Качественный и количественный анализ иммунной синапсов в системе человека с использованием визуализации проточной цитометрии

Summary

Здесь мы описываем полный рабочий процесс для качественного и количественного анализа иммунных синапсов между основной человеческий Т-клеток и антиген представляющих клеток. Метод основан на визуализации проточной цитометрии, который позволяет приобретение и оценки нескольких тысяч клеток изображений в течение относительно короткого периода времени.

Abstract

Иммунная синапса — это область коммуникации между Т-клеток и антиген представляющих клеток (БТР). Т-клетки поляризовывайте поверхности рецепторы и белков к иммунной СИНАПС для обеспечения стабильного привязки и сигнал обмен. Классическая конфокальный, TIRF или суперразрешением микроскопии были использованы для изучения иммунной синапсе. Поскольку эти методы требуют ручной изображения приобретение и длительным количественной оценки, изображений редких событий является сложной задачей. Здесь мы описываем рабочий процесс, который позволяет морфологический анализ десятки тысяч клеток. Иммунные синапсы наведены между первичной клетки человека T в Пан лейкоцита препаратов и золотистый стафилококк энтеротоксинов B SEB-загружен Раджи клетки как БТР. Получение изображения производится с изображений проточной цитометрии, также называется микроскопии в поток, который сочетает в себе черты проточный цитометр и флуоресцентным микроскопом. Предоставляется полный стробирования стратегию для выявления клеток T/APC пары и анализа иммунной синапсы. Как этот рабочий процесс позволяет анализ иммунной синапсов в подготовке неочищенную Пан лейкоцитов и поэтому требует лишь небольшого количества крови (т.е., 1 мл), он может применяться для образцов от пациентов. Важно отметить, что несколько образцов можно подготовлен, измеряется и проанализированы параллельно.

Introduction

Т-клетки являются основными регуляторами адаптивной иммунной системы и активируются через антигенные пептиды, которые представлены в контексте комплексов гистосовместимости (MHC). Полная активация Т-клеток требует двух сигналов, компетенции сигнал через антиген специфические Т-клеточных рецепторов (TCR) / CD3 комплекса и костимуляторных сигнала через аксессуар рецепторов. Обе сигналы генерируются путем непосредственного взаимодействия Т-клеток с антиген представляющих клеток (БТР). Зрелые БТР обеспечивают компетенции сигнал для активации Т-клеток через MHC-пептидных комплексов, и они выражают костимуляторных лигандами (например, CD80 или CD86) заверить прогре....

Protocol

1. Подготовка Пан лейкоциты

1. Нарисуйте 1 мл периферической крови здоровых доноров (или пациента) гепаринизированным шприца. Убедитесь в том иметь одобрение Комитетом ответственных этики донорства крови.
2. Смешайте 1 мл человека периферической крови с 30 мл буфера lysis ACK (150 мм NH₄Cl, 1 мм KHCO₃и 0,1 мм ЭДТА, рН 7,0) в 50 мл трубки и Инкубируйте 8 мин при комнатной температуре.
3. Заполнить трубы с PBS и центрифуги на 300 x g 6 мин аспирата супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 30 мл ACK буфера lysis.
4. Повторите шаги с 1.2 и 1.3, до тех пор, пока супернатант ясно. Наконец вымыть клетки в PBS, центриф....

Results

Основная цель метода, описанного здесь является количественная оценка белка обогащения (например, F-миозина) в иммунной синапса между суррогатной БТР (Раджи клетки) и T-клетки в неочищенную Пан лейкоциты, взяты из образцов человеческой крови низким объемом (1 мл). Снимок экрана на рис. 1 дает обзор критических стробирования стратегии данного метода. Это показывает галерею изображений на левом и анализ области справа (рис. 1). Галерея изображений .......

Discussion

Работы, представленные здесь позволяет количественная оценка иммунной синапсы человека Т-клетки (ex vivo) и БТР. В частности эритроцитов лизированы Пан лейкоциты были использованы в качестве источников Т-клеток, делает шаги очистки Т-клеточная необязательный. Линия B-клеточной лимфомы клетки Раджи служил в качестве суррогатной БТР. Это имеет значительные преимущества, поскольку она позволяет проводить сопоставления между донорами крови стороны Т-клеток иммунной синапса. Кроме того аутологичные DCs вряд ли доступны непоср.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
>Multifuge 3 SR	Heraeus
RPMI 1640	LifeTechnologies	#11875085	500 мл
FCS	Pan Biotech#3302-P101102
Полистирольная трубка с круглым дном	Falcon	#352054	5 мл
Kulturflasche	Thermo Scientific	#178883
Фосфатный буферный раствор Дульбекко	Sigma	D8662
Бычья сыворотка Альбумин	Roth	#8076.3
Сапонин	Sigma	S7900
Параформальдегид	Sigma Aldrich	#16005
FACS Wash Saponin		PBS 1% BSA 0.15 Сапонин
ReaktiosgefaB	Sarstedt	72.699.002	0.5 мл
Скоростной шарик	Amnis	#400041
Минишейкер MS1	IKA Works	MS1
Mikrotiterplatte	Greiner Bio One	#650101	96U
Энтеротоксин SEB	Sigma Aldrich	S4881
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	1:3000
CD3-PeTxR	Invitrogen	MHCD0317	1:30
Молекулярные зонды	Phalloidin-AF647	A22287	1:150
IS100	Amnis		Визуализирующий проточный цитометр
IDEAS	Программное обеспечение	Amnis
INSPIRE	Программное обеспечение	Amnis