Методическая статья

Созревание стволовых клеток человека, полученных кардиомиоцитов в Biowires Использование электрической стимуляции

DOI:

10.3791/55373

⸱

6 мая 2017 г.

 , 
1Toronto General Research Institute, University Health Network, 2Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, 3Heart & Stroke/Richard Lewar Centre of Excellence, University of Toronto, 4Laboratory of Medicine and Pathobiology, University of Toronto

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сердца biowire платформа является методом в пробирке используется для зрелых человеческих эмбриональных и индуцированных клеток , полученных кардиомиоцитов плюрипотентных стволовых (HPSC-CM) путем объединения трехмерного культивирования клеток с электрической стимуляцией. Эта рукопись представляет подробную установку сердечной biowire платформы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человека плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоциты (HPSC-КМВ) был многообещающим источником клеток и таким образом поощрять исследование их потенциальных применений в сердечной исследований, в том числе открытия новых лекарств, моделирование болезни, тканевой инженерии и регенеративной медицины. Однако, клетки, полученные существующими протоколами показывают диапазон незрелости по сравнению с носителями взрослых желудочковых кардиомиоцитов. Много усилий было сделано, чтобы созреть HPSC-КМВ, с умеренным созревании достиг до сих пор. Таким образом, разработано система, названная biowire, была разработана путем предоставления как физические и электрических сигналов , чтобы привести HPSC-CMs к более зрелому состоянию в пробирке. Система использует платформу микроизготовленной семени HPSC-CMs в коллагене типа I гелеобразованию вдоль жесткого шаблона шовного материала, чтобы собрать в выровненную ткань сердца (biowire), который подвергается воздействию электрического поля стимуляции с постепенно возрастающей частотой. По сравнению с нестимулированным управлением,стимулировал biowired кардиомиоцитов проявляют повышенную степень структурного и электрофизиологического созревания. Такие изменения зависят от скорости стимуляции. Эта рукопись подробно описывает конструкцию и создание biowires.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточная терапия является одним из наиболее перспективных и исследуемых стратегий для достижения сердца ремонта / восстановления. Это было облегчено инженерии сердечной ткани и совместной доставки биоматериалов 1, 2. Большинство доступных источников клеток, были изучены на животных моделях для их потенциально благотворное воздействие на поврежденные, больные, или престарелыми сердца 3. В частности, значительные усилия были предприняты, чтобы использовать человеческие плюрипотентные стволовые клетки (HPSC) -derived кардиомиоцитов (HPSC-CM), потенциально неограниченный источник аутологичных клеток для инженерии сердечной ткани. HPSC-МС может быть получен с использованием нескольких установленных протоколов 4, 5, 6. Однако полученные клетки обладают эмбриональными-подобными фенотипами, с диапазоном незрелых характеристик по сравнению со взрослыми желудочковых кардиомиоцитов 7, 8. Это может быть препятствием для применения HPSC-CMs в качестве моделей взрослой ткани сердца в исследовании обнаружения наркотиков и в развитии взрослых сердечных моделей заболеваний 9.

Для того, чтобы преодолеть это ограничение фенотипической незрелости, новые подходы активно исследуются в целях содействия кардиомиоцитов созреванию. Ранние исследования показали , эффективные свойства про-созревания в неонатальных кардиомиоцитов крыс с помощью циклического механического 10 или электрической стимуляции 11. Гель для уплотнения и циклическое механическое раздражение также показали , чтобы улучшить некоторые аспекты HPSC-CM созревания 12, 13, с минимальным усилением электрофизиологических и кальцием свойств обработки. Таким образом, система платформы называется «биологическая провод» (biowire) была разработана путем предоставления как структурных сигналов и электрическое поле stimulatioп для повышения созревания HPSC-МС 14. Эта система использует микроизготовленную платформу для создания выровненной сердечной ткани, которая поддается электрической стимуляция поля. Это может быть использовано для улучшения структурных и электрофизиологические зрелостей HPSC-CMs. Здесь мы описываем деталь изготовления такого biowires.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Мастер Дизайн и изготовление

Примечание: Используйте мягкую литографию для изготовления устройства. Сделать двухслойные мастер в SU-8 для полидиметилсилоксана (PDMS) под давление.

  1. Конструкция устройства с помощью проектирования и черчения программного обеспечения (рисунок 1A, слева). Draw каждый слой мастера отдельно. Печать дизайн устройства на двух фотошаблонов на 20000 точек на дюйм, что соответствует двум сло мастера 15. Установка модели устройства в качестве прозрачного и его окрестностей как темная; маски будут служить в качестве матрицы для оптического переноса шаблона устройства на SU-8 с помощью литографии (как описано других 15).
  2. Разливают около 4 мл SU-8 50 на центр 4 дюйма кремниевой пластины с. Покрыть СУ-8 50 равномерно на подложке с использованием спиной для нанесения покрытий центрифугирования при 2000 оборотах в минуту (RPM) в течение 30 сек. Выпекать пластины на 95 ° C плитке в течение 10 мин. Защита пластины к ультрафиолетовому (УФ) LiGHT при 200 мДж / см 2.
  3. Налейте около 4 мл SU-8 2050 на центр пластины и спина при 2500 оборотов в минуту в течение 30 с. Испеките на 95 ° C плитке в течение 15 мин. Охлаждают до комнатной температуры (RT).
  4. Повторите шаг 1,3 еще два раза.
  5. Накройте пластину, покрытую с первым слоем прозрачности фотошаблоном. Защиту пластины к УФ - светом при 270 мДж / см 2 , чтобы сделать первый слой. Испеките на 95 ° C плитке в течение 15 мин.
  6. Сделать второй слой SU-8 2050, повторяя шаг 1,3 раза.
  7. Выравнивание маски второго слоя к функциям на первый слой с использованием маской выравнивателя. Затем, подвергать воздействию УФ-света при 240 мДж / см2. Выпекать при температуре 95 ° С в течение 15 мин.
    Примечание: Время экспозиции определяется требуемой суммарной дозы ультрафиолета и выходной интенсивности УФ-света, измеренной в день перед использованием.
  8. Разработка пластины путем погружения его в пропиленгликоля ацетат монометилового эфира (PGMEA) и встряхивании при 200 оборотов в минуту в течение 30 мин на орбитальном шейкере.
  9. Местомастер в чашку Петри и осторожно влить PDMS смеси (основание, чтобы сшивающий в соотношении 10: 1 по массе) от центра пластины. Накройте все возможности и избежать воздушных пузырей.
  10. Тепло в печи при 70 ° С в течение 2 ч. Используйте острое лезвие , чтобы отрезать вокруг края шаблона biowire PDMS (рис 1А, справа). Пил PDMS от мастера. Обрежьте устройство с лезвием. Поместите шаблон biowire PDMS в стерилизации мешок и паровой автоклав при температуре 121 ° С в течение 20 мин.
  11. В биозащите (BSC), поместите PDMS biowire шаблона в чашку Петри. Используйте пинцет , чтобы удерживать и смонтировать кусок стерильной хирургической шелковой нити (6-0) в центре канала микролунки PDMS путем сидения его в пазах на обоих концах канала (рис 1B-I).

2. Создание электростимуляции палаты

  1. Сделать пару прямоугольных деталей из поликарбоната (длина х ширина х толщина: 2 см х0,85 см х 0,35 см) и используют их в качестве рамки электрической стимуляции камеры (рисунок 2).
  2. Пробурить две 3 мм шириной отверстия 2 см друг от друга вдоль центральной линии каждого кадра из поликарбоната кусок.
  3. Вырезать два куска 1,5 см длиной углеродных стержней. Дрель мм шириной отверстия 1 через угольный стержень около 3 мм от конца. Автор платиновой проволоки через отверстие стержня углерода и затянуть проволоку, окружив его вокруг угольного стержня. Присоединить зажим к другому концу платиновой проволоки для последующего соединения с электрическим стимулятором.
  4. Вставьте углеродных стержней в поликарбонат рамы штук. Поместите собранный каркас с углеродными стержней в лунку шесть-луночного планшета.
  5. Налейте 2 мл PDMS в скважину. Погрузите в нижней части поликарбоната кадров в PDMS, сохраняя при этом уровне поверхности PDMS вблизи, но не доходит до нижней части углеродных стержней. Тепло в печи при 70 ° С в течение 2 ч.
  6. Возьмите электрическую стимуляцию камеры из шести-на пластина и поместить его в сумке стерилизации для стерилизации паром при 121 ° С в течение 20 мин.

3. Ферментативная диссоциация HPSC-CMs

  1. Индуцируют HPSC дифференцироваться в кардиомиоциты с использованием установленного протокола 4.
    Примечание: Если коротко, то генерируют кардиомиоцит через установленный эмбриоидном тела (EB) протоколы в стволовых про среды через последовательный добавок с костными морфогенетическим белком 4, основным фактором роста фибробластов, активин А, фактором роста эндотелия сосудов, и Dickkopf гомологом-4. Использование ЭТ со дня 20-34 дифференциации сделать biowires.
  2. Сбор ЭТ от низкой пластины крепления с P1,000 наконечником пипетки и переносят в коническую пробирку. Гранул путем центрифугирования в течение 5 мин при 125 мкг и РТ. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок с предварительно нагревают, 37 ° C Тип коллагеназы I, содержащего 1% дезоксирибонуклеазы I (ДНКазы I). Инкубируют при 37 ° С в течение 2 чдля пищеварения.
  3. Добавьте 5 мл подогретого, 37 ° C мыть среду и центрифуги в течение 5 мин при 125 мкг и РТ. Жидкость над осадком сливают. Ресуспендируют осадок с 2 мл раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты трипсин / (ЭДТА) и инкубируют при 37 ° С в течение 5 мин.
  4. Добавить 1 мл стоп-среды, содержащей 3% (об / об) ДНКазы I.
  5. Приложить 20 г (0,9 мм) иглу в 5 мл шприца и передать суспензии EB через него в 3-5 раз.
  6. Добавить 7 мл промывочного раствора и центрифугируют при 280 х г в течение 5 мин. Жидкость над осадком сливают. Ресуспендирует осадок в Исках, модифицированного Дульбекко среды (IMDM) и хранить на льде. Определить количество клеток с помощью гемоцитометра. Взять 0,5 × 10 6 клеток и осадок центрифугированием при 280 х г в течение 5 мин. Удалить супернатант.
  7. Предварительное охлаждение всех компоненты геля на льде перед смешиванием их в стерильной пробирке. Смешайте следующие компоненты геля коллагена (конечная концентрация): 2,1 мг / мл крысиного хвоста типа коллагена I, 24,9 мМ глюкозы, 23,8 мМ NaHСО 3, 14,3 мМ NaOH, 10 мМ HEPES и 10% внеклеточный матрикс в 1x среде M199. Добавьте коллагена и межклеточного матрикса последнего. Смешать с помощью пипетки вверх и вниз.
  8. Ресуспендирует 0,5 × 10 6 клеток с 3,5 мкл коллагеном геля и хорошо перемешать.
  9. Используйте P10 наконечник пипетки , чтобы добавить 4 мкл клеточной суспензии в 0,5 см длиной канала (рис 1B-II). Отрегулируйте положение шва стерильным пинцетом в случае необходимости.
  10. Обложка дна чашки Петри стерильным фосфатно-буферный солевой раствор (PBS), убедившись в том, чтобы не задеть гель. Инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин.
  11. Заменить PBS с 12 мл культуральной среды (например, стволовые про или среда , рекомендованные производителем клеток), достаточно , чтобы покрыть клетки (рис 1B-III). Культура в термостате при 37 ° С в течение 1 недели. Изменение среды каждый день.

4. Электрическая стимуляция для Biowire Выращивание

  1. ВКБС, добавляют 2 мл PBS в каждую лунку шесть-луночного планшета, который будет размещен электрический стимулятор камеру. Используйте стерильный пинцет, чтобы аккуратно разместить автоклавное устройство электрической стимуляции в скважину. Выбросьте PBS из скважины.
  2. Покрытие углеродных стержней с 5 мл подогретой культуральной среды. Используйте стерильный пинцет , чтобы смонтировать biowires в электрической стимуляции камере и ориентировать их перпендикулярны углеродные стержни (рисунок 2).
  3. Поместите крышку на верхней части шесть-луночного планшета, но оставить достаточное количество провода платины идущие вне пластины для соединения с электрическим стимулятором. Поместите шесть-луночный планшет в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 ° C и подключить платиновую проволоку к электрическому стимулятору.
  4. Стимулируйте biowires с помощью электрического стимулятора со следующей установкой: двухфазный повторения импульсов, длительность импульса 1 мс, 3 В / см, и 1 импульс в секунду (PPS). Повысить ППС каждые 24 ч до следующих значений: 1,83, 2,66, 3,49, 40,82, 5,15 и 6. Изменение среды каждый день.
  5. Обратите внимание на сократимость кардиомиоцитов в ответ на электрическую стимуляцию под микроскопом при 10-кратном увеличении.
    Примечание: После того, как одна неделя стимуляции biowires становится зрелой (смотрите раздел результатов).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рациональное для использования шовного материала в biowires, чтобы служить в качестве шаблона для формирования 3D-конструкций, которые выравнивают на одной оси, и имитируют форму сердечных волокон. Показано , что после семи дней культивирования в biowire, клетка перестроенного гель вокруг шовного (фиг.3А). Клетки , собранные вдоль оси шовного материала для образования выровнена сердечная ткань (рисунок 3). После 7 дней предкультуры, то biowires были подв...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта рукопись описывает установку и внедрение спроектированной платформы, biowire, чтобы улучшить созревание HPSC-CMs. Устройство может быть выполнено в стандартных объектах микрообработки, и biowires может быть получен с обычными методами клеточной культуры и электрическим стимулятором.

Насколько нам известно, не существует сообщил метод похож на biowires. Эта стратегия показывает, что улучшенные свойства созревания зависят от электрической схемы стимуляции, о чем свидетельствует более высок...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом-в-помощь от сердца и инсульта Фонда Канады (G-14-0006265), операционные гранты от Канадского института исследований в области здравоохранения (137352 и 143066) и грантом фонда Джп Бикелл (1013821 ) к ССН.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
L-аскорбиновая кислотаSigmaA-4544hPSC-CM компонент питательных сред
AutoCADAutodesk, IncПрограммное обеспечение для проектирования устройства
Углеродные стержни, & Oslash; 3 ммКомпонент камеры электростимулятора
Коллаген, тип 1, крысиный хвостBD Biosciences354249Коллагеновый гель: 2,1 мг/мл коллагена типа I типа крысиного хвоста в 24,9 мМ глюкозы, 23,8 мМ NaHCO3, 14,3 мМ NaOH, 10 мМ HEPES, в 1x M199 средах с 10 % уменьшенным фактором роста Matrigel.
Коллагеназа типа I SigmaC01300,2% коллагеназы I типа (w/v) и 20% FBS (v/v) в PBS с Ca2+ и Mg2+. Стерилизовать с помощью 0,22 мкм; м процеживаем и делаем 12 мл аликвот. Хранить при температуре -20 °C.
Дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I)EMD Millipore260913-25MUСделайте 1 мг/мл раствора ДНКазы I в воде. Процедите стерильно и храните 0,5 мл аликвот при &минус; 20 ° C
Сверла и сверла (Ø 1 мм и 2 мм)DremelСверление отверстий в поликарбонатных рамах
ЭлектростимуляторGrasss88x
Фетальная бычья сыворотка (FBS)WISENT Inc.080-450
Д-(+)-глюкоза SigmaG5767Коллагеновый гель
компонент L-глютаминThermo Fisher Scientific25030081
H2OMilliQ18.2 MΩ · см при 25 °°; C, ультрачистый, для изготовления всех растворов
HEPESSigmaH4034Коллагеновый гель компонент
Горячая пластинаTorrey PinesHS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Thermo Fisher Scientific12440053
Маскавыравниватель EVG EVG 620
Matrigel, сниженный фактор роста Corning354230Коллагеновый гель компонент
Среда 199 (M199)Thermo Fisher Scientific11825015Коллагеновый гель компонент
Монотиоглицерин (MTG)SigmaM-6145hPSC-CM компонент питательных сред
Орбитальный шейкерVWR89032-088
Пенициллин/стрептомицин (P/S)Thermo Fisher Scientific15070063
Фосфатно-солевой буфер (PBS) с Ca2+ и Mg2+ Thermo Fisher Scientific14040133
Plate (6-луночный)Corning353046
Plate (6-луночный), низкое креплениеCorning3471
Платиновые провода, 0,2 ммКомпонент камеры электростимулятора
Полидиметилсилоксан (PDMS)Dow CorningSylgard 184
Монометиловый эфир пропиленгликоля ацетат (PGMEA)Doe & Ингаллс Инк.Для разработки вафельного
пакета отклеиваютсяконверторы92308Для стерилизации
паром силиконовые пластины, 4 дюймаUniversityWafer Inc.
Бикарбонат натрия (NaHCO3)SigmaS5761Коллагеновый гель
Гидроксид натрияSigmaS8045Коллагеновый
гель Sprin coaterСпециальные системы покрытийG3P-8
StemPro-34 питательная средаThermo Fisher Scientific10639011Питательная среда hPSC-CM. Чтобы сделать 50 мл, добавьте 1,3 мл добавки, 500 мкм; L в 100 раз; L-глютамин, 250 μ Л 30 мг/мл трансферрина, 500 мкм; л 5 мг/мл аскорбиновой кислоты, 150 гкм; L из 26 μ л /2 мл монотиоглицерина (MTG) и 500 μ L (1 %) пенициллин/стрептомицин.
Фильтрующий материалПромывочная среда:FBS (1:1)
SU-8 50 Корпорация «МикроХимфоторезист, главный компонент
СУ-8 2050 Корпорация «МикроХимфоторезист, мастер-компонент
ТрансферринРош10-652-202hPSC-CM питательная среда
Трипсин/ЭДТА, 0,25%Thermo Fisher Scientific25200056hPSC-CM питательная
среда Промывочная средаIMDM, содержащая 1% пенициллин/стрептомицин
»»

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005(2015).
  2. Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).
  3. Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84 (0), 85-106 (2015).
  4. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).
  5. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  6. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  7. Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).
  8. Dolnikov, K., et al. Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction. Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).
  9. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
  10. Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).
  11. Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).
  12. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397(2011).
  13. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).
  14. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  15. Lake, M., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
  16. Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).
  17. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
  18. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
  19. Radisic, M., et al. Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue. Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).
  20. Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BiowirehPSC CMI

Похожие статьи