Определено и масштабируемая Генерация гепатоцитов-подобных клеток из человеческих плюрипотентные стволовые клетки

Первичная человеческих тканей, и производные типы клеток регулярно используются, как для клеток на основе скрининга и в клинике. Однако доступ к этим клеткам сильно ограничены из - за недостаточной донорства органов и потеря клеточных фенотипов после изоляции ^1. hPSCs представляют собой многообещающую альтернативу для первичной ткани и облегчают создание генетически определенных и возобновляемых соматических клеток человека. Гепатоцитов-подобные клетки (HLCS), полученные из hPSCs уже показали обещание в этой области. Напоминают первичные КГ гепатоциты человека в различных аспектах, в том числе морфологии клеток, экспрессию генов гепатоцитов, метаболические функции, а также чувствительность к лекарствам и вирусов ^{2, 3, 4, 5, 6, 7, 8.} Кроме того, неограниченное распространение исамообновлению мощность обоих и GMP исследователями класса hPSCs облегчает их применение ^{9, 10.}

В течение десяти лет исследований подготовил ряд процедур дифференцировки гепатоцитов эффективность ^{2, 3, 5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20.} Тем не менее, большинство из этих систем используют неопределенные компоненты и / или вирусной трансдукции для привода гепатоцеллюлярной спецификации. Для повышения надежности технологии в масштабе, важно разработать надежную дифференцировку гепатоцитовсистема, которая действительно определена, ксено-свободный, и GMP-совместимый.

Ламининами (LNS) являются важными белки внеклеточного матрикса, которые могут влиять на клеточную адгезию, пролиферацию, миграцию и дифференциацию. Ламининами являются гетеротримерные гликопротеины, состоящие из одного альфа, бета, один и один гамма цепи. В последнее время рекомбинантные человеческие ламинины были получены и использованы в клеточной биологии. LN-511 было показано , чтобы поддержать содержание hPSCs ^21, в то время как смесь LN-521 и Е-кадгерина позволяет клонального деривация и расширение человеческих эмбриональных стволовых клеток ^22. LN-111, с другой стороны, поддерживает содержание hepatoblast-подобных клеток , полученных из hPSCs ^23. Тем не менее, до нашего доклада, ламининами 521 и 111 не были использованы для создания HLCS с созревшими характеристиками из hPSCs ^10.

Здесь мы подробно процедуры для культивирования hPSCs на LN-521и дифференцировать их на либо LN-521 или смесь LN-521 и LN-111 (LN-521 / LN-111). Мы оптимизировали протокол дифференцировки с использованием одноклеточного высев для создания высоко воспроизводимую и однородный монослой во многих КГ форматов ^14. Мы считаем, что наша определенная система дифференциации представляет собой простой и экономически эффективный метод для производства активных HLCS для применения, что представляет собой значительный шаг вперед в этой области.

Примечание: Информация о продавце для всех реагентов , используемых в этом протоколе были перечислены в таблице 1. Все средства массовой информации / плиты должны быть стерильными и по крайней мере, при комнатной температуре, когда клетки должны иметь прямой контакт с ними.

1. Пассирование Человеческий плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) на Laminin 521

Примечание: Процедура ячейки пассажи, описанная ниже, основана на отдельных клеток и является идеальным решением для вывода однородной популяции гепатоцитов-подобных клеток из hPSCs. Колонии покрытие также применимо и было описано ранее ^24.

1. Готовят ламининовым покрытием пластины по мере необходимости.
   1. Разморозить 100 мкг / мл маточного рекомбинантного ламинин 521 (LN-521) при 4 ° С.
   2. Развести талой LN-521 в ледяном 1x ДЗФР (с Ca ²⁺ / Mg ²⁺⁾ , чтобы сделать 5 мкг раствора / мл.
   3. Добавить 1 мл 5 мкг / мл LN-521 раствор для покрытия одну лунку 6-луночного планшетаи рок, чтобы распространить его равномерно в скважине.
   4. Инкубируйте пластины в 37 ° C / 5% CO ₂ клеточной культуре инкубатора в течение 2 - 4 ч для срочного использования или в 4 ° C холодильнике в течение ночи.
   5. Хранить Laminin покрытием пластин в 4 ° C холодильник по мере необходимости. Хранить пластины на плоской поверхности, и запечатать их, чтобы избежать испарения и загрязнения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не позволяйте лунки, покрытые высыхают; сверху на них с дополнительной 1x ДЗФР (с Ca ²⁺ / Mg ²⁺⁾ , если требуется. Используйте пластины в течение 2-х недель.
2. Дайте необходимое количество предварительно покрытых пластин нагреться до комнатной температуры перед использованием или инкубировать пластин при 37 ° С в течение 0,5 - 1 ч.
3. Тщательно аспирата покрытие решение LN-521 без повреждения поверхности с покрытием. Примечание: Очень важно, чтобы не повредить поверхность с покрытием перед посевом клеток на ней.
4. Немедленно добавьте 1 мл подогретого-mTeSR1 среде с добавлением 10 мкМ Rho-ассоциированной киназы (ROCK) ингибитор У27632 на одну лунку 6-луночного планшета. Оставьте пластину в инкубаторе для культивирования клеток, чтобы получить клетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не позволяйте ламинин покрытием скважины, чтобы высушить.
5. Аспирируйте среды из ухоженных hPSCs примерно от 75% до 85% сплошности. Промывают клетки из одной лунке 6-луночного планшета один раз с 1 мл комнатной температуры 1x ДЗФР (без Ca ²⁺ / Mg ^2+).
6. Добавьте 0,5 мл 1x Accutase к клеткам и инкубируют при 37 ° С в течение 6 - 8 мин для диссоциации клеток.
   Примечание: Для того, чтобы проверить, является ли пищеварение достаточно долго или нет, аккуратно нажмите на тарелку и проверить, могут ли клетки легко отсоединить. Если да, то пришло время, чтобы остановить ферментативной реакции; если нет, расширить пищеварение за дополнительную 1 - 2 мин.
7. Прекратить диссоциации путем добавления 2 мл свежей среды mTeSR1 с добавлением 10 мкМ Y27632 к клеткам. Пипетка вверх и вниз с помощью P1000 чаевые несколько раз, чтобы сделать одну-клеточную суспензию.
8. Количество жизнеспособных клеток с использованием гемоцитометра.Использование трипанового синего , чтобы пятно и исключить мертвые клетки ¹⁴
9. Подсчитайте общее количество клеток, необходимых. Для рутинного HPSC пассирования, семена 4 х 10 ⁵ до 5 × 10 ⁵ клеток на лунку 6-луночного планшета (т.е. 4,21 х 10 ⁴ до 5,26 · 10 ⁴ на см ^2). Для пересева hPSCs для дифференцировки гепатоцитов, семян 6,5 х 10 ⁵ до 7,5 × 10 ⁵ (т.е. 6,84 х 10 ⁴ 7,89 × 10 ⁴ на см ²⁾ клеток на лунку 6-луночного планшета.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность высева для каждой клеточной линии может потребоваться незначительные оптимизации на основе эмпирической плотности приведенной здесь для печеночной дифференцировки.
10. Перенести необходимую клеточную суспензию в стерильный 15 мл или 50 мл центрифужную пробирку и центрифугируют при 115 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
11. Аспирируйте супернатант медленно, а затем ресуспендируют осадок клеток в свежей, теплой среде mTeSR1 с добавлением 10 мкМ Rho-ассоциированной киназы (ROCK) inhibitoг Y27632, используя адекватную среду, чтобы найти требуемую плотность клеток.
    Примечание: Использование ингибитора ROCK настоятельно рекомендуется в целях повышения прикрепление клеток и выживаемость.
12. Семенной клетки на подготовленные тарелки и рок их взад и вперед и из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить клетки.
    Примечание: Очень важно, чтобы гарантировать, что клетки равномерно распределены в лунках ли пластина для рутинного культуры клеток или дифференцировки гепатоцитов экспериментов.
13. Место пластин в кювете инкубаторе и поддерживать клетки при 37 ° C / 5% CO ₂ в течение 24 ч , чтобы дать им возможность присоединить и восстанавливаться.
14. Осмотрите клетки на следующий день и отзывать ингибитор ROCK, если клетка-клетка был установлен контакт. Поддерживать клетки в mTeSR1 среде для рутинного культуры или переключиться на дифференциации среды по мере необходимости.
    Примечание: Если клетки были посеяны с указанной плотностью, то конфлуэнтности должно быть идеальным для планового технического обслуживания или гепатоцитов differentiatioп.

2. Дифференциация hPSCs для гепатоцитов-подобных клеток на рекомбинантных ламининами

1. Приготовьте дифференциации среды.
   1. Сделать человека маточного раствора активин A: растворить человеческое активин в порошок, чтобы сделать 100 мкг / мл исходного раствора в стерильном 0,2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) / DPBS. Сделать небольшие аликвоты и хранить их при температуре -20 ° С. Использование в масштабе 1: 1000.
   2. Сделать мышь Wnt 3a маточного раствора: растворить мыши Wnt 3a порошок, чтобы сделать 10 мкг / мл исходного раствора в стерильном 0,2% БСА / ДЗФР. Сделать небольшие аликвоты и хранить их при температуре -20 ° С. Используйте в соотношении 1: 200.
   3. Сделать фактор роста гепатоцитов человека (HGF) маточного раствора: растворить порошок HGF человека, чтобы сделать 10 мкг / мл исходного раствора в стерильном 0,2% БСА / ДЗФР. Сделать небольшие аликвоты и хранить их при температуре -20 ° С. Использование в масштабе 1: 1000.
   4. Сделать Онкостатин М (OSM) маточного раствора: растворить Онкостатин М (OSM) порошок, чтобы сделать 20 мкг / мл исходного раствора в стерильном 0,2% БСА / ДЗФР. Сделать небольшие аликвоты и Sоторвал их при -20 ° С. Использование в масштабе 1: 1000.
   5. Сделать 500 мл энтодермы нормальновсасывающим фондовой среды: 2% B27 добавки (50x, минус витамин А) и 1% пенициллина / стрептомицина (конечные концентрации при 100 МЕ / мл и 100 мкг / мл, соответственно); долить до 500 мл с помощью Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) базальной среды. Примечание: Храните запас при 4 ° С и использовать в течение двух недель. Аликвоты среды из запаса и добавить свежие (конечные концентрации в 100 нг / мл и 50 нг / мл, соответственно), активин A и Wnt-3a на каждой смены среды.
   6. Сделать 500 мл KSR / ДМСО дифференциации среды: 80% Нокаут DMEM (КО-DMEM), 20% замены Нокаут сыворотки (KSR), 0,5% GlutaMAX, 1% заменимых аминокислот (NEAA), 0,1 мМ бета-меркаптоэтанола, 1% ДМСО, и 1% пенициллина / стрептомицина (конечные концентрации при 100 МЕ / мл и 100 мкг / мл, соответственно). Фильтр под вакуумом. Хранить при температуре 4 ° С и использовать в течение двух недель.
   7. Сделать 500 мл HepatoZYME созревания среды: 1% GlutaMAX, 10 мкМ гидрокортизона 21-гемисукцинат натриевая соль (ГЦК), и 1% пенициллина / стрептомицина (конечные концентрации при 100 МЕ / мл и 100 мкг / мл, соответственно); долить до 500 мл с использованием HepatoZYME базальной среды. Примечание: Храните запас при 4 ° С и использовать в течение двух недель. Алиготе средний из запаса и добавить свежий HGF и OSM (конечные концентрации 10 нг / мл и 20 нг / мл, соответственно) для каждой смены среды.
2. Семенной hPSCs для дифференцировки гепатоцитов на LN-521, как описано в разделе 1. Если LN-521 / LN-111 следует использовать в качестве подложки, Покрывают пластинки LN-521 и LN-111 (соотношение 1: 3) при конечная концентрация ламинина 5 мкг / мл; лечение остальные должны быть такими же, как чистых пластин LN-521-покрытием.
   Примечание: LN-521 / LN-111 не является идеальным для повседневной культуры hPSCs; он используется только для дифференциации экспериментов.
3. Проверьте сотовому слитности через 24 ч после посева. Инициирование клеточную дифференцировку, как только клетка конфлуэнтности достигает около 40%. ралить использованную среду mTeSR1 и добавить свежую эндодермы грунтовки среду, дополненную 100 нг / мл активин А и 50 нг / мл Wnt 3a. Назовем это дифференциация 1-й день.
   Примечание: Настоятельно рекомендуется, чтобы инициировать дифференциацию на следующий день после посева клеток.
4. Изменение энтодермы нормальновсасывающим среды через каждые 24 ч в течение 3-х дней для человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). Что касается человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), продлить этот этап более 2 -х дней , чтобы премьер - клетки к окончательным энтодермальных-подобных клеток, но использовать энтодермы нормальновсасывающим среду , дополненную только с 100 нг / мл активин А при этих двух дней ¹² ,
   Примечание: Для обеспечения успешной спецификации энтодермы, можно исследовать экспрессию маркеров энтодермальных, таких как Foxa2 и SOX17. Согласно иммунофлуоресценции окрашивания, более 80% клеток, полученных положительны для обоих маркеров в нашей лаборатории.
5. Переключение в режим KSR / ДМСО дифференциации среды на 4-й день (для ЭСК) / сут 6 (для hiPSCs). Изменение среды дAily в течение первых 3-х дней, а затем на пятый день этой стадии дифференцировки.
   Примечание: Нет кормления не требуется на четвертый день этой стадии дифференцировки. Используйте пищевую добавку КО-DMEM, чтобы промыть клетки один раз перед сменой среды, если есть много мертвых клеток. Для того, чтобы проверить, является ли дифференциация на данном этапе успешным или нет, можно проверить экспрессию печеночных маркеров клеток-предшественников, таких как AFP, CK19 и HNF4A. Около 90% клеток будут положительными для этих маркеров, основанных на нашем опыте.
6. Через 5 дней после стадии дифференцировки KSR / ДМСО, перейти к стадии созревания HepatoZYME. Вымойте клетки один раз с обычной HepatoZYME базальной среде после удаления среды KSR / ДМСО. Добавить HepatoZYME созреванию среду, дополненную 10 нг / мл HGF и 20 нг / мл ОСМ.
7. Изменение носителя каждые 48 ч в течение 7 - 10 дней, после чего клетки готовы к стандартной характеристике или дальнейшего использования.
   Примечание: гепатоцитов экспрессии маркера обследования, метаболическийфункциональные тесты (например, цитохром Р450 активности), мочевину и альбумин испытаний секреции, испытаний хранения гликоген, и Индоцианиновая зеленый (ICG) испытаний поглощения представляют собой типичные методы определения характеристик.
   Примечание: Сроки протокола дифференцировки показана на рисунке 5. В нашей лаборатории мы регулярно проверять уровни производный HLCS 'гепатоцитов-специфической экспрессии маркера, альбумин секрецию и цитохром Р450 (CYP) 3A и 1A2 деятельность.

Гепатоцеллюлярной Дифференциация от hPSCs

Один из человеческих эмбриональных стволовых клеток линии, H9, и один человек индуцированных линии плюрипотентных стволовых клеток, 33D6, были использованы для дифференцировки гепатоцитов. Результаты на фигурах 1-3, из клеток Н9, в то время как те , на фиг.4 , являются из клеток 33D6. Отдельные клетки высевали ламининами установили межклеточного контакта через 24 ч. После того, как клетки достигали около 40% сплошности, процесс дифференциации был инициирован (Фигура 1А и Рисунок 4A). На ламининами (как LN-521 и LN-521 / LN-111), эти клетки прошли через последовательные морфологические изменения и привели к поляризации (КГ На рисунке 1 и 4А).

Гепатоцитов типа Cell Характеристика

Daу 18 КГ были собраны и оценены на экспрессию маркеров представителя гепатоцитов, HNF4A и ALB (фиг.2А). Иммуноокрашивание день 18 КГ показало , что почти 90% клеток выражали HNF4α (Фигура 2В). Эти клетки поляризованы на ламининами и проявляли многоугольной внешний вид, как отмечено на E-кадгерина и F-актин выражение (рис 2B).

Цитохрома P450 (CYP) активность была также оценена. В CYP450s проводят важную метаболическую функцию гепатоцитов. День 18 КГ, полученные на желатиновой белковой смеси, такие как Матригель, LN-521 или LN-521 / LN-111, были испытаны на CYP3A активности. Продемонстрировал значительно КГ высокую активность CYP3A на ламинина субстратов , чем на Матригель (рисунок 3). Важно отметить, что по сравнению с коммерческими первичных гепатоцитов человека (HU1339) повторно высевают на этих подложках, имеют почти КГ в 10 раз выше уровнейот CYP3A деятельности 10.

Дифференциация hiPSCs была аналогична ЭСК. Клетки выставлены последовательные изменения во внешнем виде (рис 4а). Походные выразил КГ ключевой фактор транскрипции гепатоцитов, HNF4α (рис 4В), и обладал активностью CYP3A и секретируется альбумина (рис 4C и D). Следует отметить, что полученные из КГ 33D6 отображаются в уменьшенном CYP3A по сравнению с клетками H9 , полученных КГ (рис 3), но она по - прежнему сопоставимо с первичными гепатоцитов человека 10. Тем не менее, выделение альбумина этих КГ была значительно ниже , чем в первичных гепатоцитах 10.

Рисунок 1: Последовательные Морфологические изменения во время печеночной дифференциации. </ STRONG> (А) Недифференцированная ЭСК затравку в виде отдельных клеток составил около 40% сплошности через 24 ч после посева. (B) После того, как грунт, клетки демонстрировали типичную морфологию энтодермальную на день 4. (C) При достижении hepatoblast подобный этап, они показали четкую многоугольную форму на 9 день (D) После стадии созревания, поляризованные КГ были готовы к дальнейшая характеристика показанный здесь в день 18. Шкала бар = 200 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Определение характеристик КГ. (A) Генная экспрессия маркеров гепатоцитов специфических, HNF4A (слева) и ALB (справа). Уровень экспрессии анализировали с использованием 18-й день HLCS производныхот ЭСК на обоих LN-521 и LN-521 / LN-111, и она была нормализована к гену ведение домашнего хозяйства GAPDH и выраженное относительно ЭСК. Результаты представляют три биологических повторах, и Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение (SD). * Р <0,05, ** р <0,01; непарный т-тест. (B) Белок выражение ключевого маркера печеночного, HNF4α и маркеры поляризации, E-кадгерина и F-актина. День 18 КГ на LN-521 и LN-521-111 LN окрашивали / для вышеуказанных маркеров и контрастно с Hoechst 33342. Отрицательный контроль осуществляли с помощью соответствующего иммуноглобулина G (IgG). Процент HNF4α-положительных клеток и СД показано. Это рассчитывалось из четырех случайных полей зрения. Изображения были сделаны в 20х увеличении. Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Стандартная характеристика КГ. hiPSCs, культивируемые на LN-521 были дифференцированы в КГ. Стандартные тесты определения характеристик были проведены на 17-й день HLCS. (А) Последовательная морфология клеток при печеночной дифференцировки; Моменты времени показали г epresent клетки на дни 1, 4, 9, и 17. (В) Иммунологическое выражения HNF4α. Процент положительных клеток и СД показан на основе четырех случайных полей зрения. Изображения были сделаны в 20х увеличении. Шкала бар = 100 мкм. (C) CYP3A активность в день 17 HLCS. Данные представляют собой шесть биологических повторов, а также бар ошибка представляет собой SD. (D) Альбумин секрецию производных КГ в течение 24 ч в культуре. Данные представляют собой четыре биологических повторах, а бар ошибка представляет SD. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Схема Хронология протокола дифференциацию.т = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Д-р Дэвид С. Хэй является одним из основателей и директор Stemnovate Limited.