Качественный и количественный анализ иммунной синапсов в системе человека с использованием визуализации проточной цитометрии

Summary

Здесь мы описываем полный рабочий процесс для качественного и количественного анализа иммунных синапсов между основной человеческий Т-клеток и антиген представляющих клеток. Метод основан на визуализации проточной цитометрии, который позволяет приобретение и оценки нескольких тысяч клеток изображений в течение относительно короткого периода времени.

Abstract

Иммунная синапса — это область коммуникации между Т-клеток и антиген представляющих клеток (БТР). Т-клетки поляризовывайте поверхности рецепторы и белков к иммунной СИНАПС для обеспечения стабильного привязки и сигнал обмен. Классическая конфокальный, TIRF или суперразрешением микроскопии были использованы для изучения иммунной синапсе. Поскольку эти методы требуют ручной изображения приобретение и длительным количественной оценки, изображений редких событий является сложной задачей. Здесь мы описываем рабочий процесс, который позволяет морфологический анализ десятки тысяч клеток. Иммунные синапсы наведены между первичной клетки человека T в Пан лейкоцита препаратов и золотистый стафилококк энтеротоксинов B SEB-загружен Раджи клетки как БТР. Получение изображения производится с изображений проточной цитометрии, также называется микроскопии в поток, который сочетает в себе черты проточный цитометр и флуоресцентным микроскопом. Предоставляется полный стробирования стратегию для выявления клеток T/APC пары и анализа иммунной синапсы. Как этот рабочий процесс позволяет анализ иммунной синапсов в подготовке неочищенную Пан лейкоцитов и поэтому требует лишь небольшого количества крови (т.е., 1 мл), он может применяться для образцов от пациентов. Важно отметить, что несколько образцов можно подготовлен, измеряется и проанализированы параллельно.

Introduction

Т-клетки являются основными регуляторами адаптивной иммунной системы и активируются через антигенные пептиды, которые представлены в контексте комплексов гистосовместимости (MHC). Полная активация Т-клеток требует двух сигналов, компетенции сигнал через антиген специфические Т-клеточных рецепторов (TCR) / CD3 комплекса и костимуляторных сигнала через аксессуар рецепторов. Обе сигналы генерируются путем непосредственного взаимодействия Т-клеток с антиген представляющих клеток (БТР). Зрелые БТР обеспечивают компетенции сигнал для активации Т-клеток через MHC-пептидных комплексов, и они выражают костимуляторных лигандами (например, CD80 или CD86) заверить прогрессирование Т-клеток активации¹. Одной из важных функций костимуляции является перераспределение актина цитоскелета^2,3,4. Корковых F-актина относительно статичной в отдыхая Т-клеток. Т-клеточная стимуляция через антиген подшипник БТР приводит к глубокой перестройки Цитоскелет актина. Актина динамика (т.е., быстро актина полимеризации/деполимеризации круги) позволяют Т-клетки для создания сил, которые используются для перевозки белки или органеллы, например. Кроме того Цитоскелет актина имеет важное значение для разработки специальной контактной зоны между Т-клеток и БТР, называется иммунной синапсе. Ввиду важности Цитоскелет актина в иммунной синапса стало необходимо разработать методы количественной оценки изменений в Цитоскелет актина T клетки^{5,6,,78 , 9}.

С помощью актина цитоскелета помощи поверхности рецепторы и сигнализации белки подвергаются сегрегации в супрамолекулярные активации кластерах (SMACs) в пределах иммунной синапса. Стабильность иммунной синапса обеспечивается путем связывания рецепторов к F-актина расслоений, которые повышают эластичность Цитоскелет актина. Было показано, что формирование иммунной синапса иметь решающее значение для поколения адаптивного иммунного ответа. Пагубные последствия формирования дефектных иммунной синапсов в естественных условиях были впервые реализованы в пациентов, страдающих от синдром Вискотта-Олдрича синдром (WAS), заболевание в котором актина полимеризации и сопутствующе обстоятельств, нарушается формирование иммунной синапса¹⁰ . Последнее, что пациенты могут страдать от экземы, тяжелой инфекции, аутоиммунные заболевания и меланомы. Несмотря на этот вывод, в настоящее время не известно, отличается ли формирование иммунной синапсов в Т-клетки здоровых лиц и пациентов, страдающих от иммунные дефекты или аутоиммунных заболеваний.

Микроскопии флуоресцирования, включая конфокальный, TIRF и микроскопии суперразрешением, были использованы для раскрыть архитектура иммунной синапса^11,12,,1314. Высокое разрешение этих систем и возможность выполнения клеток позволяет коллекции точно, пространственно временной информации о Цитоскелет актина и поверхности или внутриклеточных белков в иммунной синапсе. Многие результаты, однако, основаны на анализе лишь несколько десятков Т-клеток. Кроме того Т-клетки должны быть очищены для этих типов микроскопии флуоресцирования. Однако для многих исследований вопросов, неочищенную клетки, вместо того, чтобы резолюции максимально используется исключительно важное значение. Это актуально, если анализируются Т-клетки от пациентов, поскольку объем донорской крови, ограничен и может быть необходимость обработки множества образцов параллельно.

Мы создали микроскопические методы, которые позволяют проводить анализ Цитоскелет актина в синапсе иммунной системы человека^15,16,17. Эти методы основаны на визуализации проточной цитометрии, также называется в поток микроскопии¹⁸. Как гибрид между многоспектральных потока цитометрии и флуоресцентной микроскопии, визуализации проточной цитометрии имеет свои сильные стороны в анализе морфологических параметров и локализация протеина в гетерогенных клеточных популяций, как Пан лейкоцитов из периферической крови. Мы ввели методологии, которая позволяет нам дать количественную оценку F-актина в T-клеток/APC конъюгатов человеческих клеток T пробах цельной крови, без необходимости длительной и дорогостоящей очистки шагов¹⁷. Техника, представленная здесь включает в себя весь рабочий процесс, от получения образца крови для количественной оценки F-актина в иммунной синапсе.

Protocol

1. Подготовка Пан лейкоциты

1. Нарисуйте 1 мл периферической крови здоровых доноров (или пациента) гепаринизированным шприца. Убедитесь в том иметь одобрение Комитетом ответственных этики донорства крови.
2. Смешайте 1 мл человека периферической крови с 30 мл буфера lysis ACK (150 мм NH₄Cl, 1 мм KHCO₃и 0,1 мм ЭДТА, рН 7,0) в 50 мл трубки и Инкубируйте 8 мин при комнатной температуре.
3. Заполнить трубы с PBS и центрифуги на 300 x g 6 мин аспирата супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 30 мл ACK буфера lysis.
4. Повторите шаги с 1.2 и 1.3, до тех пор, пока супернатант ясно. Наконец вымыть клетки в PBS, центрифуги на 300 x g 6 мин при комнатной температуре и Ресуспензируйте Пелле клеток в 2 мл питательной среды (RPMI1640 + 10% FCS). Инкубируйте клетки при 37 ° C 60 мин.

2. Загрузка Раджи клетки с SEB

1. Подготовьте две трубы Falcon 15 мл с 1,5 х 10⁶ клеток Раджи на трубу. Спин вниз клетки (300 x g 6 мин при комнатной температуре) и удалить супернатант.
2. Ресуспензируйте клетки в остаточных среднего (около 50 — 100 мкл), 1,9 мкл (1,9 мкг) SEB и инкубации при комнатной температуре 15 мин добавить 5 мл культуры среды, спина вниз клетки (300 x g 6 мин при комнатной температуре) и Ресуспензируйте гранулы в питательной среды (RPMI 1640 + 10% FCS) при плотности 1 х 10⁶ клеток/мл.

3. индукция иммунной синапсов и пятнать протокол

1. Пипетка 500 мкл подготовки SEB-загружен Раджи клеток в трубку СУИМ и 500 мкл подготовки выгружен Раджи клетки в другую трубу СУИМ. 650 мкл Пан лейкоциты, каждой трубки и спин вниз клетки (300 x g 10 мин при комнатной температуре). Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 150 мкл питательной среды (RPMI1640 + 10% FCS). Инкубируйте при 37 ° C (обычно за 45 мин).
2. Аккуратно водоворот клетки (10 s при 1000 об/мин) и добавить 1,5 мл параформальдегида (1,5%) во время вихря исправить клетки. Остановите запись, добавив 1 мл PBS + 1% BSA. Пелле клетки (300 x g 10 мин при комнатной температуре и ресуспендирования Пелле клеток в 1 мл PBS + 1% BSA после инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин.
3. Пелле (300 x g 10 мин при комнатной температуре) и Ресуспензируйте клетки в 100 мкл PBS + 1% BSA + 0.1% сапонинов 15 мин при комнатной температуре для разрушения клеток (96-луночных пластины, U-образный).
4. Вымыть клетки в PBS + 1% BSA + 0.1% сапонинов с центрифугированием (300 x g 10 мин при комнатной температуре) и Ресуспензируйте Пелле клеток в 50 мкл PBS + 1% BSA + 0.1% сапонинов, содержащие Флюорофор, меченного антител или соединения (CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1: 150) и DAPI (1:3, 000)).
5. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в темноте для 30 минут вымыть клетки 3 раза, добавив 1 мл PBS + 1% BSA + 0.1% сапонинов. Центрифуга на 300 x g 10 мин при комнатной температуре. Re Ресуспензируйте клетки в 60 мкл PBS для визуализации проточной цитометрии.

4. образ приобретение с помощью проточный цитометр

Примечание: Следующие изображения приобретение процедуры и анализ данных основаны на визуализации проточной цитометрии с помощью программного обеспечения таких как imagestream (IS100), ВДОХНОВЛЯТЬ и идеи. Однако может также использоваться другие потока цитофлуориметрами и анализа программного обеспечения.

1. Открытое программное обеспечение анализа на компьютере, подключенном к визуализации проточный цитометр и нажмите инициализировать Fluidics меню инструмента. Примените бусинки на правильный порт, когда будет предложено сделать это.
2. Загрузить шаблон по умолчанию из меню "файл" и нажмите на Run/установки. Выберите бусы из ниспадающего меню Вид.
3. Настройте прожектор ярко поле, нажав на установить интенсивность, если указано значение ниже 200.
4. Выполните калибровку и тестирование рутины в закладке Assist, нажав на начало все.
5. Нажмите на флеш/замок/загрузить и применить образцы в левый порт, когда будет предложено сделать это. После загрузки клетки в проточный цитометр, открыть ячейку классификатора и отрегулируйте значения следующим образом: пика интенсивности верхний предел в 1 022 для каждого канала, пика интенсивности нижний предел в 50 для канала 2 (DAPI) и канал 5 (CD3-Pe-TxR), район нижнего предела в 50 для канал 1 (сторона разброс) и верхний предел в 1 500.
6. Изменить мощность возбуждения лазера 405 нм (15 МВт), 488 нм (200 МВт) и 647 Нм (90 МВт) на вкладке Настройка.
7. Переключение в раскрывающемся меню Вид между клетками и бусы оценить клетки классификатора и лазерной мощность корректировок.
   Примечание: Убедитесь, что все клетки и клетки пары находятся клетки мнение и что скопления клеток, мусора и изображения с насыщенным Пиксели находятся в представлении мусора путем изменения ячейки классификаторы и/или полномочия лазерного возбуждения.
8. Определите имя образца и количество изображений для приобретения (15 000 – 25 000 образцов) и 500 для компенсации элементов управления на вкладке настройки нажмите на Run/установки для запуска приобретения.

5. анализ данных

1. Передача файлов изображений в формате raw (.rif) к серверу анализа данных и откройте программное обеспечение для анализа.
2. Производят матрицу компенсацию следуя инструкциям раскрывающемся списке компенсации. Сохраните матрицу компенсации как comp_Date.ctm.
3. Открыть пример файла raw изображений (.rif) и применить comp_Date.ctm в окне, которое появляется для получения компенсации файлов (.cif) и анализ файла данных по умолчанию (.daf).
4. Откройте файл компенсируется изображения. Преобразование изображения в цветовой режим и настроить таблицы подстановки для получения оптимального видимых цветов в панели Свойства изображения галереи. Получите изображение RGB-слияние, используя вкладку композитные панели Свойства изображения галереи.
5. Откройте диспетчер маска из раскрывающегося списка анализа. Создание маски для определения Т-клеток и иммунных синапса, следующим образом:
   1. Выберите маску Т-клеток: «(заливка (Threshold_Ch05, 60).» Выберите маску долина: «Valley(Ch02,3).» Выберите маску синапса Т-клеток: «T-cell маска и долина (M02, Ch02, 3).»
6. Откройте диспетчер функций в раскрывающемся списке анализа. Вычислите следующие характеристики:
   1. Для всего выражения CD3 в Т-клеток выберите «Intensity_T-cells_Ch5.» Общее количество F-актина в Т-клеток выберите «Intensity_T-cells_Ch6.» Для выражения CD3 в иммунной синапсе выберите «Intensity_T клеточной synapse_Ch5.» На сумму F-актина в иммунной синапсе выберите «Intensity_T клеточной synapse_Ch6.»
   2. Чтобы вычислить площадь Т-клеток, выберите «Area_T клетки.» Чтобы вычислить площадь Т-клеток иммунной синапса, выберите «Area_T клеток синапса.»
7. Определите F-актина и CD3 обогащения в иммунной синапса с помощью уравнения в Диспетчер функций:
   
8. Применить следующие стробирования стратегии с помощью гистограммы и точка участки от анализа области (дальнейшие подробности см ссылки 17 и 19):
   1. Отменить клетки вне фокуса путем построения «Градиент RMS_M2_Ch2» в гистограмме; Установите порог в 15.
   2. Участок SSC против CD3 интенсивности в участке точка. Установка ворот на CD3-позитивные события.
   3. Участок «Пропорции» M02 (DAPI пятно) против области M02 (Dapi пятно). Ворота на Майки Т-клеток и клеток пары соответственно. Исправление для пар истинный ячеек с помощью области синапсов маски, как описано ранее,^17,19.
   4. Определите количество F-актина в майки T-клетки и Т-клетки T-клеток/APC пар и процент F-актина в иммунной синапсе.

Results

Основная цель метода, описанного здесь является количественная оценка белка обогащения (например, F-миозина) в иммунной синапса между суррогатной БТР (Раджи клетки) и T-клетки в неочищенную Пан лейкоциты, взяты из образцов человеческой крови низким объемом (1 мл). Снимок экрана на рис. 1 дает обзор критических стробирования стратегии данного метода. Это показывает галерею изображений на левом и анализ области справа (рис. 1). Галерея изображений ...

Discussion

Работы, представленные здесь позволяет количественная оценка иммунной синапсы человека Т-клетки (ex vivo) и БТР. В частности эритроцитов лизированы Пан лейкоциты были использованы в качестве источников Т-клеток, делает шаги очистки Т-клеточная необязательный. Линия B-клеточной лимфомы клетки Раджи служил в качестве суррогатной БТР. Это имеет значительные преимущества, поскольку она позволяет проводить сопоставления между донорами крови стороны Т-клеток иммунной синапса. Кроме того аутологичные DCs вряд ли доступны непоср...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
>Multifuge 3 SR	Heraeus
RPMI 1640	LifeTechnologies	#11875085	500 мл
FCS	Pan Biotech#3302-P101102
Полистирольная трубка с круглым дном	Falcon	#352054	5 мл
Kulturflasche	Thermo Scientific	#178883
Фосфатный буферный раствор Дульбекко	Sigma	D8662
Бычья сыворотка Альбумин	Roth	#8076.3
Сапонин	Sigma	S7900
Параформальдегид	Sigma Aldrich	#16005
FACS Wash Saponin		PBS 1% BSA 0.15 Сапонин
ReaktiosgefaB	Sarstedt	72.699.002	0.5 мл
Скоростной шарик	Amnis	#400041
Минишейкер MS1	IKA Works	MS1
Mikrotiterplatte	Greiner Bio One	#650101	96U
Энтеротоксин SEB	Sigma Aldrich	S4881
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	1:3000
CD3-PeTxR	Invitrogen	MHCD0317	1:30
Молекулярные зонды	Phalloidin-AF647	A22287	1:150
IS100	Amnis		Визуализирующий проточный цитометр
IDEAS	Программное обеспечение	Amnis
INSPIRE	Программное обеспечение	Amnis