Методическая статья

Использование трассировки Eyeblink классический подготовлять для оценки гиппокампа дисфункции в мышиной модели плода алкоголь спектра расстройств

9.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55350

⸱

5 августа 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychology, East Carolina University, 2Multidisciplinary Studies Program in Neuroscience, East Carolina University

В этой статье

Краткое содержание

След eyeblink классический подготовлять (ECC) был использован для оценки гиппокампа зависимых ассоциативные обучения взрослых крыс, которые были под высокой концентрации (11,9% v/v) алкоголя во время раннего развития новорожденных мозга. В общем ECC процедуры являются звук диагностические инструменты для обнаружения дисфункции мозга во многих психологических и биомедицинских параметров.

Аннотация

Новорожденным крысам вводили относительно высокая концентрация этилового спирта (11,9% v/v) во время послеродовых дней 4-9, когда мозг плода подвергается быстрому организационных изменений и похож на ускоренного изменения мозга, которые происходят во время третьего триместра беременности в организме человека. Эта модель плода алкоголь спектра расстройств (FASDs) производит серьезные повреждения мозга, подражая на объем и структура выпивкою питья, встречается у некоторых беременных алкогольных. Мы описывают использование трассировки eyeblink классический подготовлять (ECC), вариант более высокого порядка ассоциативные обучения, чтобы оценить долгосрочные гиппокампа дисфункции, которая обычно рассматривается в подвергшихся воздействию алкоголя взрослого потомства. В возрасте 90 дней грызуны хирургически подготовлены с записью и стимулирующих электродов, которые измерены электромиографической (ГРП) мигает активность мышц левой веко и доставлены мягкий шок задний левый глаз, соответственно. После 5 дней периода восстановления они прошли 6 сессий трассировки ECC для определения ассоциативные обучения различия между воздействием алкоголя и контролировать крыс. След ECC является одним из многих возможных процедур ECC, которые могут быть легко изменены с помощью же оборудования и программного обеспечения, таким образом, чтобы можно было оценить различные нервные системы. ECC процедур в целом, может использоваться как средства диагностики для обнаружения патологии нервной систем различных мозга и различных условий, которые оскорбляют мозга.

Введение

Трудно представить, что в наше время, при улучшении качества здравоохранения и доступности медицинских услуг, злоупотребление алкоголем остается серьезной глобальной проблемой здравоохранения. К сожалению, было показано, что у беременной женщины, употребляющей большое количество алкоголя, может родиться ребенок с тяжелыми поражениями головного мозга и нарушениями нейропсихического развития, сохраняющимися на протяжении всей жизни, что отчетливо видно у лиц, страдающих фетальным алкогольным синдромом (ФАС)1,2,3. У женщин с подтвержденным анамнезом употребления алкоголя в период беременности развивающийся плод также восприимчив к малым дозам алкоголя или различным схемам его потребления, которые приводят к разным концентрациям алкоголя в крови. В последнем случае дети могут не проявлять таких тяжелых морфологических или нейроповеденческих нарушений, как при ФАС, но все же могут иметь пожизненные когнитивные нарушения и эмоциональные расстройства различной степени тяжести, от легких до тяжелых3,4. В совокупности ФАС и менее тяжелые формы пренатальных нарушений, вызванных алкоголем, составляют группу фетальных алкогольных спектральных расстройств (ФАСР). Неудивительно, что ФАСР можно полностью предотвратить, однако, по поразительным оценкам, в популяциях, где злоупотребление алкоголем весьма распространено, они остаются основной негенетической причиной нейронной и когнитивной инвалидности, затрагивая примерно от 2% до 5% детей младшего возраста в США и в таких европейских странах, как Франция и Швеция. Что касается распространенности одного только ФАС в США, она составляет от 2 до 7 случаев на 1 000 живорожденных5, что подразумевает, что общая частота встречаемости ФАСР намного выше, чем частота ФАС.

Нейровизуализационные исследования, проведенные у детей с РАС, показали наличие аномалий головного мозга, таких как истончение мозолистого тела6, уменьшение передней доли червя мозжечка7 и уменьшение гиппокампа8. Эти структурные изменения мозга лежат в основе некоторых долгосрочных нейрокогнитивных нарушений, наблюдаемых у детей с РАС. Точные связи между вариациями изменений мозга, вызванных употреблением алкоголя матерью, и вариациями в профиле (т. е. типом, степенью выраженности) конкретных нейрокогнитивных нарушений еще предстоит четко определить. Однако в качестве отправной точки гиппокамп является отличным кандидатом для изучения его восприимчивости к воздействию алкоголя в пренатальный период. Действительно, у детей с РАС наблюдается дефицит функций, опосредованных гиппокампом, таких как пространственное обучение9,10 и отсроченное воспроизведение объектов11.

Модели FASD на грызунах оказались неоценимыми для выяснения механизмов, приводящих к нейрокогнитивным нарушениям, наблюдаемым у детей с FASD. Хорошо зарекомендовавшая себя модель эпизодического воздействия, которую мы применили, предполагает введение алкоголя крысам в период с 4-го по 9-й дни после рождения12,13 — период, когда в мозге происходит быстрое формирование синапсов и дендритных контактов, что сопоставимо с 24-й неделей развития человеческого плода и продолжается в течение 3го триместра14,15,16,17. Данная модель вызывает значительную потерю нейронов гиппокампа18,19 и нейронов во многих других областях мозга, таких как мозжечок12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, что сопровождается тяжелыми нарушениями когнитивных функций в различных областях21,24,25. Когнитивные нарушения в результате раннего воздействия алкоголя у крыс могут быть оценены разными способами, в частности, с помощью классического обусловливания мигания (ECC). ECC представляет собой парадигму, которая используется более столетия для научного исследования фундаментальных основ обучения26,27 и, таким образом, обеспечивает эффективный метод для более глубокого понимания неблагоприятных нейрокогнитивных последствий, возникающих в результате воздействия алкоголя на плод. Это очень гибкая парадигма, позволяющая исследователям использовать различные процедуры ECC, каждая из которых может быть изучена на многих видах млекопитающих по всей филогенетической шкале (от мышей до людей) и на разных этапах развития мозга28,29,30,31. Кроме того, фундаментальные нейронные цепи, опосредующие ассоциативное обучение в этой парадигме, подтверждены экспериментальными и нейропсихологическими данными для тех же видов26,32,33,34,35,36,37.

В данной работе демонстрируется одна из форм классического обусловливания глаза (ECC) — следовое ECC (Рисунок 1). Для контекста оно сравнивается с более традиционной формой — ECC с задержкой. Парадигма ECC была смоделирована по принципу классического обусловливания на собаках, которое впервые провел физиолог, лауреат Нобелевской премии, Иван Павлов. Павлов обнаружил, что определенные стимулы, такие как звуковые сигналы, сами по себе не вызывают слюноотделения, но если сигнал предшествует подаче пищи и перекрывается с ней, слюнарная реакция может усилиться при многократном повторении этих двух событий, при условии сохранения этой зависимости между сигналом и пищей. Это пример ECC с задержкой, основанный на представлении о том, что сила ассоциативной связи опосредована непосредственной временной близостью двух стимулов, что делает условия обучения оптимальными для животного. Он также тестировал другие варианты зависимости между сигналом и пищей, например, выключение сигнала и оставление «следового» периода перед подачей пищи. Когда эти два стимула были достаточно разнесены во времени, собакам становилось гораздо труднее вырабатывать слюнарную реакцию до подачи пищи. Таким образом, временной разрыв между выключением сигнала и подачей пищи является примером следового ECC. Поскольку грызуны естественным образом не выделяют слюну при наличии пищи, вместо неё используются более релевантные для данного вида стимулы, такие как слабый удар током; также они естественным образом не проявляют защитную реакцию моргания в ответ на звуковые сигналы. С учетом этого процедуры ECC у грызунов включают подачу звукового сигнала определенного уровня децибел и его определенным образом сочетание со слабым ударом током либо по круговой мышце глаза (orbicularis oculi), либо по височной мышце (temporalis) для вызывания реакции моргания. Звуковой сигнал считается обусловленным стимулом (CS), а удар током — безусловным стимулом (US). При ECC с задержкой сначала предъявляется CS; этот стимул остается активным в течение определенного времени. После этого подается US. Эти два стимула перекрываются в течение определенного времени, а затем одновременно прекращаются; результирующая реакция моргания, вызванная US, считается безусловной реакцией (UR). В этой процедуре грызуны учатся моргать через некоторое время после предъявления CS, но непосредственно перед US, чтобы предвосхитить этот аверсивный стимул. Выученная реакция моргания называется обусловленной реакцией (CR). При следовом ECC стимулы CS и US разделены промежутком времени, свободным от стимулов, который известен как следовой интервал; они не перекрываются во времени, как при ECC с задержкой. В течение этого интервала животное должно разрешить ассоциативные требования между стимулами. Подобно ECC с задержкой, обучение происходит, когда животное последовательно демонстрирует реакцию моргания после выключения CS, но непосредственно перед подачей US. В результате определенного объема тренировок по закреплению (сочетание CS с US) формируются кривые обучения (т. е. на основе различных измерений CR). Исследования с применением повреждений и нейровизуализации показывают, что успешное обучение при ECC с задержкой зависит от целостности нейронных цепей мозжечка и ствола мозга38,39,40, тогда как следовое ECC является процедурой более высокого порядка, требующей дополнительного участия гиппокампа41,42,43,44 и других корковых структур45,46. Из-за требований к временной точности, необходимых для успешного формирования следовых CR, эта задача также является более сложной для освоения (даже для нормальных субъектов).

figure-introduction-1
Рисунок 1: Классическое обусловливание реакции мигания с интервалом (trace eyeblink conditioning). Приведен типичный график записи для взрослой крысы из контрольной группы без интубации (UC). Сначала подается тоновый условный стимул CS (85 dB, 2.8 kHz) продолжительностью 380 ms. Затем следует интервал (trace interval) длительностью 500 ms, в течение которого стимулы отсутствуют. После этого подается шоковый безусловный стимул US (1.6 mA) продолжительностью 100 ms. Успешное обучение в данном тесте характеризуется увеличением частоты (%) или амплитуды (в вольтах) миганий в течение временного окна условного ответа (CR) (Total CR period) на протяжении многих сессий обучения. В частности, грызуны с неповрежденным гиппокампом обычно демонстрируют большее количество своевременных CR (Adaptive CRs) непосредственно перед началом шокового стимула US (в окне 200 ms). Также измеряются реакции испуга (SRs) в течение первых 80 ms после начала тонового CS и безусловные ответы (URs). Неассоциативные SRs обычно низкие или отсутствуют у хорошо обученных грызунов, в то время как URs должны иметь высокую частоту и амплитуду. Данная задача требует, чтобы животное научилось связывать прекращение CS и начало US (в течение интервала), что делает ее изначально более сложной для освоения по сравнению с обусловливанием с задержкой (delay ECC). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В данной работе мы демонстрируем неблагоприятные функциональные последствия воздействия алкоголя в неонатальный период при введении по типу запоя (binge-like), оцениваемые с помощью процедуры следового классического обусловливания (trace ECC), при которой подается тоновый условный стимул (CS) громкостью 85 dB (2,8 kHz) продолжительностью 380 ms, за которым следует безусловный стимул (US) в виде шока силой 1,6 mA продолжительностью 100 ms; эти стимулы разделены интервалом следа длительностью 500 ms. Мы сообщали о полезности данного поведенческого анализа в предыдущих исследованиях, посвященных изучению влияния вмешательства с использованием холина и добавок железа на смягчение последствий неонатального воздействия алкоголя18,47. Таким образом, следовое ECC может быть использовано в качестве диагностического инструмента для оценки патологии гиппокампа, индуцированной воздействием алкоголя в неонатальный период. Его преимущество перед отложенным (delay ECC) обусловливанием заключается в более высокой чувствительности к выявлению нарушений функции гиппокампа, которые наблюдаются у людей с FASDs.

Демонстрация ECC выходит далеко за рамки исследований фетального алкогольного синдрома. Многие варианты ECC (например, отложенное, следовое, составное, реверсивное кондиционирование) могут быть использованы для выяснения онтогенетических различий в обучении в процессе развития, нейробиологических основ ассоциативного обучения у млекопитающих в норме, а также уязвимости различных систем мозга к многочисленным негативным воздействиям, включая (но не ограничиваясь ими) тератогены, токсины окружающей среды, черепно-мозговые травмы, нейродегенеративные заболевания и психические расстройства.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры были одобрены и проведены в соответствии с политикой, установленной IACUC Университета Восточной Каролины. Крысы линии Long-Evans были получены от самок, скрещенных с самцами-производителями. Потомство для всех трех групп воздействия (см. 1.1) было получено в рамках одного помета от одной самки. Было получено пять пометов, и в каждом из них на 3-й постнатальный день (PD) количество щенков было сокращено до 8. Оставшиеся два щенка из каждого помета были распределены по отдельным экспериментам. В исследование были включены как самцы, так и самки потомства (по одной особи на группу воздействия). В данном исследовании было обследовано в общей сложности N = 27 взрослых особей; 3 крысы были исключены из-за поломки проводов 3T (см. 3.1.1), которую невозможно было устранить в 1-й день обучения ECC.

1. Подготовка групп, материалов и растворов

  1. На 3-й день после рождения (PD 3) заберите детенышей у матери и поместите их на терморегулируемую грелку с водой для поддержания тепла. Используя процедуру случайного выбора, распределите крысят по одной из трех групп: (1) группа с интубацией алкоголем (AI); (2) контрольная группа с имитацией интубации (SI); или (3) контрольная группа без интубации (UC). Проведите утвержденные процедуры идентификации, такие как татуирование лап [нетоксичными] чернилами с помощью иглы 30G x 1/2 in согласно схеме нумерации. По завершении татуирования верните детенышей матери.
  2. Подготовьте трубку (трубки) для интрагастральной интубации, используя полиэтиленовые (PE) трубки размеров 50 и 10. Общая длина этой трубки зависит от пользователя и может быть скорректирована соответствующим образом.
    1. С помощью микрохирургических ножниц отрежьте фрагмент трубки PE-50 длиной 3 in и фрагмент трубки PE-10 длиной 6 in.
    2. Осторожно прикрепите трубку PE-50 к стерильной подкожной игле 22 G x 1 in.
    3. Вставьте один конец трубки PE-10 в открытый конец трубки PE-50. Для облегчения ввода в трубку PE-50 может потребоваться сделать косой срез на кончике трубки PE-10.
    4. Отрежьте небольшой кусочек трубки PE-50 (около 2-3 mm) и наденьте его на открытый конец трубки PE-10. Он будет служить визуальным стопором.
    5. Храните готовую трубку для интрагастральной интубации в свежем 70% изопропиловом спирте для обеспечения стерильности.
  3. Соблюдая правила асептики, приготовьте исходный раствор молока в бутылочках объемом 50 mL. Исходный раствор молока основан на диетической формуле, впервые разработанной West et al. (1984)48. Храните бутылочки при -18 °C до использования. Перед применением разморозьте две бутылочки с молоком в теплой воде.
    1. С помощью стерильного шприца наберите 7.16 mL 95% этилового спирта (USP) и добавьте его в одну бутылочку с молоком объемом 50 mL. Таким образом получается 11.9% (об/об) раствор спирта, который вводится крысятам во время первых двух кормлений за день (см. 2.1.1); общая суточная доза спирта составляет 5.25 g/kg/day. Раствор разработан для доставки спирта в определенном объеме (0.0278 mL/g за одно кормление) в обогащенном молочном растворе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот объем может быть скорректирован в зависимости от размера помета и ожидаемого расхода в течение 3-4 дней. Количество добавляемого спирта также должно быть скорректировано для получения 11.9% (об/об) раствора.
    2. Тщательно взболтайте бутылочку и нанесите соответствующую маркировку (например, «11.9% (об/об) этиловый спирт в молоке»).
    3. Соответствующим образом промаркируйте вторую бутылочку с молоком (без добавления спирта) (например, «Только молоко») и используйте ее для дополнительных кормлений, как указано в 2.1.1.
    4. Храните обе бутылочки с молоком в холодильнике.

2. Воздействие алкоголя в неонатальный период (постнатальные дни 4–9)

  1. Начиная с PD 4, проводите щенкам групп AI и SI в общей сложности 4 интубации в день. Интервал между интубациями должен составлять 2 ч. Поскольку щенкам группы AI вводится реальный раствор, каждая из их интубаций считается кормлением.
    1. Первые два кормления в день проводите интубацию щенков группы AI раствором 11,9% v/v этилового спирта в молоке, а во время последних двух кормлений — раствором только из молока для поддержания их роста.
    2. Проводите интубацию щенков группы SI 4 раза каждые два часа без введения какого-либо раствора, чтобы обеспечить такое же время воздействия трубки PE-10, как и у щенков группы AI. Группа UC интубации не подвергается.
  2. Отделите щенков от матери и поместите их на терморегулируемый водяной нагревательный коврик для сохранения тепла. Взвесьте каждого щенка и запишите массу его тела (в г). Используйте заранее подготовленную таблицу кормления, чтобы определить объем интубации для каждого щенка группы AI, и занесите эти данные в регистрационный лист.
    1. Поместите раствор 11,9% v/v этилового спирта в молоке в теплую водяную баню и тщательно перемешайте.
    2. Процедура интрагастральной интубации:
      1. Тщательно промойте теплой водой трубку для интрагастральной интубации, хранившуюся в 70% изопропиловом спирте.
      2. Наберите необходимое количество раствора с помощью стерильного шприца объемом 1 mL.
      3. Смажьте кончик интубационной трубки (конец PE-10) свежим кукурузным маслом (это облегчает введение).
      4. Измерьте длину трубки PE-10 от рта щенка до желудка. Отрегулируйте стопор PE-50, чтобы он служил ориентиром точки остановки.
      5. Осторожно введите трубку PE-10 в рот щенка, проведите ее по пищеводу, слегка пройдя через гастроэзофагеальный сфинктер, в желудок. Осмотрите щенка, зафиксируйте его и нажмите на поршень шприца для подачи раствора. Делайте это медленно.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать случайного введения трубки в трахею, сначала направьте трубку так, чтобы она изгибалась и касалась мягкого неба, прежде чем продвигаться вперед. Используйте небо в качестве направляющей, так как трубка естественным образом отклонится от этой области и направится вниз по пищеводу. В противном случае любое значительное отклонение кончика в вентральном направлении может привести к его попаданию в трахею. Если вы не уверены в правильности положения трубки, лучше извлечь ее и не продолжать интубацию — введите трубку правильно при следующей попытке.
      6. Осторожно извлеките трубку PE-10 и проверьте щенка на наличие вытекания раствора, крови или физических повреждений. Если всё в порядке, верните щенка к однопометникам. Вся процедура интубации занимает менее 1 мин для каждого щенка и примерно 4 мин в общей сложности для 4 щенков, подвергающихся интубации, в каждом помете (2 AI, 2 SI).
      7. Процедура интрагастральной интубации для щенков группы SI: следуйте той же процедуре введения PE-10, что и для щенков группы AI, но без введения раствора в течение того же времени (1 мин).
      8. Сразу после завершения процедур для последнего щенка в помете верните всех щенков к матери. Верните мать в виварий до следующего сеанса кормления (через 2 ч).
      9. Промойте трубку для интрагастральной интубации теплой стерильной водой и поместите ее обратно в 70% изопропиловый спирт для хранения. Тщательно промывайте трубку водой перед каждым сеансом кормления.
      10. Повторите шаги с 2.2 (за исключением взвешивания щенков) по 2.2.2.9 для второго сеанса кормления. При последних двух кормлениях проводите интубацию щенков группы AI раствором только из молока, используя те же объемы интубации, что были определены в пункте 2.2.
  3. Взвешивайте крыс через регулярные интервалы, например, на PD 15 (при открытии глаз), PD 21 (отлучение от матери), PD 30, PD 60 и PD 90 (операция), чтобы получить репрезентативные кривые роста.

3. Изготовление и модификация электродов

  1. Изготовьте один электромиографический (ЭМГ) «головной блок» (headstage) для каждой крысы (Рисунок 2). Головной блок позволяет регистрировать ответы при моргании с помощью системы регистрации моргания (Рисунок 4).
    1. Соберите головной блок, состоящий из двух проволок из нержавеющей стали с политетрафторэтиленовым (ПТФЭ) покрытием размера 3T (по 5 cm каждая), одной проволоки из нержавеющей стали с ПТФЭ-покрытием размера 10T (5 cm), трех штыревых контактных выводов и одного изолятора микрополосного разъема, обрезанного до 3 отверстий (см. п. 3.1.4).
    2. Снимите ПТФЭ-покрытие с проволоки 10T, зажав её центр зубчатым высокоточным пинцетом и удаляя покрытие в обоих направлениях гладким высокоточным пинцетом. Убедитесь, что с этой проволоки удалены все следы покрытия.
      1. Обжмите один конец проволоки 10T с контактным выводом с помощью стоматологических плоскогубцев с зубчатой платформой; эта проволока будет служить заземлением. Осторожно зажмите проволоку 3T гладким высокоточным пинцетом на расстоянии 1–1.5 mm от одного из концов. Снимите ПТФЭ-покрытие длиной 1–1.5 mm, оставив остальную часть покрытия нетронутой. Обжмите контактный вывод на открытом конце проволоки 3T.
      2. Выполните те же действия для второй проволоки 3T. Обе проволоки будут служить положительным и отрицательным отводами регистрирующих ЭМГ-электродов.
    3. Проведите проверку на разрыв всех проволок, чтобы убедиться в надежности их крепления к выводам. Будьте осторожны, чтобы не согнуть и не повредить проволоки.
    4. Обрежьте сегмент изолятора разъема до 3.5 отверстий (разрежьте середину четвертого отверстия) лезвием стриппера. Укоротите этот сегмент ровно до 3 полных отверстий и, если необходимо, зашлифуйте обе стороны. Это поможет обеспечить наличие 3 полных отверстий. Вставьте узлы «вывод-проволока» в три отверстия микрополоски до тех пор, пока обжатые концы не будут вровень с нижним краем сегмента изолятора. Сборка с проволокой 10T должна находиться в одном из крайних отверстий микрополоски, а не в среднем.
  2. Модифицируйте биполярные стимулирующие электроды (Рисунок 2).
    1. Для каждой крысы подготовьте один биполярный стимулирующий электрод. Этот электрод подает небольшой электрический ток через изолятор стимула (см. систему регистрации моргания) в качестве шокового безусловного стимула (US) во время классического обусловливания (ECC). Электроды приобретаются у производителя в виде скрученных и экранированных проводов.
    2. Раскрутите два металлических отвода 2–3 раза, чтобы придать им V-образную форму (расстояние между концами 5 mm), затем с помощью гладкого высокоточного пинцета максимально выпрямите каждый «зубец». Соскребите лезвием бритвы 1 mm экрана с кончика каждого зубца (по всему периметру). Осмотрите каждый зубец на наличие неровностей и изгибов, при необходимости исправьте их, не снимая дополнительного экрана.
  3. Удалите заводское масло и посторонние загрязнения с ЭМГ-головных блоков и биполярных электродов, промыв их в 95% этиловом спирте. Дайте им высохнуть, затем подвергните автоклавированию.

figure-protocol-1
Рисунок 2: Электроды для электромиографической (ЭМГ) записи и биполярный электрод. Готовый входной каскад ЭМГ (справа, оранжевый) состоит из трех штыревых контактных выводов, двух проводов с PTFE-покрытием размера 3T, одного провода с PTFE-покрытием размера 10T и модифицированной микрополоски. Три провода длиной примерно 5 cm каждый обжаты на контактных выводах. Готовый биполярный электрод (справа, белый) расплетен, выпрямлен и придан V-образной форме (разнос 5 mm). Экранирование удалено с кончиков двух зубцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Процедура хирургической операции на веке (90-й постнатальный день)

  1. Подготовка материалов (подробная информация о расходных материалах см. в разделе «Материалы»), животных, операционной и нестерильной зон:
    1. Простерилизуйте в автоклаве хирургические инструменты и расходные материалы — число в скобках ( ) указывает примерное количество на одну взрослую крысу или одну процедуру измерения: хирургические инструменты (1 набор на 4 крыс, утвержденный ECU IACUC), марлевые салфетки (3-4), ватные тампоны (5-6), оберточная пленка 20 x 20 (4 на одну операцию), фарфоровый тигель (1), микрошпатель из нержавеющей стали (1), 0,9% физиологический раствор (1 промывочный флакон), чашка Петри (1) и винты из нержавеющей стали 0-80 (3 на крысу).
    2. Другие необходимые стерильные материалы: хирургический скальпель, лезвие размер 10 (1 на 4 крыс), хирургическая простыня (1 на крысу), ветеринарная офтальмологическая мазь, повидон-йод (1 промывочный флакон), гиподермическая игла 26G x 3/8" (2), никелированный зажим-держатель со сверлом #55, никелированная шлицевая часовая отвертка (лезвие 1,8-2 мм).
    3. Подготовьте стерильную зону для размещения всех хирургических инструментов и материалов, используя утвержденный дезинфекционный средство исследовательского или медицинского класса. Разместите материалы в этой зоне, когда она будет готова.
    4. Подготовьте стерильную операционную зону, используя утвержденное дезинфекционное средство исследовательского или медицинского класса. В этой зоне должны находиться терморегулируемая грелка с водой, стереотаксический аппарат с маской для анестезии крыс, стерилизатор с стеклянными шариками и газовый испаритель изофлурана (для анестезии). Испаритель имеет трубки, ведущие к маске для анестезии и к индукционной камере, расположенной в отдельной зоне для нестерильных процедур по подготовке животных; каждая трубка управляется собственным клапаном.
    5. Тщательно вымойте руки и предплечья антимикробным мылом. Не касаясь внутренней поверхности, предварительно откройте все предметы, упакованные в стерилизационные пакеты или обертки. Наденьте стерильные перчатки, соблюдая правила асептики, и перенесите все необходимые предметы в операционную зону. Установите сверло в зажим-держатель на нужную глубину (~ 2 мм) и подготовьте отвертку. Накройте стерильные материалы стерильной оберткой до начала операции.
    6. Подготовьте нестерильную зону с весами, электрическим триммером для шерсти, стерильными шприцами объемом 1 мл с иглами 26G x 3/8 дюйма (1 на крысу), журналом операций и бупренорфином (концентрация 0,03 мг/мл), который вводится в дозе 0,1 мл/100 грамм.
      ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: Бупренорфин является полусинтетическим опиоидом списка III DEA и должен храниться под замком с соответствующим учетом в журнале.
    7. Проверьте уровень газа в испарителе изофлурана; при необходимости дозаправьте его. Пока оставьте ручки регулировки потока и смеси закрытыми. Откройте баллон с O2 и убедитесь, что газа достаточно для всех операций.
    8. Взвесьте каждую крысу и запишите ее массу тела в журнал операций. Используйте таблицу инъекций бупренорфина для определения правильного объема введения.
    9. Откройте клапан испарителя, ведущий к индукционной камере, и оставьте закрытым клапан к операционной маске. Установите смесь на 3, а скорость потока на 3 (3% изофлурана с 100% O2 в качестве газа-носителя при объеме 3 л/мин).
    10. Поместите крысу в индукционную камеру и дождитесь достижения надлежащего уровня анестезии (замедленное дыхание, отсутствие педального рефлекса, отсутствие мигательного рефлекса). Извлеките крысу из камеры после достижения уровня анестезии.
    11. Выбрейте шерсть на голове с помощью триммера, обнажив достаточное количество кожи в месте разреза и на левом верхнем веке. При необходимости снова поместите животное в индукционную камеру для достижения уровня анестезии перед продолжением стрижки.
    12. Продезинфицируйте обнаженную кожу, поочередно протирая ее изопропиловым спиртом и повидон-йодом трижды. При необходимости снова поместите животное в индукционную камеру для достижения уровня анестезии перед переносом на операционный стол.
  2. Операция
    1. Откройте клапан испарителя, ведущий к маске для анестезии, и закройте клапан к индукционной камере. Установите смесь на 2,5, а скорость потока на 2 (2,5% изофлурана с 100% O2 в качестве газа-носителя при объеме 2 л/мин). Перенесите крысу в стереотаксический аппарат и следуйте стандартным процедурам по фиксации ее головы к резцовой и ушным планкам (пример см. у Geiger et al., 200849).
    2. Сделайте крысе предоперационную инъекцию бупренорфина (п/к) и осторожно утилизируйте иглу (без колпачка) в контейнер для острых предметов. Накройте крысу стерильной хирургической простыней, оставив открытой только операционную область и изолировав ее от остального тела.
    3. Наденьте хирургическую маску, шапочку, халат, защитные очки и любые другие средства индивидуальной защиты, требуемые IACUC. Тщательно вымойте руки и предплечья антимикробным мылом. Наденьте стерильные перчатки, соблюдая правила стерильности.
    4. С помощью ватного тампона нанесите небольшое количество офтальмологической мази в оба глаза, чтобы предотвратить их пересыхание.
    5. Приступайте к операции, когда крыса будет находиться в надлежащем состоянии анестезии. Непрерывно мониторируйте состояние животного на протяжении всей операции и периодически проверяйте уровень изофлурана. Регулируйте ручки потока и смеси в ходе операции в зависимости от реакции животного на анестезию.
    6. Сделайте передне-задний разрез по срединной линии черепа лезвием скальпеля. Разрез должен обнажить достаточную область перед глазами (т. е. лобную кость) и немного за лямбдовидным швом.
    7. Аккуратно соскребите надкостницу с верхней части черепа, стараясь не вызвать чрезмерного кровотечения. Удалите излишки соединительной ткани и крови ватным тампоном.
    8. Просверлите отверстие с помощью сверла и зажима-держателя, начиная непосредственно за коронарным швом на одной из теменных костей. Удалите кровь и костную крошку ватным тампоном. Захватите винт 0-80 за резьбу щелевым пинцетом и закрутите его в отверстие часовой отверткой; затяните винт ровно настолько, чтобы не повредить корковую ткань мозга (обычно 3-4 полных оборота).
    9. Повторите процедуры, описанные в п. 4.2.8, чтобы закрепить еще два винта 0-80 в черепе: один непосредственно за коронарным швом противоположной теменной кости и один непосредственно перед правым лямбдовидным швом. Было установлено, что 3 винтов достаточно для анкеровки стоматологического цемента (см. п. 4.2.18) к черепу, так как четвертый винт (перед левым лямбдовидным швом) помешал бы размещению биполярного электрода.
    10. Извлеките ЭМГ-головку из чашки Петри. Ориентируйте головку так, чтобы провод 10T находился с правой стороны крысы. Отогните провод 10T вверх, параллельно нижнему краю микрополоски. Слегка отогните его вправо, чтобы провод мог обогнуть передний и задний винты 0-80. Отложите его, но в пределах досягаемости.
    11. [Предполагая, что оператор правша] Возьмите зажим 3 дюйма в левую руку и зажим 4 дюйма в правую руку. Захватите верхний край кожи в месте разреза у левого глаза зажимом 4 дюйма и направьте зажим 3 дюйма к углу этого глаза; захватите кожу в этом углу. Удерживая кожу зажимом 3 дюйма, отпустите зажим 4 дюйма.
    12. Возьмите одну иглу 26G x 3/8 дюйма и введите ее через угол века; поверните иглу так, чтобы скошенный край был обращен вверх. С помощью микродиссекционных пинцетов с платформой вставьте средний провод 3T в отверстие иглы. Протолкните его через отверстие на несколько сантиметров, не вводя полностью; этот провод является отрицательным электродом.
    13. Выполните процедуры, описанные в п. 4.2.11 и 4.2.12, чтобы ввести внешний провод 3T в среднюю часть века; этот провод является положительным электродом.
    14. Зажмите обе иглы одной рукой, а головку — другой рукой (или пинцетом). Вытяните иглы из века, одновременно перемещая головку в том же направлении одним непрерывным движением. При необходимости поверните головку так, чтобы провод 10T был направлен к правому глазу животного; не допускайте перекрещивания проводов 3T. С помощью остроконечного пинцета убедитесь, что положительный электрод находится посередине века.
    15. Отрегулируйте положение головки так, чтобы она была центрирована между глазами и находилась в оптимальном положении на лобной кости, перед симметрично установленными винтами. Удерживая головку одной рукой, а зажим 3 дюйма другой, оберните провод 10T вокруг одного или обоих винтов со стороны 10T.
    16. Возьмите зажим 3 дюйма в одну руку и зажим 4 дюйма в другую. Используйте зажим 3 дюйма, чтобы захватить кожу в месте разреза в сторону левого виска. Используйте зажим 4 дюйма, чтобы создать небольшой «карман», отделив кожу (т. е. поверхностную фасцию) от височной мышцы. Используйте ирисные ножницы, чтобы иссечь больше соединительной ткани, двигаясь к углу левого глаза, для увеличения размера этого кармана. Будьте осторожны, не заходите слишком глубоко и не повредите кровеносные сосуды.
    17. Возьмите биполярный электрод и приформуйте провода так, чтобы они прилегали к изгибу височной ткани, при этом два зубца (дорсальный и вентральный) располагались позади левого глаза (см. видео), а нижний конец биполярного электрода находился прямо на черепе. Оставьте достаточное расстояние между головкой и этим электродом для беспрепятственного подключения штекеров коммутационного кабеля (Рисунок 3).
    18. Насыпьте порошок стоматологического цемента в тигель — начните примерно с 1/3 объема тигля, затем при необходимости отрегулируйте количество. Добавьте жидкий компонент до достижения водянистой консистенции и перемешайте компоненты шпателем. Когда консистенция цемента станет более вязкой, нанесите его на место разреза, перекрывая все края кожи с бортиками не менее 1/8 дюйма.
      1. Нанесите достаточное количество цемента для фиксации головки и биполярного электрода, не препятствуя при этом закрытию обоих глаз крысы. Быстро удалите любой цемент, капнувший на нежелательные участки шерсти крысы.
    19. Убедитесь, что как минимум 4-5 витков биполярного электрода остались не запечатанными цементом, чтобы можно было накрутить биполярный штекер (Рисунок 3). Удалите излишки цемента с головки — верхняя часть микрополоски и три контактных штыря должны быть чистыми. Цемент быстро затвердевает и может легко помешать полному сопряжению любого из этих электродов со штекерами коммутационного кабеля. Используйте щелевой пинцет для удаления частично засохшего излишнего цемента.
    20. Дождитесь затвердевания цемента; он станет прозрачным. Используйте микродиссекционные ножницы, чтобы отрезать излишки длины двух проводов 3T, оставив несколько сантиметров рабочего пространства.
    21. Возьмите микродиссекционный пинцет с платформой в левую руку, а остроконечный микродиссекционный пинцет в правую. Захватите один провод 3T левым пинцетом чуть перед веком. Правым пинцетом приподнимите веко, чтобы обнажить больше провода 3T, и удерживайте его. Отпустите левый пинцет и левой рукой захватите головку (убедитесь, что она теперь надежно закреплена). Правым пинцетом снимите часть тефлоновой (PTFE) изоляции, чтобы провод мог контактировать с круговой мышцей глаза (orbicularis oculi).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, не тяните провод 3T слишком сильно, так как он может отсоединиться от контактного штыря. Если провод отсоединится, заменить контактный штырь будет невозможно, так как затвердевший цемент не отделится от черепа без повреждения кости.
    22. Повторите шаги п. 4.2.21 для удаления излишков PTFE со второго провода 3T.
    23. Возьмите два микродиссекционных пинцета, как указано в п. 4.2.21 (с платформой в левой руке, остроконечный — в правой). Расположите левый пинцет чуть перед одним из проводов 3T, оставив место для правого пинцета непосредственно перед веком. Захватите провод обоими пинцетами.
      1. Создайте «крючок», удерживая правый пинцет неподвижно и поворачивая левый пинцет вверх и вокруг к веку; сделайте это одним движением. Осторожно отпустите правый пинцет, затем левый.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация электродов крючком на веках помогает минимизировать вероятность их трения о роговицу. Это также снижает вероятность разрыва провода на любом этапе поведенческого тестирования. Хотя фиксация не полностью предотвращает трение провода о роговицу у всех животных, обычно у них не наблюдается признаков повреждения глаз, что подтверждается высокими амплитудами мигания (измеренными цифровым осциллографом в п. 5.1.7) и ежедневными послеоперационными наблюдениями за состоянием здоровья (чрезмерное слезотечение, частичное закрытие века, отсутствие подвижности из-за повреждения глаза). Если у крысы появляются первые признаки дискомфорта, ее анестезируют изофлураном (см. п. 4.1.10), а электроды повторно проверяют и/или перепозиционируют. Наносится офтальмологическая мазь, чтобы предотвратить пересыхание роговицы. Ежедневно наблюдается наличие послепроцедурных осложнений со стороны глаз; в случае их сохранения следует обратиться за ветеринарной помощью. Крысы с тяжелыми осложнениями со стороны глаз, которые не могут быть устранены перепозиционированием электродов или ветеринарным лечением, подвергаются гуманной эвтаназии в соответствии со стандартными операционными процедурами ECU IACUC.
    24. Выполните действия из п. 4.2.23 для второго провода 3T. Отрежьте лишний провод микродиссекционными ножницами.
    25. Одной рукой освободите крысу из ушных планок, поддерживая ее тело другой рукой. Осмотрите голову на предмет крови или загрязнений, при необходимости очистите ее и сделайте послеоперационную инъекцию бупренорфина.
    26. Поместите крысу в контейнер для восстановления с источником тепла (например, терморегулируемой грелкой с водой), чтобы облегчить восстановление. Отметьте время окончания операции в журнале и внесите любые важные примечания о состоянии крысы во время операции. Следите за дыханием животного; когда оно примет положение лежа на груди или начнет двигаться, его можно вернуть в домашнюю клетку.
    27. Повторно стерилизуйте инструменты (кроме микродиссекционных пинцетов, так как они могут быть повреждены) с помощью стерилизатора с шариками; убедитесь, что операционная зона остается асептической, и повторите асептические процедуры, если будет выполняться несколько операций на веках.

5. Процедура классического обусловливания моргания

figure-protocol-2
Рисунок 3: Модифицированная камера для оперантного обусловливания при формировании мигательного рефлекса. Крысы являются свободно перемещающимися млекопитающими, поэтому для поддержания электрического контакта сигналов ЭМГ и биполярных штекеров, закрепленных на голове, используется вращающийся коммутатор. Коммутатор прикреплен к рычагу стойки, которая оснащена противовесом для снижения нагрузки на крысу. Пьезотвитер (динамик) подает сигнал частотой 2.8 kHz и интенсивностью 85 dB; эти значения регулярно калибруются. Акустический поролон способствует подавлению внешнего шума. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-protocol-3
Рисунок 4: Система кондиционирования мигания глаз. Эта специально разработанная система состоит из блока интегратора ЭМГ, который фильтрует и усиливает поступающие от крыс сигналы, блока управления стимулами, который подает различные стимулы в дополнение к звуковым сигналам и ударам тока, предусилителя для каждого оперантного бокса для увеличения усиления сигнала ЭМГ и изолятора стимулов для каждого оперантного бокса; система обеспечивает различные уровни тока (в mA). Цифровой осциллограф (не входит в стандартную систему кондиционирования мигания глаз) используется в диагностических целях во время привыкания и освоения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в большем размере.

  1. Начните габитуацию и обучение приобретению через 5 дней после операции. Посвятите один день ручному приручению каждой крысы и ее габитуации к тренировочному аппарату, который представляет собой модифицированную камеру для оперантного обусловливания, помещенную в более крупную звукоизолированную камеру (Рисунок 3), после чего проведите 6 дней обучения приобретению. Проводите сеансы габитуации и приобретения с использованием специально сконструированной системы регистрации мигания (Рисунок 4).
    1. Создайте файл журнала обучения и распечатайте его для ежедневного ведения записей. В этом журнале группы крыс должны быть распределены по тренировочным камерам псевдослучайным образом (или другим методом рандомизации).
    2. Включите систему регистрации мигания, компьютер и запустите соответствующее программное обеспечение. Данная версия ПО содержит различные модули (или приложения), работающие независимо. Запустите модуль Animal для создания файла *.RAT, содержащего информацию об объекте (номер сеанса, ID животного, пол, вес и номер камеры). Один RAT-файл позволяет управлять группой до четырех крыс. Введите соответствующие значения и сохраните файл. Создайте отдельный RAT-файл для каждой группы крыс, проходящих обучение.
    3. Перенесите крыс из вивария в помещение для тестирования и закройте дверь. Проводите ручное приручение каждой крысы в течение 5 мин.
    4. Поместите крысу в назначенную ей камеру и подключите разъемы ЭМГ и биполярного электрода от кабеля коммутатора к соответствующему ЭМГ-предусилителю и биполярному электроду на голове животного.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При первом контакте с кабелем коммутатора крыса может сопротивляться и проявлять признаки стресса. Обращайтесь с животным осторожно и делайте перерывы между неудачными попытками подключения, чтобы снизить уровень стресса.
    5. Используйте коммутатор, который вращается на 360°, обеспечивая непрерывную передачу и прием электрических сигналов при свободном перемещении крысы в камере. Он имеет 5 каналов (3 для ЭМГ-электродов, 2 для биполярных электродов), ведущих в блок интегратора ЭМГ, который фильтрует и усиливает исходный сигнал.
    6. Убедитесь, что крыса перемещается свободно и ей не мешает вес кабельного узла коммутатора или рычага стойки. При необходимости отрегулируйте противовес в задней части стойки. Проверьте надежность всех соединений, затем закройте дверь камеры. Выполните ту же процедуру подключения и проверки для всех крыс.
    7. Используйте осциллограф для мониторинга ЭМГ-активности на предмет аномальных сигналов (например, высокочастотной и/или высокоамплитудной электрической активности) и систему видеонаблюдения (если имеется) для контроля состояния животных (например, двигательной активности, чувствительности к окружающей среде, признаков боли). Отмечайте любые обнаруженные проблемы в журнале обучения.
    8. Дайте крысам привыкнуть к камерам в течение 10 мин, после чего верните их в домашние клетки.
    9. Очистите и продезинфицируйте оперантные камеры, подметите пол и протрите стол(ы). Проводите эти процедуры после каждого сеанса.
  2. Обучение приобретению проводится в течение 6 последовательных дней (сеансов).
    1. День 1: Поместите крысу в назначенную ей камеру и подключите разъемы ЭМГ и биполярного электрода от кабеля коммутатора к соответствующему ЭМГ-предусилителю и биполярному электроду на голове. Выполните те же процедуры, которые указаны в пунктах 5.1.6 и 5.1.7.
    2. Включите изоляторы стимулов и установите подаваемый ток на уровне 0.4 mA (4% от 10 mA, как показано на видео). Изоляторы подают электрический ток поочередно (т. е. от пробы к пробе) между дорсальным и вентральным штырями биполярного электрода. Это помогает уменьшить утомление мышечных волокон (в каждой точке стимуляции) при многократном подаче стимула.
    3. Наблюдайте за всеми реакциями мигания и проявлениями толерантности в каждой пробе для всех крыс. После каждой второй пробы увеличивайте интенсивность шокового БС на 0.4 mA для каждой крысы, пока не будет достигнуто значение 1.6 mA (на пробах 7 и 8). Перепроверяйте, что все крысы реагируют в камерах нормально, все настройки усиления и коэффициента усиления постоянны, а поступающие электрические сигналы корректны (т. е. низкий/минимальный шум ЭМГ). Используйте интенсивность шокового БС 1.6 mA во все дни обучения приобретению.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если крыса проявляет признаки боли при определенном уровне тока (например, высоко подпрыгивает, карабкается по стенкам, бегает по камере), проба приостанавливается, и значение тока возвращается к предыдущей настройке (на 0.4 mA ниже) на две пробы. После этого крысе снова подается более высокое значение тока, которое она не перенесла; если толерантность проявлена, значения увеличиваются до достижения 1.6 mA. Если животное не переносит ни одного из значений, на протяжении всего обучения используется следующее по величине меньшее значение (с шагом 0.4 mA), которое оно переносит.
    4. Используйте осциллограф для наблюдения за ЭМГ-активностью на предмет аномальных сигналов (например, высокочастотной и/или высокоамплитудной электрической активности) и систему видеонаблюдения для контроля состояния животного (например, двигательной активности, чувствительности к окружающей среде, признаков боли).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пояснение по Tracing ECC: Репрезентативная эпоха пробы с зафиксированными формами волн ЭМГ представлена на Рисунке 1, а процедура трассировки ECC подробно объяснена в видео. Файл обучения кондиционированию по типу «трассировка» (trace) настроен на проведение 100 проб (90 парных проб КС-БС и 10 проб только с КС на каждой 10th пробе) со средним межпробным интервалом 30 sec. Весь сеанс обучения длится примерно 52 min (при условии отсутствия остановок). Все крысы являются наивными в Сеансе 1 и будут демонстрировать различные кривые обучения (определяемые по экспрессии КР) по мере прохождения нескольких дней тренировок.
    5. Начните обучение: запустите программный модуль Blink. При появлении запроса выберите соответствующий RAT-файл и файл обучения для кондиционирования мигания по типу «трассировка» (trace).
    6. Запишите время начала и имя экспериментатора в журнале обучения. На данном этапе контролируйте все показатели: корректность сигналов ЭМГ, адекватность реакций мигания на шоковый БС (т. е. высокую частоту БР), состояние здоровья животных и правильную работу оборудования. Вносите любые заслуживающие внимания замечания в журнал обучения.
    7. Сбор данных осуществляется программным обеспечением автоматически в виде RAW-файлов (один на каждую крысу в день). RAW-файлы содержат амплитуду ЭМГ (в вольтах), подсчет частот, латентный период и площадные данные для реакций испуга (SR), БР и КР (общих и адаптивных). Артефакт от шока перекрывает первые 100 ms периода БР, поэтому данные БР содержатся только в последних 140 ms этого периода.
    8. По окончании обучения программа закроется автоматически. Извлеките всех крыс из тренировочных камер и верните их в виварий.
    9. Повторяйте шаги 5.2.5 – 5.2.6 во все последующие дни обучения. Перед запуском модуля Blink в конкретный день обновите номер сеанса в RAT-файле. Это позволит создавать новые RAW-файлы для всех крыс в этот день. У каждой крысы должно быть 6 RAW-файлов, при условии, что ни одно животное не было исключено из обучения.
  3. Обработайте RAW-файлы и создайте файл, отфильтрованный для статистического анализа.
    1. Запустите модуль Analysis. Просмотрите каждый сеанс для каждой крысы по каждой пробе на наличие проблемных случаев. Это делается для отсева проб, которые могли быть скомпрометированы по различным причинам (например, избыточная базовая активность перед КС, чрезмерные движения, отсоединение электрода, проблемы с кабелями/проводами). В ПО имеются алгоритмы, помогающие экспериментатору обнаруживать и удалять «плохие пробы» из набора отфильтрованных данных.
    2. Импортируйте отфильтрованные данные в программу для работы с электронными таблицами и проведите соответствующие статистические анализы.

Результаты

Программное обеспечение eyeblink способен обеспечить большой и всеобъемлющий набор данных для многих типов измерений. Для краткости мы приводим в этом исследовании, представитель результаты обучения и производительности меры, которые включают адаптивной CR процент, адаптивные CR амплитуды, UR процент и UR амплитуды. Адаптивный CR период был выбран как он представляет собой приобретение своевременный eyeblink ответов за повторное обучение, в результате расширения синаптической пластичности в гиппокампе во время трассировки ECC50,51,52. UR меры были выбраны для выяснения ли дефицит новорожденных алкоголя индуцированной обучения в след ECC были из-за перебоев в ассоциативные обучения или сбоев в реагировании на шок нас - что может свидетельствовать о мотивации или мотор различия, а не обучения различия между группами лечения. Данные для каждой меры были проанализированы с использованием 2 (секс) x 3 (неонатальной группы) x 6 (сессия) смешанного ANOVAs, с сессии как фактор повторил мер. Существенные основные эффекты для новорожденных лечение были проанализированы с помощью тестов post hoc Тьюки и значимых взаимодействий были проанализированы с помощью простых эффектов тестов. Все статистические анализы были проведены с использованием минимального уровня Альфа-0,05 и результаты в графах среднее ± SEM.

Начиная с адаптивной меру процент CR, ANOVA указал значительные основной эффект неонатальной группы, F(2,21) = 11,69, p < 0,001, но без существенных основной эффект секса (p = 0,71) или значительное взаимодействие между этими факторами (p = 0,20). Как ожидается, адаптивной CR доля увеличилась в течение шести сессий обучения, F(5, 105) = 81,15, p < 0,001 и различия между новорожденным групп были зависит от определенного уровня сессии, F(10, 105) = 4.58, p < 0,001. Существовали без других значимых взаимодействий, связанных с коэффициента сессии. Аналогичным образом для адаптивной CR амплитуды, был снова значительной основной эффект неонатальной группы, F(2,21) = 22.32, p < 0,001, но без существенных основной эффект секса (p = 0,21) или значительное взаимодействие между этими факторами (p = 0,48). Амплитуда CR также значительно увеличилось за шесть сессий обучения, F(5, 105) = 59.27, p < 0,001 и различия между новорожденным групп были зависит от определенного уровня сессии, F(10, 105) = 4,31, p < 0,001. В целом как CR меры показали значительные различия среди группы и эти средства значительно разделены на различных сессиях обучения. Чтобы подтвердить, какие группы существенно отличались, Тьюки post hoc тесты показали, что крысы интубированных алкоголя (AI) выполняется значительно хуже на обоих CR меры, чем unintubated контроль (UC) и Шам интубированных крысы (SI) (p < 0.01 процент CR; p < 0,001 для CR амплитуда), которые не отличаются друг от друга (p> 0,05). Простые эффекты испытания на значительные группы новорожденных x сессии взаимодействий для обеих мер CR, подтвердил, что AI крыс были более существенно нарушаются в приобретении CRs, начиная с сессии 2 и проведении сессии 6 по сравнению с UC и SI крысы (все p< 0,05), которая не отличается друг от друга на протяжении шести сессий. Единственным исключением был адаптивной CR амплитуды для SI крыс не начинают значительно отличаются от AI крысы до 3 сессии. Эти результаты показаны на рисунке 5А, 5б.

Существовали никаких существенных различий в UR меры из-за пола, неонатальной группы или взаимодействие этих факторов с фактором сессии. Эти негативные выводы указал, что каждая группа смогла выделяют eyeblink ответы на шок нас одинаково, и не были обучения дефицит наблюдается в AI крыс под влиянием мотивационные или мотор различия в мигающий (Рисунок 6A, 6В).

figure-results-1
Рисунок 5 : Приобретение трассировки кондиционером ответивших (среднее ± SEM). Раннего воздействия алкоголя (группы AI) существенно повлияло на приобретение адаптивной условный рефлекс (CR) процент (A) и амплитуды (B). Трассировка ECC является по своей природе трудно приобрести, поэтому меры относительно ниже, для всех групп - с задержкой ECC, доля может достигать 80-85% в FASD21,53-грызунов модели. Тем не менее трассировка ECC процедура является более таксировать на гиппокампе, который восприимчивыми к воздействию алкоголя во время раннего развития мозга. * = p < 0,05, ** = p < 0.01, *** = p < 0,001 между UC и ии крыс; в скобках указаны размеры выборки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 6 : Приобретение unconditioned ответов (средний ± SEM). Eyeblink производительности (процент UR и UR амплитуды) не был значительно отличаются между группами. Отсутствие различия указывают, что интенсивность шок, используемые во время приобретения учебных дифференциально не изменяют мотивации в AI крыс или их способности производить оборонительных мигать ответы на шок, по сравнению с обеих групп управления (UC и SI). В скобках указаны размеры выборки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Щенков новорожденных крыс, которые получил этилового спирта во время послеродовых дней 4-9 выставлены трассировки eyeblink принадлежности нарушениями в зрелом возрасте. Эти выводы поддерживают идею, что алкоголь является систему или тератогеном с терпя пагубное влияние на гиппокампа функции. В целом, кондиционером, отвечая в процедуре след был ниже для крыс воздействию алкоголя, по сравнению с крысами в обеих группах управления. Ассоциативные обучения расстройства в спирт облученных крыс были не под влиянием различия мотивационные или мотор (т.е., никаких различий в мигающий шок США интенсивности).

В то время как трассировки ECC является полезным диагностическим инструментом для разъяснения вызов индуцированной гиппокампа невропатология, результаты от этого метода должны быть помещены в надлежащий контекст. Во-первых основные процедурные элементы в этой демонстрации участие адресности алкоголя во время известных окна уязвимости для развивающегося мозга, изготовление электродов оборудования, которое позволяет записывать электромиографической активности и поставляет шок, хирургической имплантации вышеупомянутого оборудования, и последующие животных тестирования с помощью обучения парадигмы, которая оценивает когнитивной функции интерес. На каждом этапе процесса необходимо позаботиться чтобы не повредить ненужные/непредусмотренной субъектам грызунов и регулярно контролировать их признаки здоровья. Их поведенческих результаты обеспечивают «окна» для познания, психологической конструкции, только точно описано, когда их здоровье не скомпрометированы экспериментальной ошибки, охватывающих дозировки спирта, аппаратных дефектов или хирургической имплантации. Таким образом каждый процедурный элемент в процессе исследования должны осуществляться на прочной основе тем, что результаты от ECC могут быть экстраполированы на выводы в организме человека. Во-вторых ECC парадигма дает представление о характере обучения ассоциативные, но необходимо позаботиться не продлить выводы, используя этот подход и широко приписывают их в другие когнитивные домены - например рабочей памяти, короткие/долгосрочной памяти и сознания - если один включила некоторые аспекты этих доменов в рамках исследования ECC экспериментальный дизайн. Например эта демонстрация изучил этапа приобретения трассировки ECC обучения, но не рассматривала памяти хранения в крыс после того, как они завершили подготовку. Таким образом, память является независимым психологический процесс, который должен быть оценен в дополнение к обучению. Дизайн одно может включить интервал хранения памяти для оценки способности либо краткосрочной или долгосрочной памяти. В-третьих признание, что есть параллельной памяти систем54 , которые могут одновременно работать вместе с мотивационный, эмпирического и гормональные факторы, способствующие поведение, имеет важное значение для понимания, что ассоциативность (во время ECC), но один из многих процессов, которые показывают, что такое «хорошо» или «бедные» об обучении. Наконец трассировка ECC не является чисто гиппокампа зависимые задачи, как другие регионы мозга может посредничать некоторых компонент ЧР. Таким образом понимание взаимодействия между различными нейронных цепей и/или тип параметров стимул, которые используются в исследовании, должны приниматься во внимание при принятии последствия на основе дискретного результатов. Например, мозжечке, также способствует трассировки ECC, где она влияет на топографические характеристики CR и CR, сроки, особенно когда МСИ короткие по продолжительности. Трассировки ECC не подвергается в организме человека с повреждением мозжечка, которые тестируются с интервалом в длинный след (1000 мс), но это влияет в тех, которые получают короче трассировки интервал (400 мс)34. Кроме того двусторонним поражения спинной медиальной префронтальной коры (mPFC), которые регионов передней поясной и медиальной протискивается в мышей, предотвратить приобретение трассировки CRs55, в то время как уничтожение хвостового mPFC у кроликов производит аналогичные результаты46. Эти выводы также подчеркнуть важность рассмотрения что Межвидовые различия в префронтальной вклад мозжечка головного мозга стволовые ведомый ассоциативные обучения, например трассировки ECC. В то время как воздействия неонатальной алкоголя во время PD 4-9 пострадавшим приобретение 500-ms CRs трассировки для взрослых крыс в это исследование и другие47,56, это не же случай для новорожденных крыс воздействию алкоголя столкнуться интервале трассировки 300 мс, даже когда оспаривается в относительно высокой дозы алкоголя (5 г/кг)57, о том, что трассировка обесценения алкоголя облученных крыс зависит от длительности интервала трассировки.

В этом исследовании гиппокамп было подчеркнуто как жизненно важные для посреднических трассировки ECC и когда оспаривается неонатальной алкоголя экспозиции, экспонатов нейронных связанных с ущербом, отраженных от дефектов в приобретении трассировки CRs. Он должен, однако, предупредил, что мозжечка мозг стволовых схемотехника, особенно interpositus ядра, имеет важное значение для многих аспектов ECC, включая приобретение, выражения и топографических особенностей территории ЧР, в зависимости от типа задачи ECC, включая трассировки ECC36,40,55,,5859. Действительно этот нейронной цепи взаимодействует с гиппокампа для вождения выражение CRs во время высокого порядка форм ECC, например трассировки ECC60. Затрагивает ли воздействия алкоголя во время раннего развития мозга специально гиппокампа функции в трассировке ECC не вполне ясно. Многие регионы различных мозга уязвимы для раннего оскорбления алкоголя, включая mPFC, мозжечок и гиппокампа18,19,23,47,,6162, и это очень вероятно, что алкоголь нарушает функционирование этих структур в различной степени и разной, но функционально важные различия во многих процедурах ECC. Несмотря на недостатки относительно толкования результатов трассировки ECC исследований успешное приобретение трассировки CRs было показано по крайней мере полагаться на нетронутыми гиппокампа, поддержанные животных поражения исследования42,44,63,64,65. Таким образом, эта процедура остается весьма ценным подход для демонстрации связи между воздействием развития алкоголя проследить кондиционером отвечает потому, что нейронная цепь, лежащие в основе его, гораздо лучше понимать чем другие гиппокампа зависимых задач, таких как место обучения в лабиринте Моррис воды, Роман объекта признания и контекстуальных и следа страха принадлежности.

ECC как поведенческих метод для «проба» познания, имеет широкое применение в области развития neuroteratology. Действительно недавние выводы из нашей лаборатории поддерживают понятие, что развивающихся гиппокампа очень чувствительна к воздействию алкоголя, которые могут быть уменьшены путем различных интервенционных стратегий18,47. Ключевым преимуществом здесь является, что с лучшего понимания алкоголя индуцированной трассировки ECC обучения дефицита, они могут быть прогнозирования других проблем в гиппокампа функций за пределами ассоциативные обучения - особенно известно для быть опосредовано же гиппокампа neurocircuitry.

Приложение трассировки ECC и его другие варианты (например, задержки, отмены, дискриминации, составные) для выяснения нейробиологических механизмов и нервной систем, участвующих в ассоциативные обучения, может быть расширено за пределы области исследований плода алкоголь. Например эта парадигма получил много внимания в случаях заболевания людей и животных моделей психиатрических условий, таких как шизофрения66,67, нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера68,69и наркотиков злоупотреблений70,,7172. Ее преимущества, как метода исследования для оценки neurocognitive функции и дисфункции очевидны таким образом во многих психологических и биомедицинских дисциплинах, включая нейронауки.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Грант для TDT от алкоголя Фонд медицинских исследований и напитки (ABMRF).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Неонатальное воздействие алкоголя< / сильный>
190 пруф этиловый спирт (USP)Pharmco-AAPER225-36000 [ECU Medical Storage]Может быть заменен; должен быть УТП; избегайте использования 200 крепостного этилового спирта
Контейнер/корзина для щенковЛюбое
кукурузное маслоЛюбойпищевой
насос для нагрева воды с / ПрокладкиGaymarTP-500Для сохранения тепла у щенков; могут быть заменены:
иглы для подкожных инъекций 22G x 1 дюйм, стерильныелюбые
иглы для подкожных инъекций 30G x 1/2 дюйма, стерильныелюбые
изопропиловые спирты 70%EMD MilliporePX1840-4 [Fisher Scientific]Могут быть заменены; реагент grade
www.fishersci.com
Long-Evans Rats (самки и самцы заводчиков)Charles River LaboratoriesN/A [ECU Dept. of Comparative Medicine]Необходимо указать возраст и вес; цены варьируются в зависимости от этих факторов
www.criver.com
Микроножницы для препарирования, 3,5 дюйма, 23 мм лезвияBiomedical Research Instruments11-2200Для резки полиэтиленовых трубок
brisurgical.comПолиэтиленовая
трубка 10 (0,011 дюйма) Удостоверение личности; 0.024 дюйм О.Д.)BD Diagnostic Systems22-204008 [Fisher Scientific]Может быть заменено
www.fishersci.comТрубка
полиэтилена 50 (0,023 дюйма. Удостоверение личности; 0.038 дюйм О.Д.)Диагностические системы BD22270835 [Fisher Scientific]Может быть заменен
www.fishersci.com
Регулируемый водонагреватель или подогреватель детских бутылочек для молокаЛюбойОпционально; помогает с подогревом холодных молочных растворов
Туберкулиновые шприцы, Стерильные, 1,0 млЛюбые
Туберкулиновые шприцы, Стерильные, 10 млЛюбыеМожет использоваться для извлечения этилового спирта или использовать микропипетки подходящего размера
Весы для взвешиваниялюбогоДолжен иметь хорошее разрешение (в граммовых единицах)
Name<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
ЭМГ Изготовление сцены и биполярный электрод Модификация
биполярный электрод, 2-канальный скрученный пластик из нержавеющей сталиOne, Inc.MS303/2-B/SPC  ИЗБРАННЫЕ СС  2C TW .008"Необходимо указать пользовательскую длину 20 мм ниже пьедестала
www.plastics1.com
Centi-Loc Strip Socket Insulator (aka, Micro Strip)ITT Cannon / ITT Interconnect SolutionsCTA4-IS-60* или CTA4-1S-60**Зависит от поставщика; см. www.onlinecomponents.com или www.avnetexpress.avnet.com
Стоматологические плоскогубцы, зубчатыеCMF Medicon390.20.05Может быть заменен; использовать для обжима проводов к контактным контактам с наружной резьбой
www.medicon.de
Микроножницы для препарирования, лезвия 3,5 дюйма, 23 мм Инструментыдля биомедицинских исследований11-2200Используйте только для резки проводов 3T; резка проводов 10T повредит лезвие лезвия - используйте вместо этого лезвие устройства для снятия проводов
brisurgical.com
Проволока из нержавеющей стали с покрытием из ПТФЭ, 10T (диаметр 0,010 дюйма)Sigmund Cohn-Medwire316SS10T
www.sigmundcohn.com
Проволока из нержавеющей стали с покрытием из ПТФЭ, 3T (диаметр 0,003 дюйма)Sigmund Cohn-Medwire316SS3T
www.sigmundcohn.comЛезвие
бритвыЛюбоеДля снятия 1 мм зубцов биполярного электрода
Relia-Tac Socket Contact Pin, наружнаяCooper Interconnect220-P02-100См. Allied Electronics Cat # 70144761
www.alliedelec.com
Пинцет, высокоточный, зубчатый, 4 3/4 вэлектронной микроскопии78314-00DДля крепкого захвата проволоки 10T при зачище ПТФЭ гладким пинцетом
www.emsdiasum.com
Пинцет, высокоточный, гладкий, 4 3/4 вэлектронной микроскопии78313-00B
www.emsdiasum.com
Пинцет, ультратонкие наконечники, 4 3/4 вэлектронной микроскопии78510-0Зачистить 1 мм фторопласта с одного конца проволоки 3Т; захватить экранированную часть гладким пинцетом
www.emsdiasum.com
Средство для зачистки проволоки, 16-26 AWGЛюбоеИспользуйте конец лезвия для резки микрополосок
НазваниеCompanyНомер в каталогеКомментарии
Eyelid Surgery
Хирургические инструменты (высококачественная нержавеющая сталь)
2 х перевязочных щипца, 4 в зубчатыхбиомедицинских исследовательских инструментах30-1205Могут быть заменены; дополнительные щипцы для захвата электродов/винтов за пределами хирургического лотка
brisurgical.com
Перевязочные щипцы, 3 в зубчатыхбиомедицинских исследовательских инструментах30-1200Можно заменить
brisurgical.comЛоток
для инструментовИнструменты для биомедицинских исследований24-1355Можно заменить
brisurgical.comРукоятка
ножа No3, 5 вИнструменты для биомедицинских исследований26-1000Можно заменить
brisurgical.com
Микрощипцы для препарирования, 3,5 дюйма, тонкие точкиИнструменты для биомедицинских исследований10-1630Можно заменить
brisurgical.com
Микрощипцы для препарирования, 3,5 дюйма, гладкая платформа (0,3 x 5 мм)Инструменты для биомедицинских исследований10-1720
brisurgical.comМикро
Ножницы для препарирования, 3,5 дюйма, чрезвычайно тонкие, лезвия 15 ммИнструменты для биомедицинских исследований11-2000Можно заменить
brisurgical.com
Простые щипцы для заноз, 3,5 дюйма Инструменты для биомедицинских исследований30-1600Могут быть заменены
brisurgical.com
#10 Хирургическое лезвие из нержавеющей стали для ручки #3, стерильноеЛюбоеможет быть заменено
0-80 x 0.125 в винтах из нержавеющей стали PlasticsOne, Inc.0-80 x 0.125Может быть заменено
www.plastics1.com
Alcohol Prep Pads, SterileFisher Scientific22-363-750 [Fisher ScientificМожет быть заменено
www.fishersci.com
Betadine Povidone-IodinePurdue Frederick Co.6761815101 [Fisher Scientific]Можно заменить
www.fishersci.com
Betadine Povidone-Iodine PrepPads Moore Medical19-898-946 [Fisher Scientific]Можно заменить
www.fishersci.com
палочки, автоклавируемыелюбыеОбычно длина сверла 7,6 см или 15,2 см
для штифтовых тисков, #55 (0,052 дюйма)Любойметалл должен быть устойчив к ржавчине и коррозии
Марлевые прокладки, 2 в x 2 вFisher Scientific22-362-178 [Fisher Scientific]Можно заменить
www.fishersci.com
Универсальные латексные/нитриловые/виниловые перчатки общего назначениялюбые
Стерилизатор со стеклянными шарикамиЛюбойСтерилизация инструментов между операциями
Насос для терапии водой с подогревом с прокладками x 2GaymarTP-500Может быть заменен; рекомендуются отдельные насосы - 1 для хирургии, 1 для восстановления
Иглы для подкожных инъекций 26G x 3/8 дюйма, стерильныелюбые
изофлураныVedcoNDC 50989-150-12Производитель может быть заменен; может потребоваться ветеринарное одобрение
Система исофурана для испарителя, настольная, недышащаяParkland ScientificV3000PKМожет быть заменена
www.parklandscientific.comJewelers
Отвертка с лезвием 1,8-2 ммЛюбойметалл должен быть устойчив к ржавчине и коррозии
Ortho-Jet BCA Package (стоматологический цемент)Lang DentalB1334Содержит порошок (1 фунт) и жидкость
www.langdental.com
Кислородный баллон с регулятором давления, крупныйместный поставщик
Фарфоровый тигель, высокая форма, глазурованный, 10 млCoorsTek, Inc.07-965C [Fisher Scientific]Может быть заменен на Fisher FB-965-I Широкоформатный тигель
www.fishersci.com
Puralube Ветеринарная офтальмологическая мазь, стерильнаякомпания Henry Schein NC0144682[Fisher Scientific]Может быть заменена
www.fishersci.com
Quatricide PV-15Фармацевтическоепротивомикробное дезинфицирующее средство PV-15; может быть заменено
www.pharmacal.com
Маски для газовой анестезии крыс для стереотаксической хирургии Stoelting Company51610
www.stoeltingco.com
Rat Stereotaxic Apparatus with Ear Bars (45 градусов)Любыеполоски под углом 45 градусов рекомендуются для предотвращения повреждения барабанных перепонок
Roboz Surgical Instrument MilkRoboz SurgicalNC9358575 [Fisher Scientific]Может быть заменен; для смазки инструментов при автоклавировании
www.fishersci.com
Триммер для волос грызуновлюбой
хлорид натрияFisherScientific S641-500 [Fisher Scientific]Для получения 0,9% физиологического раствора; реагентный сорт; USP
www.fishersci.com
Микрошпатель из нержавеющей стали (лезвие: 0,75 л x 0,18 дюйма. W)Fisher Scientific21-401-15 [Fisher Scientific]Можетбыть заменено
www.fishersci.com
Starrett Pin Vise, 0,000 дюйма - 0,055 влюбомникелированном или эквивалентном, рекомендуемом для защиты от ржавчины и коррозии
Стерильные хирургические перчаткиЛюбые
стерилизационные пленки, 20 дюймов x 20 дюймов, автоклавируемыеPropper Manufacturing11-890-8C [Fisher Scientific]Полезно для упаковки автоклавируемых материалов и на стерильном поле во время операции
www.fishersci.com
Хирургическая простыня, стерильная/автоклавируемаяЛюбаяможет потребоваться обрезка по размеру для крыс
Хирургический халат*Любой*Еслимаска IACUC
Любые
туберкулиновые шприцы, стерильные, 1,0 млЛюбые
весыДолжны иметь хорошее разрешение (в граммовых единицах)
НазваниеCompanyНомер в каталогеКомментарии
Система и компоненты <сильного>мигающего мигания (при условии системы с 4 грызунами)
5-канальный коммутатор x 4Plastics One, Inc.SL2 + 3C
www.plastics1.com
Биполярный электродный кабель, двойной 305 x 4Plastics One, Inc.305-305 80CM TT2 (C)Обеспечивает разъем для подключения биполярного электрода на крысе и к коммутатору; должен быть модифицирован
www.plastics1.com
Кабель, 5 каналов, экранированный, 26 AWG x 4Любой Дляизготовления коллекторного кабеля; это должно быть изготовлено с нуля
Камера для Оперантного Тестового Бокса (Внутри: 24 В x 23 Ш x 14 Г дюймов) x 4Med-AssociatesМогут быть заменены; внутренние размеры должны удобно помещаться в оперантном тестовом боксе, с местом для акустической пены; подходить с вентилятором - 55-60 дБ
www.med-associates.com
Eyeblink Система и программное обеспечениеJSA DesignsN/AЗапатентовано и адаптировано для исследовательской лаборатории
Термоусадочная трубка (диаметр 3/16 дюйма, 1/4 дюйма, 3/8 дюйма, 1/2 дюйма)ЛюбойДля защиты припаянных концов и сращивания модифицированного коллекторного кабеля
Melamine Triple Peak Acoustical Foam с черным гипалоном (24 x 48 дюймов)McMaster-Carr9162T5Может быть заменен; обрезано по размеру 4 камер корпуса
www.mcmaster.com
Оперантный тестовый бокс (внешний 12,5 д x 10 Ш x 13,5 дюйма в В), полный x 4Med-AssociatesENV-007 Custom PackageС решетчатым полом из нержавеющей стали и нестандартным верхом (3 отверстия в центре для коммутаторного кабеля)
www.med-associates.com
Осциллограф (опционально)ЛюбойРекомендуемые минимальные характеристики: аналоговая полоса пропускания 200 МГц, дискретизация в реальном времени 1 Гвыб/с, 4 канала; см. www.picotech.com
/td>
Пьезодинамики (динамики) x 4 (7 x 3 дюйма)MCM Electronics53-805Должны соответствовать спецификациям частотного диапазона для системы с миганием глазом (2500 Гц - 25 кГц)
www.mcmelectronics.com
Паяльная станция, припой, флюс, оловянкалюбаяДля пайки кабелей 26 AWG к гнездам (к которым подходят штекерные контакты relia-tac) и биполярным штекерам
Stimulus Isolators x 4WPI InternationalA365Эти блоки работают от щелочных батареек 16-9 В; доступна подходящая перезаряжаемая версия (A365R)
www.wpiinc.com
Триполярный электродный кабель для коммутатора SL3C x 4Plastics One, Инк.335-335 80 см TT3 CОбеспечивает заглушку для головки ЭМГ на крысе и коллектора; необходимо модифицировать
www.plastics1.com
USB Светодиодные лампы x 4Любыелампы на основе USB не вызывают электрического "шума" с помощью сигналов ЭМГ от крыс
www.plastics1.com
Webcams x 4, программы для видеонаблюдениялюбой
ПК, компьютер под управлением ОС MS Windows, любой
из вилка Ватные требуется хирургическая Любые

Ссылки

  1. Jones, K. L., Smith, D. W. Recognition of the fetal alcohol syndrome in early infancy. Lancet. 2, 999-1001 (1973).
  2. Stratton, K. R., Howe, C. J., Battaglia, F. C. Fetal alcohol syndrome: Diagnosis, epidemiology, prevention, and treatment. , National Academy Press. (1996).
  3. Streissguth, A. P., Barr, H. M., Martin, D. C., Herman, C. S. Effects of maternal alcohol, nicotine, and caffeine use during pregnancy on infant mental and motor development at eight months. Alcohol Clin Exp Res. 4 (2), 152-164 (1980).
  4. Streissguth, A. P., O'Malley, K. Neuropsychiatric implications and long-term consequences of fetal alcohol spectrum disorders. Semin Clin Neuropsychiatry. 5 (3), 177-190 (2000).
  5. May, P. A., et al. Prevalence and epidemiologic characteristics of FASD from various research methods with an emphasis on recent in-school studies. Dev Disabil Res Rev. 15 (3), 176-192 (2009).
  6. Sowell, E. R., et al. Mapping callosal morphology and cognitive correlates: Effects of heavy prenatal alcohol exposure. Neurology. 57 (2), 235-244 (2001).
  7. Sowell, E. R., et al. Abnormal development of the cerebellar vermis in children prenatally exposed to alcohol: Size reduction in lobules I-V. Alcohol Clin Exp Res. 20 (1), 31-34 (1996).
  8. Autti-Ramo, I., et al. MRI findings in children with school problems who had been exposed prenatally to alcohol. Dev Med Child Neurol. 44 (2), 98-106 (2002).
  9. Hamilton, D. A., Kodituwakku, P., Sutherland, R. J., Savage, D. D. Children with Fetal Alcohol Syndrome are impaired at place learning but not cued-navigation in a virtual Morris water task. Behav Brain Res. 143 (1), 85-94 (2003).
  10. Uecker, A., Nadel, L. Spatial but not object memory impairments in children with fetal alcohol syndrome. Am J Ment Retard. 103 (1), 12-18 (1998).
  11. Uecker, A., Nadel, L. Spatial locations gone awry: object and spatial memory deficits in children with fetal alcohol syndrome. Neuropsychologia. 34 (3), 209-223 (1996).
  12. Goodlett, C. R., Lundahl, K. R. Temporal determinants of neonatal alcohol-induced cerebellar damage and motor performance deficits. Pharmacol Biochem Behav. 55 (4), 531-540 (1996).
  13. Goodlett, C. R., Kelly, S. J., West, J. R. Early postnatal alcohol exposure that produces high blood alcohol levels impairs development of spatial navigation learning. Psychobiol. 15, 64-74 (1987).
  14. Bayer, S. A., Altman, J., Russo, R. J., Zhang, X. Timetables of neurogenesis in the human brain based on experimentally determined patterns in the rat. Neurotoxicol. 14 (1), 83-144 (1993).
  15. Dobbing, J., Sands, J. Quantitative growth and development of human brain. Arch Dis Child. 48 (10), 757-767 (1973).
  16. West, J. R. Fetal alcohol-induced brain damage and the problem of determining temporal vulnerability: A review. Alcohol Drug Res. 7 (5-6), 423-441 (1987).
  17. Zecevic, N., Rakic, P. Differentiation of Purkinje cells and their relationship to other components of developing cerebellar cortex in man. J Comp Neurol. 167, 27-48 (1976).
  18. Rufer, E. S., et al. Adequacy of maternal iron status protects against behavioral, neuroanatomical, and growth deficits in fetal alcohol spectrum disorders. PLoS One. 7 (10), e47499(2012).
  19. Tran, T. D., Kelly, S. J. Critical periods for ethanol-induced cell loss in the hippocampal formation. Neurotoxicol Teratol. 25 (5), 519-528 (2003).
  20. Pierce, D. R., Goodlett, C. R., West, J. R. Differential neuronal loss following early postnatal alcohol exposure. Teratology. 40 (2), 113-126 (1989).
  21. Tran, T. D., Jackson, H. J., Horn, K. H., Goodlett, C. R. Vitamin E does not protect against neonatal ethanol-induced cerebellar damage or deficits in eyeblink classical conditioning in rats. Alcohol Clin Exp Res. 29 (1), 117-129 (2005).
  22. Goodlett, C. R., Peterson, S. D., Lundahl, K. R., Pearlman, A. D. Binge-like alcohol exposure of neonatal rats via intragastric intubation induces both Purkinje cell loss and cortical astrogliosis. Alcohol Clin Exp Res. 21 (6), 1010-1017 (1997).
  23. Green, J. T., Tran, T. D., Steinmetz, J. E., Goodlett, C. R. Neonatal ethanol produces cerebellar deep nuclear cell loss and correlated disruption of eyeblink conditioning in adult rats. Brain Res. 956, 302-311 (2002).
  24. Cronise, K., Marino, M. D., Tran, T. D., Kelly, S. J. Critical periods for the effects of alcohol exposure on learning in rats. Behav Neurosci. 115 (1), 138-145 (2001).
  25. Tran, T. D., Cronise, K., Marino, M. D., Jenkins, W. J., Kelly, S. J. Critical periods for the effects of alcohol exposure on brain weight, body weight, activity and investigation. Behav Brain Res. 116 (1), 99-110 (2000).
  26. Steinmetz, J. E. Brain substrates of classical eyeblink conditioning: A highly localized but also distributed system. Behav Brain Res. 110 (1-2), 13-24 (2000).
  27. Thompson, R. F. The neurobiology of learning and memory. Science. 233 (4767), 941-947 (1986).
  28. Ivkovich, D., Eckerman, C. O., Krasnegor, N. A., Stanton, M. E. Eyeblink classical conditioning: Vol. 1 Applications in humans. Woodruff-Pak, D. S., Steinmetz, J. E. , Kluwer Academic Publishers. 119-142 (2000).
  29. Woodruff-Pak, D. S., Steinmetz, J. E. Eyeblink classical conditioning: Volume I - Applications in humans. , Kluwer Academic Publishers. (2000).
  30. Woodruff-Pak, D. S., Steinmetz, J. E. Eyeblink classical conditioning: Volume II - Animal models. , Kluwer Academic Publishers. (2000).
  31. Kishimoto, Y., et al. Implicit Memory in Monkeys: Development of a Delay Eyeblink Conditioning System with Parallel Electromyographic and High-Speed Video Measurements. PLoS One. 10 (6), e0129828(2015).
  32. Chen, L., Bao, S., Lockard, J. M., Kim, J. K., Thompson, R. F. Impaired classical eyeblink conditioning in cerebellar-lesioned and Purkinje cell degeneration (pcd) mutant mice. J Neurosci. 16 (8), 2829-2838 (1996).
  33. Freeman, J. H. Jr, Carter, C. S., Stanton, M. E. Early cerebellar lesions impair eyeblink conditioning in developing rats: Differential effects of unilateral lesions on postnatal day 10 or 20. Behav Neurosci. 109 (5), 893-902 (1995).
  34. Gerwig, M., et al. Trace eyeblink conditioning in patients with cerebellar degeneration: Comparison of short and long trace intervals. Exp Brain Res. 187 (1), 85-96 (2008).
  35. LaBar, K. S., Disterhoft, J. F. Conditioning, awareness, and the hippocampus. Hippocampus. 8 (6), 620-626 (1998).
  36. McCormick, D. A., Steinmetz, J. E., Thompson, R. F. Lesions of the inferior olivary complex cause extinction of the classically conditioned eyeblink response. Brain Res. 359 (1-2), 120-130 (1985).
  37. Clark, R. E., Zola, S. Trace eyeblink classical conditioning in the monkey: a nonsurgical method and behavioral analysis. Behav Neurosci. 112 (5), 1062-1068 (1998).
  38. Anderson, B. J., Steinmetz, J. E. Cerebellar and brainstem circuits involved in classical eyeblink conditioning. Rev Neurosci. 5 (3), 251-273 (1994).
  39. Thompson, R. F., Krupa, D. J. Organization of memory traces in the mammalian brain. Annu Rev Neurosci. 17, 519-549 (1994).
  40. Miller, M. J., et al. fMRI of the conscious rabbit during unilateral classical eyeblink conditioning reveals bilateral cerebellar activation. J Neurosci. 23 (37), 11753-11758 (2003).
  41. Geinisman, Y., et al. Remodeling of hippocampal synapses after hippocampus-dependent associative learning. J Comp Neurol. 417 (1), 49-59 (2000).
  42. Ivkovich, D., Stanton, M. E. Effects of early hippocampal lesions on trace, delay, and long-delay eyeblink conditioning in developing rats. Neurobiol Learn Mem. 76 (3), 426-446 (2001).
  43. Moyer, J. R. Jr, Deyo, R. A., Disterhoft, J. F. Hippocampectomy disrupts trace eye-blink conditioning in rabbits. Behav Neurosci. 104 (2), 243-252 (1990).
  44. Solomon, P. R., Vander Schaaf, E. R., Thompson, R. F., Weisz, D. J. Hippocampus and trace conditioning of the rabbit's classically conditioned nictitating membrane response. Behav Neurosci. 100 (5), 729-744 (1986).
  45. Kronforst-Collins, M. A., Disterhoft, J. F. Lesions of the caudal area of rabbit medial prefrontal cortex impair trace eyeblink conditioning. Neurobiol Learn Mem. 69 (2), 147-162 (1998).
  46. Weible, A. P., McEchron, M. D., Disterhoft, J. F. Cortical involvement in acquisition and extinction of trace eyeblink conditioning. Behav Neurosci. 114 (6), 1058-1067 (2000).
  47. Thomas, J. D., Tran, T. D. Choline supplementation mitigates trace, but not delay, eyeblink conditioning deficits in rats exposed to alcohol during development. Hippocampus. 22 (3), 619-630 (2012).
  48. West, J. R., Hamre, K. M., Pierce, D. R. Delay in brain growth induced by alcohol in artificially reared rat pups. Alcohol. 1 (3), 213-222 (1984).
  49. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J Vis Exp. (20), e880(2008).
  50. Christian, K. M., Thompson, R. F. Neural substrates of eyeblink conditioning: acquisition and retention. Learn Mem. 10 (6), 427-455 (2003).
  51. Kishimoto, Y., Nakazawa, K., Tonegawa, S., Kirino, Y., Kano, M. Hippocampal CA3 NMDA receptors are crucial for adaptive timing of trace eyeblink conditioned response. J Neurosci. 26 (5), 1562-1570 (2006).
  52. Shors, T. J., et al. Neurogenesis in the adult is involved in the formation of trace memories. Nature. 410 (6826), 372-376 (2001).
  53. Tran, T. D., Stanton, M. E., Goodlett, C. R. Binge-like ethanol exposure during the early postnatal period impairs eyeblink conditioning of short and long CS-US intervals in rats. Dev Psychobiol. 49 (6), 589-605 (2007).
  54. Mizumori, S. J., Yeshenko, O., Gill, K. M., Davis, D. M. Parallel processing across neural systems: Implications for a multiple memory system hypothesis. Neurobiol Learn Mem. 82 (3), 278-298 (2004).
  55. Siegel, J. J., et al. Trace Eyeblink Conditioning in Mice Is Dependent upon the Dorsal Medial Prefrontal Cortex, Cerebellum, and Amygdala: Behavioral Characterization and Functional Circuitry(1,2,3). eNeuro. 2 (4), (2015).
  56. Murawski, N. J., Jablonski, S. A., Brown, K. L., Stanton, M. E. Effects of neonatal alcohol dose and exposure window on long delay and trace eyeblink conditioning in juvenile rats. Behav Brain Res. 236 (1), 307-318 (2013).
  57. Lindquist, D. H. Hippocampal-dependent Pavlovian conditioning in adult rats exposed to binge-like doses of ethanol as neonates. Behav Brain Res. 242, 191-199 (2013).
  58. Ivarsson, M., Svensson, P. Conditioned eyeblink response consists of two distinct components. J Neurophysiol. 83 (2), 796-807 (2000).
  59. Woodruff-Pak, D. S., Lavond, D. G., Thompson, R. F. Trace conditioning: abolished by cerebellar nuclear lesions but not lateral cerebellar cortex aspirations. Brain Res. 348 (2), 249-260 (1985).
  60. Takehara-Nishiuchi, K. The Anatomy and Physiology of Eyeblink Classical Conditioning. Curr Top Behav Neurosci. , (2016).
  61. Mattson, S. N., Schoenfeld, A. M., Riley, E. P. Teratogenic effects of alcohol on brain and behavior. Alcohol Res Health. 25 (3), 185-191 (2001).
  62. Goodfellow, M. J., Abdulla, K. A., Lindquist, D. H. Neonatal Ethanol Exposure Impairs Trace Fear Conditioning and Alters NMDA Receptor Subunit Expression in Adult Male and Female Rats. Alcohol Clin Exp Res. 40 (2), 309-318 (2016).
  63. Beylin, A. V., et al. The role of the hippocampus in trace conditioning: Temporal discontinuity or task difficulty? Neurobiol Learn Mem. 76 (3), 447-461 (2001).
  64. Port, R. L., Romano, A. G., Steinmetz, J. E., Mikhail, A. A., Patterson, M. M. Retention and acquisition of classical trace conditioned responses by rabbits with hippocampal lesions. Behav Neurosci. 100 (5), 745-752 (1986).
  65. Weiss, C., Bouwmeester, H., Power, J. M., Disterhoft, J. F. Hippocampal lesions prevent trace eyeblink conditioning in the freely moving rat. Behav Brain Res. 99 (2), 123-132 (1999).
  66. Brown, S. M., et al. Eyeblink conditioning deficits indicate timing and cerebellar abnormalities in schizophrenia. Brain Cogn. 58 (1), 94-108 (2005).
  67. Sears, L. L., Steinmetz, J. E. Effects of haloperidol on sensory processing in the hippocampus during classical eyeblink conditioning. Psychopharmacology. 130 (3), 254-260 (1997).
  68. Kronforst-Collins, M. A., Moriearty, P. L., Schmidt, B., Disterhoft, J. F. Metrifonate improves associative learning and retention in aging rabbits. Behav Neurosci. 111 (5), 1031-1040 (1997).
  69. Woodruff-Pak, D. S., Finkbiner, R. G., Sasse, D. K. Eyeblink conditioning discriminates Alzheimer's patients from non-demented aged. Neuroreport. 1 (1), 45-48 (1990).
  70. Oristaglio, J., Romano, A. G., Harvey, J. A. Amphetamine influences conditioned response timing and laterality of anterior cingulate cortex activity during rabbit delay eyeblink conditioning. Neurobiol Learn Mem. 92 (1), 1-18 (2009).
  71. Scavio, M. J., Clift, P. S., Wills, J. C. Posttraining effects of amphetamine, chlorpromazine, ketamine, and scopolamine on the acquisition and extinction of the rabbit's conditioned nictitating membrane response. Behav Neurosci. 106 (6), 900-908 (1992).
  72. Fortier, C. B., et al. Delay discrimination and reversal eyeblink classical conditioning in abstinent chronic alcoholics. Neuropsychology. 22 (2), 196-208 (2008).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи