови, ограничен и может быть необходимость обработки множества образцов параллельно.

Мы создали микроскопические методы, которые позволяют проводить анализ Цитоскелет актина в синапсе иммунной системы человека15,16,17. Эти методы основаны на визуализации проточной цитометрии, также называется в поток микроскопии18. Как гибрид между многоспектральных потока цитометрии и флуоресцентной микроскопии, визуализации проточной цитометрии имеет свои сильные стороны в анализе морфологических параметров и локализация протеина в гетерогенных клеточных популяций, как Пан лейкоцитов из периферической крови. Мы ввели методологии, которая позволяет нам дать количественную оценку F-актина в T-клеток/APC конъюгатов человеческих клеток T пробах цельной крови, без необходимости длительной и дорогостоящей очистки шагов17. Техника, представленная здесь включает в себя весь рабочий процесс, от получения образца крови для количественной оценки F-актина в иммунной синапсе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка Пан лейкоциты

  1. Нарисуйте 1 мл периферической крови здоровых доноров (или пациента) гепаринизированным шприца. Убедитесь в том иметь одобрение Комитетом ответственных этики донорства крови.
  2. Смешайте 1 мл человека периферической крови с 30 мл буфера lysis ACK (150 мм NH4Cl, 1 мм KHCO3и 0,1 мм ЭДТА, рН 7,0) в 50 мл трубки и Инкубируйте 8 мин при комнатной температуре.
  3. Заполнить трубы с PBS и центрифуги на 300 x g 6 мин аспирата супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 30 мл ACK буфера lysis.
  4. Повторите шаги с 1.2 и 1.3, до тех пор, пока супернатант ясно. Наконец вымыть клетки в PBS, центрифуги на 300 x g 6 мин при комнатной температуре и Ресуспензируйте Пелле клеток в 2 мл питательной среды (RPMI1640 + 10% FCS). Инкубируйте клетки при 37 ° C 60 мин.

2. Загрузка Раджи клетки с SEB

  1. Подготовьте две трубы Falcon 15 мл с 1,5 х 106 клеток Раджи на трубу. Спин вниз клетки (300 x g 6 мин при комнатной температуре) и удалить супернатант.
  2. Ресуспензируйте клетки в остаточных среднего (около 50 — 100 мкл), 1,9 мкл (1,9 мкг) SEB и инкубации при комнатной температуре 15 мин добавить 5 мл культуры среды, спина вниз клетки (300 x g 6 мин при комнатной температуре) и Ресуспензируйте гранулы в питательной среды (RPMI 1640 + 10% FCS) при плотности 1 х 106 клеток/мл.

3. индукция иммунной синапсов и пятнать протокол

  1. Пипетка 500 мкл подготовки SEB-загружен Раджи клеток в трубку СУИМ и 500 мкл подготовки выгружен Раджи клетки в другую трубу СУИМ. 650 мкл Пан лейкоциты, каждой трубки и спин вниз клетки (300 x g 10 мин при комнатной температуре). Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 150 мкл питательной среды (RPMI1640 + 10% FCS). Инкубируйте при 37 ° C (обычно за 45 мин).
  2. Аккуратно водоворот клетки (10 s при 1000 об/мин) и добавить 1,5 мл параформальдегида (1,5%) во время вихря исправить клетки. Остановите запись, добавив 1 мл PBS + 1% BSA. Пелле клетки (300 x g 10 мин при комнатной температуре и ресуспендирования Пелле клеток в 1 мл PBS + 1% BSA после инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин.
  3. Пелле (300 x g 10 мин при комнатной температуре) и Ресуспензируйте клетки в 100 мкл PBS + 1% BSA + 0.1% сапонинов 15 мин при комнатной температуре для разрушения клеток (96-луночных пластины, U-образный).
  4. Вымыть клетки в PBS + 1% BSA + 0.1% сапонинов с центрифугированием (300 x g 10 мин при комнатной температуре) и Ресуспензируйте Пелле клеток в 50 мкл PBS + 1% BSA + 0.1% сапонинов, содержащие Флюорофор, меченного антител или соединения (CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1: 150) и DAPI (1:3, 000)).
  5. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в темноте для 30 минут вымыть клетки 3 раза, добавив 1 мл PBS + 1% BSA + 0.1% сапонинов. Центрифуга на 300 x g 10 мин при комнатной температуре. Re Ресуспензируйте клетки в 60 мкл PBS для визуализации проточной цитометрии.

4. образ приобретение с помощью проточный цитометр

Примечание: Следующие изображения приобретение процедуры и анализ данных основаны на визуализации проточной цитометрии с помощью программного обеспечения таких как imagestream (IS100), ВДОХНОВЛЯТЬ и идеи. Однако может также использоваться другие потока цитофлуориметрами и анализа программного обеспечения.

  1. Открытое программное обеспечение анализа на компьютере, подключенном к визуализации проточный цитометр и нажмите инициализировать Fluidics меню инструмента. Примените бусинки на правильный порт, когда будет предложено сделать это.
  2. Загрузить шаблон по умолчанию из меню "файл" и нажмите на Run/установки. Выберите бусы из ниспадающего меню Вид.
  3. Настройте прожектор ярко поле, нажав на установить интенсивность, если указано значение ниже 200.
  4. Выполните калибровку и тестирование рутины в закладке Assist, нажав на начало все.
  5. Нажмите на флеш/замок/загрузить и применить образцы в левый порт, когда будет предложено сделать это. После загрузки клетки в проточный цитометр, открыть ячейку классификатора и отрегулируйте значения следующим образом: пика интенсивности верхний предел в 1 022 для каждого канала, пика интенсивности нижний предел в 50 для канала 2 (DAPI) и канал 5 (CD3-Pe-TxR), район нижнего предела в 50 для канал 1 (сторона разброс) и верхний предел в 1 500.
  6. Изменить мощность возбуждения лазера 405 нм (15 МВт), 488 нм (200 МВт) и 647 Нм (90 МВт) на вкладке Настройка.
  7. Переключение в раскрывающемся меню Вид между клетками и бусы оценить клетки классификатора и лазерной мощность корректировок.
    Примечание: Убедитесь, что все клетки и клетки пары находятся клетки мнение и что скопления клеток, мусора и изображения с насыщенным Пиксели находятся в представлении мусора путем изменения ячейки классификаторы и/или полномочия лазерного возбуждения.
  8. Определите имя образца и количество изображений для приобретения (15 000 – 25 000 образцов) и 500 для компенсации элементов управления на вкладке настройки нажмите на Run/установки для запуска приобретения.

5. анализ данных

  1. Передача файлов изображений в формате raw (.rif) к серверу анализа данных и откройте программное обеспечение для анализа.
  2. Производят матрицу компенсацию следуя инструкциям раскрывающемся списке компенсации. Сохраните матрицу компенсации как comp_Date.ctm.
  3. Открыть пример файла raw изображений (.rif) и применить comp_Date.ctm в окне, которое появляется для получения компенсации файлов (.cif) и анализ файла данных по умолчанию (.daf).
  4. Откройте файл компенсируется изображения. Преобразование изображения в цветовой режим и настроить таблицы подстановки для получения оптимального видимых цветов в панели Свойства изображения галереи. Получите изображение RGB-слияние, используя вкладку композитные панели Свойства изображения галереи.
  5. Откройте диспетчер маска из раскрывающегося списка анализа. Создание маски для определения Т-клеток и иммунных синапса, следующим образом:
    1. Выберите маску Т-клеток: «(заливка (Threshold_Ch05, 60).» Выберите маску долина: «Valley(Ch02,3).» Выберите маску синапса Т-клеток: «T-cell маска и долина (M02, Ch02, 3).»
  6. Откройте диспетчер функций в раскрывающемся списке анализа. Вычислите следующие характеристики:
    1. Для всего выражения CD3 в Т-клеток выберите «Intensity_T-cells_Ch5.» Общее количество F-актина в Т-клеток выберите «Intensity_T-cells_Ch6.» Для выражения CD3 в иммунной синапсе выберите «Intensity_T клеточной synapse_Ch5.» На сумму F-актина в иммунной синапсе выберите «Intensity_T клеточной synapse_Ch6.»
    2. Чтобы вычислить площадь Т-клеток, выберите «Area_T клетки.» Чтобы вычислить площадь Т-клеток иммунной синапса, выберите «Area_T клеток синапса.»
  7. Определите F-актина и CD3 обогащения в иммунной синапса с помощью уравнения в Диспетчер функций:
    figure-protocol-1
  8. Применить следующие стробирования стратегии с помощью гистограммы и точка участки от анализа области (дальнейшие подробности см ссылки 17 и 19):
    1. Отменить клетки вне фокуса путем построения «Градиент RMS_M2_Ch2» в гистограмме; Установите порог в 15.
    2. Участок SSC против CD3 интенсивности в участке точка. Установка ворот на CD3-позитивные события.
    3. Участок «Пропорции» M02 (DAPI пятно) против области M02 (Dapi пятно). Ворота на Майки Т-клеток и клеток пары соответственно. Исправление для пар истинный ячеек с помощью области синапсов маски, как описано ранее,17,19.
    4. Определите количество F-актина в майки T-клетки и Т-клетки T-клеток/APC пар и процент F-актина в иммунной синапсе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Основная цель метода, описанного здесь является количественная оценка белка обогащения (например, F-миозина) в иммунной синапса между суррогатной БТР (Раджи клетки) и T-клетки в неочищенную Пан лейкоциты, взяты из образцов человеческой крови низким объемом (1 мл). Снимок экрана на рис. 1 дает обзор критических стробирования стратегии данного метода. Это показывает галерею изображений на левом и анализ области справа (рис. 1). Галерея изображений ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Работы, представленные здесь позволяет количественная оценка иммунной синапсы человека Т-клетки (ex vivo) и БТР. В частности эритроцитов лизированы Пан лейкоциты были использованы в качестве источников Т-клеток, делает шаги очистки Т-клеточная необязательный. Линия B-клеточной лимфомы клетки Раджи служил в качестве суррогатной БТР. Это имеет значительные преимущества, поскольку она позволяет проводить сопоставления между донорами крови стороны Т-клеток иммунной синапса. Кроме того аутологичные DCs вряд ли доступны непоср...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Работа финансировалась немецкого научного Совета (DFG) с грантов нет SFB-938-M и SA 393/3-4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
>Multifuge 3 SRHeraeus
RPMI 1640LifeTechnologies#11875085500 мл
FCSPan Biotech#3302-P101102
Полистирольная трубка с круглым дномFalcon#3520545 мл
KulturflascheThermo Scientific#178883
Фосфатный буферный раствор ДульбеккоSigmaD8662
Бычья сыворотка АльбуминRoth#8076.3
СапонинSigmaS7900
ПараформальдегидSigma Aldrich#16005
FACS Wash SaponinPBS 1% BSA 0.15 Сапонин
ReaktiosgefaBSarstedt72.699.0020.5 мл
Скоростной шарикAmnis#400041
Минишейкер MS1IKA Works  MS1
MikrotiterplatteGreiner Bio One#65010196U
Энтеротоксин SEBSigma AldrichS4881
DAPISigma AldrichD95421:3000
CD3-PeTxRInvitrogenMHCD03171:30
Молекулярные зондыPhalloidin-AF647A222871:150
IS100AmnisВизуализирующий проточный цитометр
IDEASПрограммное обеспечениеAmnis
INSPIREПрограммное обеспечениеAmnis

Ссылки

  1. Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
  2. Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
  3. Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
  4. Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68(2016).
  5. Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
  6. Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
  7. Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
  8. Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
  9. Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
  10. Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
  11. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  12. Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
  13. Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421(2012).
  14. Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
  15. Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
  16. Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
  17. Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
  18. Basiji, D., O'Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
  19. Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
  20. Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
  21. Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
  22. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CD3FRajiSEB
Качественный и количественный анализ иммунной синапсов в системе человека с использованием визуализации проточной цитометрии
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.